Содержание к диссертации
Введение
1. Трансляционные гтфазы 6
Общие свойства ГТФаз 6
Структурные элементы рибосомы, участвующие в регуляции активности трансляционных ГТФаз 9
ГТФазы трансляционного аппарата прокариот 12
Инициация 12
Элонгация и транслокация 14
Терминация 21
2. Результаты и их обсуждение 24
Исследование механизма действия элонгационного фактора EF-G в транслокации 24
Исследование транслокации методом токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке 24
Сравнительный анализ пре-, посттранслокациомного и промежуточного состояний рибосомы 28
Исследование обратимости образования в переходного состоянияпри связывании EF-G'GDPNP с претранслокационным комплексом 32
Исследование аффинности деацилиро ванных тРНК к Е-у частку рибосомы 35
Анализ чистоты используемых в лабораторной практикенуклеотидов: роль примесей результатах измерений 37
Рибосома -GEF для EF-G? 38
Обсуждение результатов 1 41
Исследование механизма действия трансляционных факторов EF-G и RRF в рибосомного рециклинга 48
Исследование роли дисоциации тРНК с посттерминационногокомплекса в механизме реинициации 49
Роль контактов между 16S рРНК и последовательностью Шайн-Дальгарнопри реинициации трансляции 53
Теримнацинные факторы не транслоцируют связанную в Р-участке посттерм инацио иного комплекса мРНК 56
РольЯЯР и EF-G в диссоциации деацилированой тРНК с рибосомы 59
RRF стимулирует связывание EF-G GDPNP с 50S и понижает с 70S 62
Диссоциация 70S на субъединицы под действием RRF и EF-G 64
Обсуждение полученных результатов II 66
3. Материалы и методы 73
Использовамные препараты и компоненты системы для белкового синтеза in vitro 73
Использованные методы 74
Препаративное выделение рибосом с использованием зонального ротора Ті 15 75
Очистка нуклеотидов: GDP, GDP и GDPNP 80
Экспрессия и очистка EF-G 80
Экспрессия и очистка нативпого EF-Tu 81
Экспрессия и очистка IF2 82
Экспрессия и очистка тРНК1Ым 84
Метод токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке 85
Исследование диссоциации [вР]тРНКМеІ с претранслокациошюго комплекса 86
Исследование диссоциации [ Н] fMet-[ С]Пе из рибосомного комплекса под действием пуромицина 87
Исследование связывания GTP, GDP и GDPNP с EF-G 87
Исследование связывания тРНК с рибосомным Е-участком 87
Ультрацентрифугирование рибосомных комплексов в сахарозных градиентах 88
Выводы 89
- Структурные элементы рибосомы, участвующие в регуляции активности трансляционных ГТФаз
- Исследование транслокации методом токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке
- Роль контактов между 16S рРНК и последовательностью Шайн-Дальгарнопри реинициации трансляции
- Экспрессия и очистка EF-G
Введение к работе
Рибосома - молекулярная машина, синтезирующая белки согласно информации об их первичной структуре, заложенной в нуклеотидной последовательности мРНК [1]. В процессе синтеза белка, который с химической точки зрения представляет собой полимеризацию аминокислот в полипептидную цепочку, принимают участие кроме рибосомы дополнительные молекулы. Во-первых, РНК, выполняющие следующие функции: а) кодирования аминокислотной последовательности будущего белка (мРНК), б) адаптера, приносящего в химически активированной форме аминокислоты и устанавливающего взаимнооднозначное соответствие трехбуквенному коду азотистых оснований код аминокислотной последовательности (тРНК), в) регуляторпые функции (тмРНК, малые РНК). Во-вторых, важную роль в биосинтезе белка играют малые молекулы, такие как нуклеотиды АТР и GTP, аминокислоты, различные ионы. В-третьих, в процессе трансляции принимают участие белковые молекулы: аминоацил-тРНК-синтетазы, трансляционные факторы, а также многочисленные вспомогательные белки трансляционного аппарата, выполняющие различные регуляторные функции.
Часть трансляционных факторов обладает ГТФазной активностью (см. ревыо [2, 3]). Гидролиз GTP этими белками происходит на определенных стадиях белкового синтеза, и напрямую сопряжен со связыванием факторов с рибосомой, находящейся в определенном функциональном состоянии. В клетке Е. соН к ним относятся: IF2, инициаторный фактор, приносящий на рибосому инициаторную fMet-TPHKtNto [4], элошационные факторы EF-G и EF-Tu, ответственные за транслокацию и связывание новой тРНК в А-участке рибосомы соответственно [5-8], а также герминационный фактор RF3, функция которого заключается в освобождении другого терминационного фактора, RF1 или RF2 с постгерминациоипого рибосомного комплекса [5-9]. Таким образом, ГТФазы принимают участие во всех этапах белкового синтеза. В связи с этим невозможно переоценить значение понимания общих закономерностей, присущих ГТФазам, для понимания механизма трансляции в целом.
Исследование механизма действия конкретных ГТФаз позволяет найти общие черты, присущие этим белкам, что в свою очередь служит базой для исследования механизма действия менее изученных представителей семейства. В этом смысле весьма полезно исследование хорошо разработанной in vitro системы трансляции Е. coli с последующим использованием полученного знания при исследовании значительно более сложного эукариотичсского трансляционного аппарата (эта часть исследований не вошла в представляемую диссертацию).
В данной работе исследовали механизм действия элонгационного фактора Е. coli EF-G, участвующего в процессе транслокации, а также в процессе рибосомного рециклинга (ribosomal recycling) - процесса, состоящего в том, чтобы подготовить поеттерминационную рибосому к новому раунду синтеза белка. Кроме исследования механизмов действия EF-G были исследованы сопредельные проблемы механизмов трансляции.
Структурные элементы рибосомы, участвующие в регуляции активности трансляционных ГТФаз
Бактериальная рибосома (70S) состоит из двух неравных субъединиц, малой и большой. Малая субъединица (30S) состоит из 16S рРНК и около 20 белков, большая содержит 23S и 5S рРНК, а также более 30 белков [25, 26]. Большая субъединица ответственна за образование пептидной связи, малая же участвует в перекодировке первичной последовательности РНК в аминокислотную посредством кодон-антико до нового распознавания между MPFIK И ТРНК. Основные структурные элементы малой и большой субъединиц представлены на рис. 2.
В малой субъединице выделяют такие элементы, как плечо, платформа, голова. Строение большой субъеднницы описывают в терминах «центральный протуберанец», «L7/L12 протуберанец», «LI протуберанец». На обеих субъединицах есть участки, ответственные за связывание тРНК, три на большой (А, Р и Е) и два на малой (А и Р) (рис. 3). В процессе трансляции тРНК последовательно перемещается из А в Р, Р в Е и далее из Е диссоциирует в цитоплазму. На всех этапах биосинтеза белка - инициации, элонгации, транслокации, терминации и рециклинга - рибосома взаимодействует с различным трансляционными ГТФазами. Это взаимодействие в значительной степени унифицировано, т.е. факторы связываются в практически одном и том же участке рибосомы. G-домены трансляционных ГТФаз взаимодействуют с участком 23S рРНК, известным как сарцин-рициновая петля [27-30] и находящимся в непосредственной к ней близости выступающим протуберанцем L7/L12 (рис. 2) [31-35]. Последний состоит из рибосомного белка L11, участка 23S, связывающего белки L11 и L10 (нуклсотиды 1030-1124 в Е. coli), а также белкового комплекса, состоящего из L10 и нескольких копий L7/L12. Методом экстракции/комплементации показана необходимость L12 для связывания с рибосомой и активации гидролиза GTP для всех трансляционных ГТФаз (EFu, EF-G, IF2 и RF3) [36]. Кроме унификации участков связывания в значительной степени сходен механизм регуляции ГТФазной активности различных факторов. Структурным элементом рибосомы, активирующим гидролиз GTP всех трансляционных ГТФаз является рибосомный белок L12, обладающий активностью GAP как в комплексе с рибосомой, так и в чистом виде. Кроме того, что активация ГТФазной активности вызывается одним и тем же белком, сходные правила регулируют GAP активность рибосомы. Как было показано в работе [22], ГТФазная активность связанных с рибосомой факторов зависит от присутствия, либо отсутствия пептида на находящейся в Р-участке тРНК. В случае EF-G и RF3 гидролиз GTP ингибирустся как формил-метионильной группой инициаторной тРНК, так и полипептидпой цепочкой растущего белка.
В случае IF2 формил-метионильная группа не оказывает ингибирующего эффекта, что логично, поскольку естественным субстратом для этого фактора является инициаторный комплекс, содержащий в Р-участкс fMet-тРНК еЕ. Механизм регуляции рибосомного GAP посредством пептида основан на том, что существуют две альтернативные конфирмации рибосомы, «релаксированная» и «закрученная», и эти информации стабилизируются в различных комплексах [22, 37-42]. «Релаксированная» информация стабилизируется пептидил-тРНК в Р-участке, деацилированной тРНК в Е-участке, а также связыванием факторов RF1 или RF2. «Закрученная» форма стабилизируется пептидил-тРНК в А-участке, деацилированной тРНК в Р-участке, связыванием RRF. EF-G GTP и RF3-GTP. Структурной основой для подобной связи между присоединением различных лигапдов (тРНК и трансляционных факторов) к рибосоме и изменениям в относительной ориентации субъединиц является изменение межсубъединичных контактов [34; 40, 43]. Кроме активации гидролиза связанного GTP рибосома также обладает активностью GEF, индуцируя обмен нуклеотида на RF3, EF-G и IF2. Структурные элементы рибосомы, индуцирующие обмен нуклеотида, связанного с трансляционными ГТФазами ещё не определены. В случае IF2 активностью GEF обладает 30S, несущая в Р-участке ншшаторную тРНК, причем активность не зависит от ацилированности тРІ-IK (А. Завьялов и М.Эренберг, личное сообщение). В случае RF3 и EF-G обмен нуклеотида стимулирует взаимодействие факторов с пострерминационным и претранслокационным рибосомным комплексами, соответственно. Более детальное определение элементов рибосомы, выступающих в роли GEF, является важной задачей, требующей использования биохимических, структурных и генетических методов. ГТФазы трансляционного аппарата прокариот Инициация Первым этапом биосинтеза полипептида является образование преинициаторпого комплекса, состоящего из 30S субъединицы, мРНК и комплекса из IF2, GTP и ииициаторной fMet-тРНК d [44] (рис. 3). Связывание мРНК происходит независимо от инициаторных факторов [45, 46] и направляется контактами между участком мРНК называемым последовательность Шайн-Дальгарно и 16S рРНК [47], а также часто с использованием AU-богатых трансляционных энхансеров, действующих через рибосомный белок S1 [48-52]. На последующих этапах инициации принимают участие ещё два фактора, IF1 и IF3. Эти факторы выполняют несколько функций. Во-первых, они поддерживаю! в клетке необходимое количество свободных 30S субъединиц. Эта задача выполняется ими за счет антиассоциационной активности IF3, предотвращающего связывание свободных 30S с 50S и диссационной активности 1F1, способного разрушать 70S комплекс с образованием свободных субъединиц [53].
Вторая функция этих факторов - стабилизация и ускорение связывания с 30S субъединицей комплекса ГМеі-тРНКШеЧГ-2 СТР [4, 54]. Кроме того, показано, что IF3 обладает способностью распознавать антикодоновый стебель ииициаторной тРНК, таким образом участвуя в повышении точности инициации, препятствуя инициации с участием элонгационной тРНК [55]. 1F1 тоже участвует в отборе правильной тРНК для инициации [56, 57]. На следующем этапе инициации к 30S, несущей на себе тРНК, мРНК, и иницаторные факторы присоединяется 50S с образованием 70S комплекса, 1F2 гидролизует GTP и покидает1 рибосому. Ответ на вопрос на каком этапе покидают рибосому IF1 и TF3 - до присоединения 50S или после - по-прежнему остается не до конца ясным. Flo данным криоэлсктронной микроскопии, в инициатор ном 70S комплексе, приготовленном в присутствии с негидролизуемого GTP-аналога GDPNP находятся всё три инициаторных фактора [58]. Однако эти данные ещё не подтверждены биохимическими методами. Связанный с IF2 GTP выполняет по крайней мере две функции [54]. Во-первых, GTP-связанная форма фактора необходима для быстрой ассоциации 30S и 50S в 70S. Для этого необходима GTP-форма IF2 как таковая, гидролиз нуклеозидтрифосфата не необходим - негидролизуемый аналог GTP, GDPNP, успешно заменяет GTP в этом процессе. Во-вторых, показано, что гидролиз GTP необходим для быстрого образования первой пептидной связи, причем ни GDP, ни GDPNP не могут справиться с этой задачей. На основании этого наблюдения, а также опытов, показывающих, что GDPNP-связанная форма IF2 обладает высокой степенью сродства к пост-инициаторному комплексу, в работе [54] предположили, что гидролиз GTP на IF2 необходим для быстрого высвобождения IF2. Если описывать механизм действия ГТФазы IF2 в терминах GAP и GEF, то, по всей видимости, качестве обоих выступает рибосома в различных функциональных состояниях. В свободном состоянии в цитозоле IF2 обладает низким сродством к GTP и находится преимущественно в GDP-связанной форме (KD(GTP) = 9 цМ, А. Завьялов и М. Эренберг, личное сообщение). Связавшись с рибосомой, фактор приобретает сродство к GTP, обменивает нуклеозид с GDP на GTP, далее происходит индуцированный рибосомой гидролиз GTP, после чего белок в GDP-связанной форме покидает рибосому. Детальная характеризация афинностей IF2 к нуклеотидам необходима для прояснения вопроса.
Исследование транслокации методом токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке
Механизм трапслокации был предметом интереса исследователей на протяжении последних двух десятилетий, однако до сих пор нет единого мнения касательно его деталей. Так, в литературе существуют различные точки зрения касательно роли гидролиза GTP, последовательности событий в акте транслокации, значения констант аффинности EF-G к GDP и GTP были измерены с недостаточной точностью 195]. Важным пробелом в знании о механизме действия фактора является отсутствие установленного GEF для этой ГТФазы. Более того, согласно распространённой точке зрения обмен нуклеотида происходит спонтанно. В нашем исследовании мы попытались внести ясность в эти вопросы и сформулировали альтернативную модель механизма транслокации. В ходе исследования разработан специальный метод, основанный на феномене токсин-зависимого расщепления мРНК в рибосомном А-участке [96], позволяющий следить за перемещением мРНК в процессе транслокации, а также наблюдать присоединение комплекса EF-G-GDPNP к А-участку рибосомы. Важным моментом в проводимой работе стало использование нуклеотидов, прошедших дополнительную очистку (см. раздел материалы и методы), поскольку, как показала хроматография коммерческих препаратов GDP, нуклсотид содержит приблизительно 2% примеси GTP. Исследование транслокации методом токсин-зависимого разрезания мРНК в рибосомном А-участке Основываясь на недавнем открытии [96J, пролившем свет на механизм действия бактериального токсина RelE, который специфически разрезает мРНК в рибосомном А-участке, мы разработали метод, позволяющий наблюдать движение ыРНК через рибосому и использовали его для исследования механизма транслокации. В качестве модельной системы использовали рибосомные инициаторные комплексы, несущие fMct-rPHKtMet в Р-участке. Для приготовления комплексов очищенные 70S рибосомы иницировали в присутствии инициаторных факторов IF1, IF2 и IF3, fMetPHKWet и [j3P] мРПК с открытой рамкой считывания, кодирующей дипептид МІ, после которой помещен стоп-сигнал UAA. Добавление к инициаторному комплексу белка RelE, представляющего собой токсин Е. coli, приводило к разрезанию мРНК в А-участке в изолейциновом кодоне AUU между уридиновыми основаниями (в дальнейшем место разрезания мРНК будет отмечаться звездочкой - AU U) (рис. 9А, вторая дорожка).
Использованный токсин обладает высокой субстратной специфичностью и разрезает мРНК в комплексе с рибосомой (или с её малой субъединицей), причем гидролиз происходит только в А-участке рибосомы. Свободная мРНК не подвергается воздействию токсина даже при высоких концентрациях RelE и длительных временах инкубации. Добавление к инициаторному комплексу EFu-GTP в комплексе с аминоацилированнои изолейциновой Ile-тРЕІК е с высоким выходом приводило к образованию претранслокационного комплекса. В связи с тем, что в претранслокационном комплексе А-участок занят іМеІ-І1е-тРНКТІе, разрезание мРНК токсином не происходило (рис. 9А, третья дорожка). Наблюдающаяся минорная полоса связана, по всей видимости, с частичной диссоциацией тРНК из А-участка. Добавление EF-G GTP к прстранслокационному комплексу приводило к транслокации пМеї-ІІе-тРНК11 из А-участка в Р-участок, в результате чего стоп-кодон UAA появлялся в А-участке поеттранслокационного комплекса (рис. 9А, четвертая дорожка). Разрезание стоп-кодона UA A происходило между остатками адеиина. Для исследования влияния гуаниновых нуклеотидов на транслокацию претранслокационные комплексы были очищены от нуклеотидов и факторов методом гельфильтрации [22]. На рис. 9В показана кинетика разрезания мРНК в А-участке претранслокационного комплекса токсином в присутствии EF-G и GTP или GDPNP. В этом опыте токсин либо присутствовал в реакционной смеси в течение всего времени инкубации (что обозначалось GDPNP1), либо добавлялся к смеси в определенные моменты времени и после 5 минут инкубации реакция останавливалась добавлением раствора, содержащего 1,25 % SDS и 0,25 М ЭДТА рН 8,4 (в случае дорожек GTP, GDP, GDPNP2). В случае GTP наблюдали полную транслокацию мРНК, приводящая к образованию поеттранслокационного комплекса, подвергающегося разрезанию RelE в кодоне UA A (рис. 9В, GTP). В противоположность GTP в случае GDP транслокация не происходила вовсе (рис. 9В, GDP), В присутствии негидролизуемого аналога GDPNP наблюдали медленное увеличение накопление продукта разрезания мРНК в А-участке поеттранслокационного комплекса в том случае если токсин присутствовал в течение всего времени инкубации, см. рис 9В, GDPNP1. Если же негидролизуемый аналог добавляли в определенные моменты времени и далее инкубировали 5 минут, наблюдали лишь 11% разрезания, что говорит о том, что EF-G GDPNP находится в прочном комплексе с рибосомой в течение ксего времени инкубации, защищая мРНК в А-участке от разрезания токсином. Однако гот факт, что в течение 5 минут инкубации все же происходит 11% разрезание, а при инкубации в течение всего времени разрез в А-участке постепенно накапливается (рис. 9В, GDPNP1), свидетельствует о том, что иногда EF-G-GDPNP всё-таки диссоциирует с рибосомы и в этот момент токсин может присоединиться и разрезать мРНК. Так как в работе [221 показано, что EF-G-GDPNP обладает довольно низкой аффинностью к поеттранслокационной рибосоме, то состояние рибосомы, с которой EF-G-GDPNP прочно связан в наших опытах должно отличаться от поеггранслокационпого. Было выдвинуто предположение, что это состояние представляет собой промежуточный этап между пре- и поеттранслокационными состояниями рибосомы.
В связи с этим были проведены опыты с целью охарактеризовать это промежуточное состояние (в дальнейшем для его обозначения мы будем использовать этот термин) и найти его отличия и сходства с поеттрансокационным состоянием. В первой серии опытов с целью сравнительного анализа постгерм инационно го и промежуточного состояний мы исследовали процесс обмена деацилироваш-юй [J Т]тРНКШсї, изначально связанной с Р-участком претранслокационной рибосомы (схематическое изображение претрамслокационного комплекса (рис. 9D), со свободной не меченой радиоактивно тРНК d (комплиментарной находящемуся в Р-участке претранслокационной рибосомы кодону мРНК) и тРНК с (не комплиментарной). тРНК добавляли к претрапелокациошюму комплексу, преинкубированному с EF-G и GTP/GDP/GDPNP, после чего обмен радиоактивно меченной тРНК на немеченую наблюдался путем фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры: связанная с комплексом тРНК задерживалась на фильтре, находящаяся в растворе проходила сквозь. В случае преинкубации с EF-G и GDP обмена тРНК не наблюдали ни в одном из случаев: ни при добавлении тРНК Ме1, ни при добавлении тРНКПс (рис. 10А}. Это наблюдение свидетельствует о том, что [33Р]тРНКМй оставалась в Р-участке рибосомы, прочно связанная с комплексом. В случае добавления EF-G и GTP наблюдался быстрый обмен тРНК, причем обмен происходил кодон-независимо. Подобные результаты могут быть объяснены тем, что при участии GTP происходит быстрая транслокация ["PJTPHK0 " В Е-участок рибосомы, іде та кодон-независимо обменивается с незаряженной внешней тРНК. Кодон-зависимость связывания тРНК в Е-участке предполагается некоторыми группами [97-102], однако в нашем случае, так как конкурирующая тРНК присутствовала в значительном избытке, кодон Е-сайт связанной тРНК в любом случае не играл роли. Наиболее интересным был результат опыта с добавлением EF-G и GDPNP, т.е. случай образования промежуточного комплекса. В этом случае [ЗІР]тРНК Мс могла быть сравнительно медленно замещена на «холодную» тРНКМе1, однако не на тРНКр,1е. Таким образом, в комплексе с EF-G GDPNP [33Р]тРНКШе1 продолжает сохранять сильное кодон-анти ко доно вое взаимодействие с мРНК, но приобретает возможность обмена с внешней тРНК, т.е. обладает свойствами, отличными от таковых классических Е- и Р-участок связанных тРНК. Во второй серии опытов (рис. 10В) смесь, содержащая претранслокациоиые комплексы, EF-G, нуклеотид и растущие концентрации «холодной» тРНК-конкурента инкубировали при 37 С до достижения системой состояния равновесия, после чего долю оставшейся в рибосомном комплексе [з:5Р]тРНКШй определяли стандартной техникой фильтрования.
Роль контактов между 16S рРНК и последовательностью Шайн-Дальгарнопри реинициации трансляции
Разница в стабильности находящейся в Р-участке деацилированной тРНК в случае комплексов postTC(MFTI) и postTC(MFTMI) может быть объяснена меньшим расстоянием от кодона в Р-участке до последовательности Шайн-Дальгарно (SD) в первом (рис. 17F). Для проверки этого предположения проведен опыт по исследованию способности комплексов, простраслировавших тера-, пента- и гексапептиды реинициировать в присутствии анти-SD ДНК олигонуклеотида. Как показано на рис. 18А, postTC(MFTl) и postTC(MFTMI) обладали способностью реинициировать на той же мРНК в присутствии анти-SD ДНК, что последовательность Шайп-Дальгарно мРНК не блокирована ДНК-РНК дуплексом. В случае же postTC(MTMFMl) реиницнацня была полностью подавлена при добавлении анти- SD (рис. 18С). Объяснением этого феномена является то, что мРНК после разрыва контактов с 16S рРНК образовала дуплекс aHTH-SD:SD и рибосома больше не могла возвратиться в инициаторный комплекс после разрезания кодона в Р-участке токсином и диссоциации тРНК1с. Анализируя результаты этих опытов, можно предположить следующее. Во-первых, стабильность тРНК в Р-участке падает с увеличением расстояния от кодона в Р-участке до последовательности Шайн-Далыарно, причем после синтеза гексапептида эта аффинность становится очень низкой. Во-вторых, контакт между 16S рРНК и последовательностью Шайн-Дальгарно мРНК сохраняется при синтезе коротких пептидов, что приводиг к способности рибосомы эффективно реинициировать на одной и той же мРНК. Схематически взаимодействия между тРНК, мРПК и 16S рРНК в рибосомных комплексах poslTC(MFTI), poslTC(MFTM() и postTC(MTMFTI) представлены на рис. 19. В недавней публикации [94] представлена реконструкция структуры RF3GDPNP, связанного с postTC(MFTI), полученная методом криоэлектронной микроскопии. Согласно предложенной в статье модели, RF3GDPNP вызывает транслокацию связанной в Р-участке тРНК в Е-участок. Если подобный акт траснлокации действительно имеет место быть, то мРНК должна быть транслоцирована под действием RF3, GTP или RF3, GTP и RF1/2, и, кроме того, в присутствии этих факторов должна значительно ускоряться реинициация, поскольку транслоцированная в Е-участок тРНК должна значительно быстрее диссоциировать с рибосомы. Для проверки этого предположения были проведены опыты с использованием токсин-зависимого разрезания мРПК.
В первом опыте отслеживалась скорость реинициации в случае комплексов postTC(MFTl) после отщепления пептида в присутствии либо отсутствии RF3 и GTP. Как показано на рис. 20Л, добавление терминационного фактора RF3 с GTP не повлияло на скорость реинициации, что противоречит предложенной в [94] модели, согласно которой в этом случае должна была наблюдаться транслокация, приводящая к быстрой диссоциации тРНК и последующей реинициации. Во втором опыте терминациоппый комплекс, кодирующий MFT1 (далее - TC(MFTI) либо postTC(MFTI)) инкубировали с RF3, GTP а так же либо с RFl(wt) либо с мутантиым RFl(GAQ) [23], не способным к отщеплению пептида, но способным связываться с терминационным комплексом. После преинкубации при 37 С добавлялся на RelE на 3 минуты, после чего образцы анализировали на геле (рис. 20В). В отсутствии терминационных комплексов мРНК разрезалась либо в UA G TC(MFTI) (первая дорожка) либо в UA G и AC G postTC (вторая дорожка), что воспроизводит результат, приведенный на рис. 17А. При добавлении RFI(wt) к TC(MFTI) (седьмая дорожка) или RFl(GAQ) к TC(MFTI) или postTC(MFTI) ингибировало разрезание в кодопе UA G. что отражало тої1 факт, что Терминациоииые факторы были связаны в А-участке, защищая мРНК от токсина. При добавлении же к TC(MFTI) кроме RFl(wt) также RF3 и GTP появлялся разрез мРНК в кодонах UA G и AC G, что отражало тот факт что RF3 удалял RF1 из А-участка, причем совместное действие терминационых факторов ие приводило к транслокации мРНК. При добавлении же RF3 и GTP к смеси RFl(GAQ) и TC(MFTI) или poslTC(MFTI) приводило к ускорению разрезания мРНК только во втором случае, что подтверждало наблюдение, что RF3 GTP способен удалять терминационые факторы первого класса с рибосомы только после отщепления пептида. После проведения исследований касательно поведении деацилированной тРНК на постгерм и национнных комплексах были начаты работы по изучению влияния факторов, участвующих, в рисбосомной рециклинга - R_RF, IF3 и EF-G. [С14]тРНКш В опыте, приведенном на рис. 21 A, postTC(MFTI) инкубировался в присутствии различных факторов и долю рибосом, находящихся в postTC(MFTl) определяли путем анализа эффективности разрезания под действием токсина RelE кодона AUG в А-участке рибосомы. Временную динамику процесса исследовали, отбирая и анализируя аликвоты через 0,25, 2, 4 и 6 минут после добавления токсина. Добавление IF3, EF-G и GTP не увеличило скорость реипциации, однако добавление EF-G, RRF и GTP в присутствии либо отсутствии IF3 привело к быстрому удалению тРНК из Р-участка, о чем свидетельствует быстрое уменьшение полосы, соответствующей комплексу, зафиксированному на мРНК посредством деацилированной тРНК в Р-участке (рис. 22А), Исследование кинетических параметров диссоциации деацилированной тРНК проводили с использованием комплексов postTC(MFTT), содержащих в Р-учаске [ JP1TPHK е, которые инкубировали в присутствие RRF, GTP, EF-G и тРНКШс1 конкурирующей за связывание с рибосомным комплексом с [33Р]тРНК11 . Как показано на рис. 21В, RRF и EF-G кооперативно стимулируют диссоциацию [ Р]тРНК е. В качестве демонстрации важности пептида для стабильности тРНК в Р-участке был проведен эксперимент, в котором диссоциация тРРІК отслеживалась в ргеТС (рис. 21С). Как видно, пептид значительно стабилизирует тРНК на рибосоме.
Согласно полученным данным, даже в присутствии EF-G и RRF диссоциация TPFIK ИЗ Р-участка postTC происходит относительно медленно, что говорит о том. что действие факторов, по всей видимости, не приводит к транслокации тРНК, поскольку диссоциация тРНК из Е-участка происходит весьма быстро, так же как и транслокация сама по себе. По-видимому, RRF и GTP меняют конформацию рибосомы таким образом, что меняется аффинность тРНК к Р-участку, например, посредством диссоциации рибосомы на субъединицы. Как будет показано далее, эти факторы действительно обладают подобной GTP-зависимой активностью. Более прямые доказательства этого факта будут приведены позже с использованием специально разработанного экспериментального подхода, косвенным же подтверждением предположения о диссоциации рибосомы под действием RRF и EF-G, полученным в рамках серии опытов по диссоцаиции [ Р]тРНК е служит следующее. При добавлении RF1 после 15 секунд инкубации postTC(MFTl) с RRF, GTP, EF-G диссоцииация ["PJTPMK1 6 полностью прекращалась, что говорит о том, что при блокировании Р-участка при помощи терминационного фактора комплекс оказывается в исходном непротранслоцированном состоянии. Скорость диссоциации [ Р]тРНК е зависела от концентрации RRF (рис. 22D), причем анализ этой зависимости позволяет объяснить, почему в предыдущих работах [80], в которых использовали низкие концентрации RRF, отсутствовал эффект добавления RRF и EF-G на диссоциацию [ Р]тРНК е. Добавление 1F3 не изменяло скорость диссоциации тРНК, свидетельствуя о том, что скорость-лимитирующим этапом в диссоциации тРНК является диссоциация рибосомы на субъединицы. Кроме опытов, по измерению количества диссоциировавшей тРНК напрямую, проводили исследования, в которых количество диссоциировавшей тРНК измеряли по количеству амииоацилированной добавленной в смесь амшюацил-тРНК-синтетазой тРНК. Полученные результаты подтверждают данные, полученные в ходе опытов с использованием [ PJTPI-IK1 е, а так же свидетельствуют, что для диссоциативной активности RRF и EF-G необходим гидролиз GTP, поскольку в присутствии GDP или GDPNP ускорения диссоциации тРНК не наблюдали (рис, 21Е), RRF стимулирует связывание EF-G GDPNP с 50S и понижает с 70S Влияние RRF на аффинность EF-G в комплексе с [3H]GDPNP к postTC, 70S или 50S исследовали с использованием техники фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры. Как показано на рис. 22А, добавление RRF значительно повышает аффинность EF-G [3H]GDPNP к 5OS, причем эффект RRF может быть сравним с эффектом 30S, поскольку добавлепие 30S приводило к аналогичному результату. Как показали опыты, 50S может быть полностью связана в комплекс с EF-G [3H]GDPNP при повышении концентрации [3Н]GDPNP и RRF.
Экспрессия и очистка EF-G
Экспрессия EF-G His6 проводили в клетках Е. соП BL21. Клетки трансформировали плазмидой, любезно предоставленной A.Forster [123], несущей ген резистентности к ампицилину и ген, кодирующий EF-G, находящийся под Т7-промотором. Культура в среде 2YT выращивали до OD6QO = 6, далее клетки собирали путем центрифугирования, лизировали с помошью френч-пресса в буфере TN200, содержавшем 20 mM Tris-HCl рН 7,5, 5 тМ MgCl2, 200 тМ NaCl и 5% глицерина . Буфер брали из расчета 3 мл на 1 г клеток. Лизат центрифугировался пр 20000 грт в роторе SS-34 в течение 20 минут, супернатант наносился на колонку Ni-NTA, уравновешенную TN200. Колонка промывалась 100 мл буфера TN200 с добавлением 5 тМ ими дозо ла, затем белок элюировался повышением концентрации имидозола до 100 тМ. Альтерантивпый вариант заключался в использовании градиента концентрации имидазола 0-250 тМ. После этого белок наносился на колонку QFF, уравновешенную буфером, содержавшем 20 тМ Tris-HCl 7,5, 5 тМ MgCl2: 50 тМ NaCl, 0,5 тМ ЭДТА, 1 тМ (Ї-меркаптоэтанол и 5% глицерина. Использовали буфера TMD (40 mM Tris-HCl рН 7,5, 5 тМ MgCI2, 1 тМ DTE) и TMD80 (40 тМ Tris-HCl рН 7,5, 5 тМ MgCI2, 1 тМ DTE, 80 тМ КС1). 400 граммов Е, coli MRE 600 растворяли в 200 мл TMD с добавлением PMSF до конечной концентрации в 0,2 тМ и ДНКзы до концентрации в 1 mg/мл. Лизис клеток проводился на холоду с помощью френч-пресса, раствор разводился до 1 л буфером TMD после чего клеточный дебрис отделялся путем центрифугирования в течение 90 минут при 9000 g при 4 С. Супернатант наносился на 600 мл DEAE колонку, уравновешенную буфером TMD при скорости нанесения 300 мл в час. Колонка промывали 600-1000 мл TMD, после чего белок смывался градиентом длинной в 5 л от 20 до 400 NaCl TMD со скоростью 300 мл в час. Фракции проверяли на активность Phe и Leu аминоацил-тРНК синтетаз.
Для проведения этого анализа 5 мл исследуемого образца элюата добавлялось к 95 мл реакционной смести, состоящей из 10 mM PEP, 1 тМ ЛТР, 0,5 mg/мл пируват киназы, 0,003 mg/мл миокиназы, 0,5 цМ тРНКр", 0,5 цМ тРНК Л 0,2 mM [3H]Phe, 0,2 тМ [14C]Phe оба радиоактивных компонента имели специфическую активность около 50 CPM/pmol. Реакционная смесь до внесения в неё аликвоты элюата преинкубировали в течение 5 минут при 37С. После добавления элюата смесь инкубировали при 37С 15 секунд, после чего тРНК осаждали добавлением 5 мл холодной 5% трихлоруксусной кислоты, затем фильтровали через GF-C (Millipire) фильтры, фильтры высушивали, помещали в сцинциляциоппые пробирки, добавлялось 4 мл коктейля Ready Protein (Beckman Coulter), определялось количество радиоактивности, инкорпорированной в тРНК. Фракции, обладающие Leu аминоацил-тРНК синтетазной активностью наносили на 10% SDS-PAGE. Объединяли фракции, содержащие EF-G и EFu, желательно с минимальным перекрыванием, белок осаждался добавлением 30 граммов сульфата аммония на 100 мл раствора. Через 3 часа после добавления перцепитатора осадок осаждался путем центрифугирования в течение 40 минут при 38000 g при 4C и растворялся в минимальном объёме TMD80, помещался в диализный мешочек и диализовался против TMD80 1-2 часа. Затем раствор осветлялся центрифугированием в роторе SS-34 при 18000 rpm 40 минут и наносился на 700 мл АсА44 (Amersham) колонку, уравновешенную TMD80. Белок элюировался со скоростью 30 мл в час и фракции анализировали при помощи 12% SDS-PAGE. Фракции, содержащие EFu, объединяли и наносили на 30 мл Q-Sepharose FF колонку, уравновешенную TMD80, затем белок смывался градиентом длинной в 800 мл от 80 до 400 NaCl TMD80 со скоростью 200 мл в час, фракции анализировали при помощи 12% SDS-PAGE, белок осаждался добавлением 60% сульфата аммония. Через 3 часа после добавления перцепитатора осадок осаждался путем центрифугирования в течение 40 минут при 38000 g при 4С и растворялся в минимальном объёме TMD80, помещался в диализный мешочек и диализовался против TMD80 1-2 часа, после чего осветлялся центрифугированием. Полученный раствор наносился на 700 мл АсА44, уравновешенную TMD80, белок элюировался при скорости промывки 30 мл в час, фракции анализировали при помощи 12% SDS-PAGE. Чистый EFu осаждался 50% сульфатом аммония. Через 3 часа после добавления перцепитатора осадок осаждался путем центрифугирования в течение 40 минут при 38000 g при 4С и растворялся в минимальном объёме буфера полимикс, помещался в диализный мешочек и диализовался против полимикса со сменой буфера 2-3 раза. Конечный белок хранился при температуре - 80 С. Экспрессия и очистка IF2 Процедуру проводили согласно [121]. Экспрессия lF21Iis6 проходила в клетках Е. coli BL21, трансформированных плазмидой pAF2H, любезно предоставленной A.Forsler [123]. Культура объёмом в 2 L выращивали в среде LB при 37{,С с добавлением 0,5 % глюкозы и 50 mg/L каиамицииа.
При OD ,QO = 0,7 экспрессию индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации в 2 тМ, после чего клетки выдерживали в инкубаторе еще 4 часа и далее собирали путем центрифугирования в течении 40 минут при 5000 rpm в роторе GS-3 SorvalL Затем клетки растворяли в 50 мл буфера с 50 mM Tris HCl 100 mM NaCl и осаждали вторично в пробирках Falkon путем центрифугирования в течении 20 минут при 5000 rpm в GS-3 Sorvall роторе. Полученная биомасса замораживали в жидком азоте и хранили при -80 С. Для выделения использовали следующие буфера: TNM200 (20 mM Tris-HCl рЫ 8,1, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl2), TNMDN120 (40 mM Tris-HCl рН 8,1, 80 mMNaCI, 5 mM MgCl2, 40 mM Nl-ЦСІ, 1 тМ DTE) и TNMDN70 (40 mM Tris-HCl рН 8,1, 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 40 mM NH4C1, 1 mM DTE). Для выделения использовалось 20 г клеток, разведенных в 20 мл буфера TNM200 с добавлением PMSF до конечной концентрации в 0,2 mM и DNA3H до концентрации в 1 mg/мл. Лизис клеток проводился на холоду с помощью френч-пресса, после чего клеточный дебрис отделялся путем центрифугирования в течении 20 минут при 4000 g при 4С. Суперпатаит разводился буфером TNM200 до объёма в 150 мл и наносился на колонку с 2 мл сорбента Ni-NTA. уравновешенную буфером TNM200. Колонка промывали тем же буфером с добавлением 5 mM имидозола до достижения базовой линии, после чего белок смывался 100 mM буфером с имидазолом и анализировался на SDS-PAGE. Затем суммарный белок осаждался при помощи сульфата аммония в конечной концентрации 0,6 г/мл, через 3 часа после добавления перцепитатора осадок осаждался путем центрифугирования в течении 40 минут при 38000 g при 4 С и растворялся в 6 мл буфера TNMDN120. Раствор осветлялся центрифугированием в настольной центрифуге и наносился на колонку, набитую 600 мл Sephacryl S200 (Pharmacia), уравновешенную буфером TNMDN120. Элюцию белка проводили в том же буфере со скоростью 40 мл в час. Анализ элюата проводился с помощю SDS-PAGE, нужные фракции собирали и разводили дважды водой. Затем раствор наносился на 5 мл колонку с Sepharose SP-Fasl Flow (Pharmacia), уравновешенную буфером TNMDN70, Колонка промывали 15-20 мл того же буфера, после чего белок элюировался в TNMDN70 с добавлением 1 М NaCl. Белок осаждался сульфатом аммония, осадок отделялся центрифугированием и растворялся в 100 мл 20 mM Tris-HCl. Раствор наносился на колонку, набитую 18 мл Sepharose Q-FF(Pharmacia), уравновешенную буфером TNMDN70. и промывался до достижения базовой линии поглощения., затем белок смывался в TNMDN70 с добавлением 1 М NaCl и осаждался сульфатом аммония, осадок отделялся центрифугированием и растворялся в минимальном объёме TNMDN70. Затем белок переносился в диализный мешок и диализовался против буфера полимикс. Конечный белок хранился при температуре - 80С.
