Содержание к диссертации
Введение
1. Классификация хроматографических методов. основные положения теории хроматографии 6
1. Оптимальные условия хроматографического разделения 7
2. Гель-проникащая хроматография 8
1. Стационарные фазы для высокоэффективной гель-проникащей хроматографии 8
1.1. Неорганические поверхностно-модифицированные носители. 9
1.2. Жесткие органические носители для гель-проникащей хроматографии 10
2. Свойства носителей для гель-проникащей хроматографии 10
3. Ионообменная хроматография 14
1. Носители для ионообменной хроматографии 16
1.1. Ионообменники с органической полимерной матрицей 16
1.2. Поверхностно-модифицированные неорганические ионообменники 17
2. Буферные системы для ионообменной хроматографии. Методы воздействия на хроматографическое разделение белков 20
3. Практическое применение высокоэффективной ионообменной хроматографии 22
3.1. Разделение изоферментов 22
3.2. Разделение гемоглобинов
4. Обратнофазная хроматография 26
1. Методы получения обратнофазных носителей 26
2. Общая характеристика обратнофазных носителей 30
3. Влияние диаметра пор матрицы и процентного содержания углерода на разделение белков методом обратнофазной хроматографии 32
4. Сольвофобная хроматография на обратнофазных носителях. 33
5. Ион-парная хроматография 35
5.1. Ион-парная хроматография пептидов и белков 37
6. Буферные системы для обратнофазной хроматографии 37
6.1. Буферные системы для разделения пептидов и белков 39
4. Разделение белков методом 0брашжзн0й хроматографии. 42
1. Применение обратнофазной хроматографии при исследовании гомологичных белков 44
2. Применение высокоэффективной хроматографии при исследовании структуры белков 46
1. Материалы 52
2. Методы 52
3. Разделение пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 обратнофазной хроматографией 57
4. Разделение продуктов гидролиза G-фактора трипсином по остаткам аргинина 58
5. Выделение пептидов избирательным связыванием с инертным носителем 60
6. Блокирование первичных аминогрупп пептидов флуореокамином 61
1. Разделение бромциановых ішгщцов фрагмента т-5 фактора Элонгации ef-g методами высокоэффективной шщкостной хроматографии 64
2. Разделение продуктов гвдролиза ef-g трипсином по остаткам аргинина методом обратнофазной хроматографии 73
3. Выделение пепгвдов путем избирательного связывания с твердофазным носителем 77
4. Автоматический анализ аминокислотных последовательностей пепгвдов, полученных после расщепления ef-g по связи asp-pro. Блокирование неспецифического расщепления флжскамижм. 83
5. Реконструкция секвесторов для повышения чувствительнос ти, эффективности и надежности автоматической деградации по эдоану 88
Выводы 92
- Жесткие органические носители для гель-проникащей хроматографии
- Буферные системы для ионообменной хроматографии. Методы воздействия на хроматографическое разделение белков
- Буферные системы для разделения пептидов и белков
- Разделение пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 обратнофазной хроматографией
Введение к работе
Установление первичной структуры белков является неотъемлемой частью изучения физико-химических основ их функционирования. Особый интерес для исследования представляют функционально важные белковые комплексы (мембранные рецепторы, компоненты биоэнергетических систем, компоненты белок-синтезирующих систем и т.д.). Другим актуальным направлением исследований является выделение белковых компонент иммунных систем организма, установление их первичной структуры и разработка методов иммуно-диагнос-тики ранних форм раковых заболеваний. Кроме того, частичное выяснение структуры белков крайне необходимо при выведении их первичной структуры по последовательности нуклеотидов в гене.
Применение традиционных, крупномасштабных многостадийных методов разделения белков и смесей пептидов и установление их аминокислотных последовательностей затруднено из-за труднодоступ-ности белкового материала. Поэтому требуется создание необходимых методов и приемов работы, которые позволили бы проводить структурные исследования на ультрамикроуровне.
Наиболее перспективным подходом для установления первичной структуры белков является создание комплекса методов, который включает одно-, двухстадийное выделение пептидов - продуктов расщепления исходной молекулы белка химическими или энзиматичее-кими методами; автоматическую деградацию полученных пептидов на
микроуровне в газофазном, жидкофазном и в твердофазном вариантах
в и, наконец, высокочуствительное детектирование отщепленных производных аминокислот.
Для изучения физико-химических основ функционирования факторов элонгации (EP-G из E.cold,EP-2 из клеток эукариот в лаборатории химии белка Института белка АН СССР проводятся иссле-
дования их первичной структуры. Данная диссертационная работа является частью исследований по определению полной первичной структуры фактора элонгации ep-g.
Целью настоящей работы явилась разработка методических приемов, позволяющих проводить разделение пептидных смесей в одну-две стадии и открывающих возможность установления первичной структуры на микроуровне, в частности, разработка общих схем разделения пептидов бромцианового расщепления и триптических пептидов среднего размера (10-30 аминокислотных остатков) высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), а также методов избирательного связывания пептидов с полимерным носителем и установление н-концевых последовательностей аминокислот связанных пептидов автоматическим методом.
Другой задачей явилось усовершенствование секвенаторов для повышения эффективности проведения автоматической деградации по Эдману.
В результате проделанной работы разработана схема разделения бромциановых и триптических пептидов методом ВЭЖХ, выделены бромциановые пептиды фрагмента Т и ряд пептидов из триптическо-го гидролизата фактора элонгации ep-g , одного из крупнейших белковых компонентов системы трансляции E.coii. Автоматическим методом Эдмана установлены ^-концевые аминокислотные последовательности в пептидах, выделенных методом ВЭЖХ. Методом избирательного связывания выделен ряд пептидов фактора элонгации ep-g и установлена их аминокислотная последовательность.
Путем реконструкции жидкостного и твердофазного секвенаторов повышена надежность и чувствительность определения аминокислотных последовательностей. Разработанные методы и приемы позволили получить значительную информацию при реконструкции полной аминокислотной последовательности молекулы фактора элонгации ep-g.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
В последнее время опубликовано несколько прекрасных обзоров (1-Ю), посвященных различным проблемам разделения биологически активных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В настоящем обзоре литературы рассмотрены наиболее общие свойства носителей и подвижных фаз для высокоэффективной хроматографии, и практическое применение этого метода для разделения микроколичеств пептидов и белков.
I. Классификация хроматографических методов. Основные положения теории хроматографии
Любое хроматографическое разделение возможно, когда подвижная фаза вместе с которой перемещается разделяемое вещество, может быть газообразной или жидкой. В случае, если подвижная фаза газ, метод носит название газоадсорбционной хроматографии, если же подвижная фаза жидкость, то это жидкостная хроматография. Жидкостную хроматографию можно классифицировать по способу разделения на несколько видов: адсорбционную, ионообменную (II), ситовую (или гель-проникающую) (12) и обратнофазную (13).
Для простых соединений, разделяющихся при прохождении через колонку, происходит взаимодействие как со стационарной, так и с подвижной фазами (14). Степень удерживания вещества в неподвижной и подвижной фазах может быть охарактеризована коэффициентом распределения К'. Отношение двух коэффициентов при постоянных внешних условиях является мерой селективности (<х ) разделительной колонки.
Разрешение двух компонент характеризуется величиной (R), определяемое расстоянием между максимумами двух пиков, выражен-
ным как разность времен удержания и среднеарифметической шириной обоих пиков у основания. Коэффициент разрешения математически связан с другими параметрами хроматографического разделения, в результате получается одно из важнейших уравнений хроматографии:
где ж - число эффективных теоретических тарелок, определяемое как
N = 16 [l
Знание числа эффективных теоретических тарелок для одного типа носителя позволяет провести сравнение разделяющей способности двух или нескольких колонок.
Наиболее подробно общая теория жидкостной хроматографии, и в частности, высокоэффективной хроматографии, изложена в ряде обзоров (15,16).
I.I. Оптимальные условия хроматогда^ическ^го аздления
Оптимальными условиями разделения считаются такие условия, при которых удается добиться максимального разрешения при наименьшей затрате времени. Для данного типа носителя свойства разделительной колонки, а, следовательно, и оптимальные условия разделения, зависят как от способа заполнения колонки, так и от диаметра используемых частиц (17).
Влияние температуры на условия и время разделения сказывается только косвенно (18), так как с увеличением температуры снижается вязкость элюента, что приводит к увеличению скорости элюента при постоянном давлении. Значения коэффициентов диффузии с увеличением температуры также возрастают, что приводит к сужению
зон разделяемого вещества. Кроме того, температура влияет на кинетику и термодинамику удерживания вещества.
Характерной особенностью высокоэффективной хроматографии является специфическое требование, предъявляемое к стационарным носителям, так как для достижения максимально возможного числа теоретических тарелок необходимы носители с малым диаметром частиц, оказывающих значительное сопротивление потоку элюента. В силу этого, стационарные фазы для ВЭЖХ должны быть устойчивы к действию давления.
П. Гель-проникаюшая хтэоматограйия
Теоретически, гель-проникающая хроматография наиболее простейший и предсказуемый хроматографический метод. Поскольку пористые тела характеризуются удельной поверхностью, объемом и диаметром пор, то хроматографическое разделение макромолекул на таких носителях происходит за счет распределения молекул между подвижной и стационарной жидкостью, т.е. большие молекулы элюируются раньше, чем малые (12). Теория хроматографичеокого процесса разделения подробно изложена в ряде книг и обзорных статьях (12,18, 19).
П.І. Стациона^ные^фазы для высокоэффективной гель-проникающей хроматографии
Для высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимы фазы с твердой матрицей, преимущество которых заключено в том, что они не набухают, легче заполняются колонки с большим числом теоретических тарелок, обеспечивая при этом высокую проницаемость носителя независимо от давления. Разделение на таких фазах возможно с любым видом элюента. Перечисленные свойства значительно увеличивают возможности высокоэффективной гель-проникающей
хроматографии.
В настоящее время выпускается два класса носителей для гель-хроматографии:
- неорганические, поверхностно-модифицированные носители; -органические носители с жесткой матрицей;
В последнее десятилетие были развиты методы получения жестких матриц с контролируемым размером пор на основе еиликагеля и пористого стекла. Описан метод (20) приготовления пористого стекла с размером пор от 40 до нескольких тысяч ангстрем. Аглютинацией субмикронных частиц еиликагеля получен другой пористый носитель (Zorbax) (21), с диаметром пор от 60 до 3000 А.
Эмульсионной полимеризацией полиэтоксисилана получен крупно-
о пористый силикагель с диаметром пор 300 А, размер которых может
о быть увеличен до 3000 А кальцинированием (22).
Прямое использование неорганических носителей для гель-проникающей хроматографии не всегда возможно, так как отрицательно заряженные силанольные группы поверхности носителя либо адсорбируют катионные образцы, либо отталкивают анионные (23). Использование подвижной фазы с высокой концентрацией соли лишь частично устраняет эту проблему. Поэтому, для подавления активных группировок носителя, используют модификацию активных центров низкомолекулярными органосиланами.
П.І.І. Неорганические поверхностно-модифицированные
носители
Поверхностно-модифицированные носители для гель-хроматографии в водных средах выпускаются на основе пористого стекла или еиликагеля. Для подавления активных группировок носителя применяют два типа модификации: с помощью глицерилпропил- или -ацетил-аминопропил-силана. Среди данного класса носителей наибольшей
популярностью пользуются TSK-гели, выпущенные в Японии. Точная природа матрицы и органической фазы в настоящее время не сообщается. В таблице I приведены носители для высокоэффективной гель-проникающей хроматографии и их характеристики.
П. 1.2. Жесткие органические носители для гель-проникающей
хроматографии
Среди жестких органических гелей наиболее подходящими для высокоэффективной хроматографии являются носители» полученные полимеризацией эфиров метакрилата. Такие носители выпускают в Чехословакии под названием Spheron (24), имеющих следующую структурную формулу:
СН.
СНг
—С— СОр-СНр—СНо—ОрС—с
СНо—С—СОрСНрСНр—он
СИ,
он.
СН,
На основае метакрилата в Японии выпускаются также ряд носителей, используемых для высокоэффективной гель-хроматографии (32), Данные об этих носителях приведены в таблице 2.
П. 2. Сврйствд^юсителеД^^ хроматографии
В отсутствие взаимодействия стационарной фазы и разделяемого вещества должна наблюдаться зависимость между логарифмом молекулярного веса и элюируемого объема (inMW- v ^). Такая зависимость наблюдается как для классических гелей, так и высокоэффективных носителей только после юстирования ионной силы подвижной
Таблица I Носители для высокоэффективной гель-проникающей хроматографии в водных средах
Таблица 2
Органические носители для высокоэффективной гель-проникающей хроматографии
фазы (25). При низкой ионной силе, для различных белков, имеющих различные изоэлектрические точки, в пределах pi от 4.4 до 9.1, происходит как уменьшение, так и увеличение элюируемого объема. Такое поведение белков при гель-хроматографии обусловлено наличием отрицательно заряженных групп на поверхности носителя (26). С увеличением ионной силы подвижной фазы наблюдается линейная зависимость логарифма молекулярного веса от элюируемого объема (27). Однако, в ряде работ (28,29) было показано, что на удержание белков на модифицированных носителях оказывают влияние не только ионные взаимодействия, но и ряд причин, природа и механизм действия которых в настоящее время не ясна. Среди указанных в таблице I носителей для гель-проникающей хроматографии наиболее изученными являются TSK-гели.
Для разделения белков и полипептидов более предпочтительны тэк-носители sw типа, поскольку для них характерна линейная зависимость in миг от объема элюирования (30), а выход белкового материала для большинства исследованных белков близок к 90 %, что указывает на отсутствие неспецифической сорбции и позволяет использовать их для оценки молекулярных весов (31). Рядом автором (32,33), были установлены пределы разрешающей способности TSK-гелей в присутствии гуанидингидрохлорида. Оказалось, что гуанидингидрохлорид снижает пределы разделения для tsk -гелей по сравнению с неденатурированными условиями. Специфическое разрешение, вычисленное для пар белков в присутствии гуанидингидрохлорида показывает наибольшую эффективность разделения для TSK G-2000 SW ниже 10000 дальтон, для tsk g-3000 sw от 10000-70000, а для tsk g-4000 sw выше 70000 дальтон. другим, более популярным методом оценки молекулярных весов становится гель-хроматография на TSK-гелях в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Было показано (34), что эффективность разделения поли-
пептидов на этих носителях, так же как на любом химически модифицированном носителе, зависит в значительной степени от ионной силы элюента. В денатурирующих условиях, исходя из оценки специфического разрешения пары белков установлено, что 0,1/ ДСН является оптимальной концентрацией. Сравнение разрешающей силы высокоэффективной гель-проникающей хроматографии белков в неденатурирую-щих и денатурирующих условиях приведено в работе (35). Представленные на рис.1 профили элюирования стандартных белков ясно показывают, что наилучшее разрешение наблюдается для систем, содержащих ДСН.
На рис.2 представлено разделение белков с известными молекулярными весами (набор фирмы Фармация) гель-проникающей хроматографии на TSK G-3000 sw в присутствии ДСН и сравнение с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Как видно, оба метода дают одинаково эффективное разделение (36).
Ш. Ионообменная хроматография
Метод ионообменной хроматографии предназначен для разделения соединений, которые в сильнополярных элюентах хотя бы частично диссоциируют. Разделение основано на сродстве ионов к противоио-нам матрицы ионообменника и ионам, содержащимся в элюенте. На нерастворимой матрице ионообменника определенным образом распределены ковалентно связанные функциональные группы, способные к диссоциации. Обычно используются сульфогрушш, карбоксильные группы (катионообменники), либо третичные аминогруппы или четвертичные аммониевые группы (анионообменники).
Упрощенно ионный обмен можно описать обменным равновесием: катионный обмен:
Xі" (элюент) + У* (матрица)" зг У+ (элюент) + X4* (матрица)"*
10 20 SO мин
Ю 20. 50 ""« 10 20 SO н«и
Рис.], (35). Высокоэффективная гель-проникающая хроматография белкового стандарта в неденатурирующих условиях Ш, в присутствии іуанидингидрохлорида (В) и Жа-додецилсуль-фата (С). Белковый стандарт включает: Р - фосфорила-зу ъ (93 К), А - альбумин (67 К), 0 - овальбудан (43 С - карбаютидразу (30 К), Т - триисиновый ингибитор (20 К), <х-лактальбумш (14.4 Ю.
140 ими
Рис.2. (36). Типичный профиль элюирования стандартных белков фирмы Фармация на двух колонках tsk g-зооо (А)-и рас-Ш деление их в полиакриламидном геле в присутствии (В). Белковый состав смеси: фосфорилазаЬ 000), бычий сывороточный альбумин X67000), оваль-бумин (43000), бычья карбангидраза (30000), соевый трипсиновый ингибитор (20100) и бычий <*-лакталь-бумин (14400).
анионный обмен:
Х~ (элюент) + У" (матрща)+ зг Г" (элюент) + X" (матрица)4"
Ионообменная хроматография в ее классическом варианте хорошо изучена и подробно изложена (11,37).
Ш.І. Но сите ли^длд.ионо обменной хроматргр.афии
Кроме соответствия всем требованиям для классической ионообменной хроматографии, материалы для высокоэффективной хроматографии должны быть: а) механически устойчивыми к высокой скорости подвижной фазы; б) достаточно гидрофильными; в) иметь высокую обменную емкость; г) химически устойчивыми в широком диапазоне
рН; д) желателен размер частиц 5-Ю мкм с диаметром пор от 300
о до 1000 А. Носители, которые могут быть использованы для высокоэффективной ионообменной хроматографии белков делятся на три типа:
а) органические носители,
б) смешанные органически-неорганические носители,
в) неорганические, с тонким поверхностным слоем органической
фазы.
Ш.І.І. Ионообменники с органической полимерной матрицей
Среди ионообменных носителей, пригодных для ионообменной хроматографии белков и удовлетворяющих указанным требованиям, является сферой, полученный на основе полиметилметакрилата (38). Успешное разделение белков, как на КМ, так и ДЕАЕ сферонах было показано Микешем и сотр. (39,40). Слабый катионообменник Bio-Rex, относящийся к органическим полимерным носителям также с успехом применялся для разделения белков (41). Существенным недостатком указанных носителей является отсутствие узкофракционированных сорбентов с размером частиц менее 20-40 микрон.
Кроме полиметилметакрилатных носителей для ВЭЖХ используются узкофракционированные сильносшитые полистирольные смолы (42), выдерживающие относительно высокие давления. Подобные носители широко применяются для разделения смесей пептидов малого и среднего размера (43).
Ш.І.2. Поверхностно-модифицированные неорганические
ионообменники
Ионообменники такого типа получают нанесением на непроницаемые стеклянные шарики размером 30 мкм, пленки органического ионообменника (44). Толщина пленки при этом составляет примерно I мкм. Носители такого типа обладают хорошими хроматографически-ми свойствами, причем объем насадки не зависит от ионной силы элюента. Благодаря этому колонки можно заполнять сухим способом. По свойствам эту группу ионообменников можно разделить на два семейства. Первое семейство таких носителей получают сополимери-зацией эпоксимономеров на поверхности глицерилпропилсилан-модифи-цированного стекла (45). Поскольку структурной единицей пленки является глицерин, такие носители получили название Тликофаза". Общая химическая формула гликофаз имеет следующий вид:
-Si-0 v / \
4 Si-(СН0).-О-ОНр-СН-СНр -Si-О і "*
Наличие реакционно-способной эпоксигруппировки позволяет получить как ДЕАЕ, так и КМ-ионообменники (46).
Для второго семейства ионообменных носителей указанного типа характерно нековалентное покрытие неорганической матрицы полифункциональными аминами с последующим образованием тонкой полиаминной пленки (47). Высокая плотность аминогрупп на поверх-
Таблица З Ионообменные носители для высокоэффективной жидкостной
хроматографии
Продолжение таблицы 3
ности носителя полностью предотвращает взаимодействие белков с силанольными группами.
В 1978 году фирма SynChrom выпустила на основе крупнопористых силикагелей ряд ионообменников (48), имеющих высокую объемную емкость. В табл.3 приведены наиболее распространенные ионообменные носители для высокоэффективной хроматографии и их характеристики.
Ш.2. Буфе^ще^систеш.^^^ионообменной хроматографии. Методы_воздействид_на зфрматр^^афическое^азд^е^ение
белков^
В ионообменной хроматографии успех разделения, наряду со свойствами носителя, определяется также свойствами элюента. Поскольку обычно в качестве элюента используют воду, то на разделение можно влиять, изменяя три параметра: рН, род буфера (вид цро-тивоиона) и ионную силу.
Зависимость разделения смесей белков и пептидов от рН связаны с тем, что при различных значениях рН их полярные группы могут находиться либо в диссоциированном состоянии и в этом случае происходит разделение в результате ионного обмена, либо проходить через колонку в недиссоциированном виде.
Изменение состава буферного раствора приводит к изменению селективности разделяющей системы. Элюирующая способность анионов и катионов зависит от того, насколько сильно они сами удерживаются соответствующим ионообменником (49). Сила адсорбции анионов на классическом анионообменнике убывает в следующем ряду: цитрат > оксалат > i"> hso" ^ tsoZ > вт~ > ci~ > формиат > ацетат > ОН" > р~. Для слабоосновных ионообменников, а также для анионо-обменников с различной матрицей, порядок ионов несколько меняется.
Для сильнокислого катионообменника также установлена последовательность адсорбции катионов: Ре3+> ва2+> РЪ2+> Са2+>
Ni2+> Cd2+> Са2+> Go2+> Zn2+> Mg2+>U 02+>Tl2+>Ag+ > Cs+> Pb+ > K+ > UHj > Ua+ > H+ > Li+.
Классическим примером влияния вида иона на изменение селективности является разделение кислых аминокислот при автоматическом анализе аминокислот. Замена буфера с лимоннокислым натрием на буфер с лимоннокислым литием позволяет разделить не только Asp и Glu кислоты, но и ряд других нингидринположительных соединений.
Наиболее сильное влияние на удержание вещества оказывает ионная сила элюента. Концентрация ионов в элюенте определяет селективность разделяющей системы, что объясняется смещением ионообменного равновесия. В общем случае концентрация ионов элюента обратно пропорциональна селективности колонки.
Большинство подвижных фаз, которые используются в классической ионообменной хроматографии,хорошо функционируют с высокоэффективными ионообменными носителями. Профили элюирования белков, полученные для традиционных ионообменников и для высокоэффективных колонок, обычно очень близки. Условия разделения отличаются при этом только ионной силой, необходимой для элюирования белков, разрешением и временем анализа. Единственное требование к подвижной фазе при высокоэффективной хроматографии, это предел рН, который не должен превышать 8.0, так как большинство колонок производится на основе силикагеля.
Характерной особенностью высокоэффективных ионообменных носителей является сохранение энзиматической активности ферментов. Кроме этого, короткое время анализа при ВЭЖХ дает возможность определять ферментативную активность нестабильных белков.
Ш.З. Практическое_іщименение высокоэффективной
ионообменной^х^оматог^^ии^^щя^азделения белков
Ш.З.І. Разделение изоферментов
Одним из примеров успешного применения высокоэффективной ионообменной хроматографии является разделение изоферментов лактатдегідрогенази. Изоферменты синтезируются in vivo под генетическим контролем (50) и выполняют в организме различные метаболические функции: например, лактатдегидрогеназа тканей миокарда контролирует аэробное окисление, в то время как изоферменты тканей печени анаэробное восстановление. Поэтому быстрое и эффективное разделение изоферментов представляет большой интерес для диагностики различных заболеваний.
Іактатдегидрогеназа является тетрамером и состоит из двух субъединиц, Н и М, образующих пять комбинаций - Н^, НдМ, Н^, НМ3 и %» обозначаемых по электрофоретической подвижности как LD-1, LD-2, LD-з, LD-4 и LD-5. Разделение этих изоферментов классической ионообменной хроматографией проводят при рН=7.8, в присутствии iTaCl или Ка -ацетата в градиенте концентрации от О до 0.3 М. Применение этих условий для высокоэффективной ионообменной хроматографии позволило ІШіабачу (51) выделить изоферменты с выходом 90 % ферментативной активности. Типичный профиль элюи-рования изоферментов ы> представлен на рис.3. Высокая воспроизводимость выхода изоферментов при ВЭ ионообменной хроматографии позволяет получать сравнительную характеристику изоферментов при клинических исследованиях.
Высокоэффективная ионообменная хроматография позволила обнаружить более глубокую множественность изоферментов лактатде-гидрогеназы (52,53). Так было обнаружено наличие еще трех изоформ
ДЛЯ LD-З И ДВУХ форм ДЛЯ LD-4.
^чЛЛ_,
ІШ * 10$
з..
ТІПЕ (MIN)
-»-
Рис.3. (51). Сравнение профилей элюирования нормальных (А) и аномальных (В) изоферментов из плазмы крови. Условия разделения: колонка 0,5x18 см с ДЕАЕ-гликофазой, 5-Ю мкм, в 0.02 М Трис-HCl буфере, рН=7.8 (низкомолекулярный буфер), сильный буфер приготовлен из слабого добавлением 0,15 М неї*
В случае использования специфических детекторов ферментативной активности, метод высокоэффективной ионообменной хроматографии позволяет проводить клинический анализ таких важных ферментов, как креатин-киназа, щелочная фосфотаза, гексогиназа (52,54).
Ш.3.2-. Разделение гемоглобинов
Жесткие органические носители для гель-проникащей хроматографии
В отсутствие взаимодействия стационарной фазы и разделяемого вещества должна наблюдаться зависимость между логарифмом молекулярного веса и элюируемого объема (inMW- v ). Такая зависимость наблюдается как для классических гелей, так и высокоэффективных носителей только после юстирования ионной силы подвижной фазы (25). При низкой ионной силе, для различных белков, имеющих различные изоэлектрические точки, в пределах pi от 4.4 до 9.1, происходит как уменьшение, так и увеличение элюируемого объема. Такое поведение белков при гель-хроматографии обусловлено наличием отрицательно заряженных групп на поверхности носителя (26). С увеличением ионной силы подвижной фазы наблюдается линейная зависимость логарифма молекулярного веса от элюируемого объема (27). Однако, в ряде работ (28,29) было показано, что на удержание белков на модифицированных носителях оказывают влияние не только ионные взаимодействия, но и ряд причин, природа и механизм действия которых в настоящее время не ясна. Среди указанных в таблице I носителей для гель-проникающей хроматографии наиболее изученными являются TSK-гели. Для разделения белков и полипептидов более предпочтительны тэк-носители sw типа, поскольку для них характерна линейная зависимость in миг от объема элюирования (30), а выход белкового материала для большинства исследованных белков близок к 90 %, что указывает на отсутствие неспецифической сорбции и позволяет использовать их для оценки молекулярных весов (31). Рядом автором (32,33), были установлены пределы разрешающей способности TSK-гелей в присутствии гуанидингидрохлорида. Оказалось, что гуанидингидрохлорид снижает пределы разделения для TSK -гелей по сравнению с неденатурированными условиями. Специфическое разрешение, вычисленное для пар белков в присутствии гуанидингидрохлорида показывает наибольшую эффективность разделения для TSK G-2000 SW ниже 10000 дальтон, для TSK G-3000 SW ОТ 10000-70000, а для TSK G-4000 sw выше 70000 дальтон. другим, более популярным методом оценки молекулярных весов становится гель-хроматография на TSK-гелях в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Было показано (34), что эффективность разделения поли- пептидов на этих носителях, так же как на любом химически модифицированном носителе, зависит в значительной степени от ионной силы элюента. В денатурирующих условиях, исходя из оценки специфического разрешения пары белков установлено, что 0,1/ ДСН является оптимальной концентрацией. Сравнение разрешающей силы высокоэффективной гель-проникающей хроматографии белков в неденатурирую-щих и денатурирующих условиях приведено в работе (35).
Представленные на рис.1 профили элюирования стандартных белков ясно показывают, что наилучшее разрешение наблюдается для систем, содержащих ДСН. На рис.2 представлено разделение белков с известными молекулярными весами (набор фирмы Фармация) гель-проникающей хроматографии на TSK G-3000 sw в присутствии ДСН и сравнение с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Как видно, оба метода дают одинаково эффективное разделение (36). Ш. Ионообменная хроматография Метод ионообменной хроматографии предназначен для разделения соединений, которые в сильнополярных элюентах хотя бы частично диссоциируют. Разделение основано на сродстве ионов к противоио-нам матрицы ионообменника и ионам, содержащимся в элюенте. На нерастворимой матрице ионообменника определенным образом распределены ковалентно связанные функциональные группы, способные к диссоциации. Обычно используются сульфогрушш, карбоксильные группы (катионообменники), либо третичные аминогруппы или четвертичные аммониевые группы (анионообменники). Упрощенно ионный обмен можно описать обменным равновесием: катионный обмен: Ионообменная хроматография в ее классическом варианте хорошо изучена и подробно изложена (11,37). Ш.І. Но сите ли длд.ионо обменной хроматргр.афии Кроме соответствия всем требованиям для классической ионообменной хроматографии, материалы для высокоэффективной хроматографии должны быть: а) механически устойчивыми к высокой скорости подвижной фазы; б) достаточно гидрофильными; в) иметь высокую обменную емкость; г) химически устойчивыми в широком диапазоне рН; д) желателен размер частиц 5-Ю мкм с диаметром пор от 300 о до 1000 А. Носители, которые могут быть использованы для высокоэффективной ионообменной хроматографии белков делятся на три типа: а) органические носители, б) смешанные органически-неорганические носители, в) неорганические, с тонким поверхностным слоем органической фазы. Ш.І.І.
Ионообменники с органической полимерной матрицей Среди ионообменных носителей, пригодных для ионообменной хроматографии белков и удовлетворяющих указанным требованиям, является сферой, полученный на основе полиметилметакрилата (38). Успешное разделение белков, как на КМ, так и ДЕАЕ сферонах было показано Микешем и сотр. (39,40). Слабый катионообменник Bio-Rex, относящийся к органическим полимерным носителям также с успехом применялся для разделения белков (41). Существенным недостатком указанных носителей является отсутствие узкофракционированных сорбентов с размером частиц менее 20-40 микрон. Кроме полиметилметакрилатных носителей для ВЭЖХ используются узкофракционированные сильносшитые полистирольные смолы (42), выдерживающие относительно высокие давления. Подобные носители широко применяются для разделения смесей пептидов малого и среднего размера (43). Ш.І.2. Поверхностно-модифицированные неорганические ионообменники Ионообменники такого типа получают нанесением на непроницаемые стеклянные шарики размером 30 мкм, пленки органического ионообменника (44). Толщина пленки при этом составляет примерно I мкм. Носители такого типа обладают хорошими хроматографически-ми свойствами, причем объем насадки не зависит от ионной силы элюента. Благодаря этому колонки можно заполнять сухим способом. По свойствам эту группу ионообменников можно разделить на два семейства. Первое семейство таких носителей получают сополимери-зацией эпоксимономеров на поверхности глицерилпропилсилан-модифи-цированного стекла (45). Поскольку структурной единицей пленки является глицерин, такие носители получили название Тликофаза". Общая химическая формула гликофаз имеет следующий вид: Наличие реакционно-способной эпоксигруппировки позволяет получить как ДЕАЕ, так и КМ-ионообменники (46). Для второго семейства ионообменных носителей указанного типа характерно нековалентное покрытие неорганической матрицы полифункциональными аминами с последующим образованием тонкой полиаминной пленки (47). Высокая плотность аминогрупп на поверх-
Буферные системы для ионообменной хроматографии. Методы воздействия на хроматографическое разделение белков
Стационарные фазы с органическими молекулами, связанными с поверхностью силикагеля, называются "обращенными" фазами (60). Химически модифицированные фазы обладают рядом преимуществ по сравнению с обычными сорбционными носителями на основе силикагеля: (А) многие неионные, ионные и ионизированные соединения могут быть разделены в одно и то же время на одной колонке; (В) колонки с обращенной фазой достаточно стабильны; (С) наиболее распространенный элюент - вода в смеси с рядом органических растворителей; (Д) поведение различных соединений на колонке может быть предсказано; (Е) уравновешивание колонки достигается в короткий промежуток времени. ІУ. I. Методы_пол енш_о атноф, Органические гидрофобные молекулы могут быть связаны с поверхностью силикагеля тремя различными способами: - реакцией силанолышх поверхностных групп со спиртами с образованием эфирной связи si-o-c (61), - реакцией силанольных групп с первичными или вторичными аминами с образованием аминосиланов si-UH-c(6I), - реакцией силанольных групп с хлорсиланами с образованием si-c связи, стабильной при рН 1-8,5 (62). Наиболее часто употребляются обращенные фазы на основе Cjg, Со и ряда других модификаций. Характеристики носителей, выпускаемых различными фирмами, приведены в таблицах 5,6. Общий метод получения обращенных носителей основан на обработке силикагеля ди-, три-хлор или этоксиамилсиланами (63). Во избежание полимеризации модифицирующих реагентов (см. схему I) реакция проводится в безводных средах. Для блокирования свободных гидроксильных групп поверхности носителя проводится дополнительная обработка триметилхлорсиланом (64) или гексаметилдисила-заном (65). Необходимость вторичной обработки вызвана тем, что силикагель после модификации еще содержит некоторое количество непрореагировавших силанольных групп, которые оказывают влияние на хроматографическое разделение полярных соединений (уширение пиков, необратимая сорбция, низкая эффективность). Оценка качества получаемой стационарной фазы основана на определении удержания неполярных соединений при элюировании неполярными элюентами. Чем меньше удержание неполярного вещества, тем выше качество обратно-фазного носителя (66). На носителях, модифицированных низкомолекулярными углеводородами, происходит более сильное взаимодействие растворителя с поверхностью матрицы, в результате разделение вещества протекает по смешанному механизму (адсорбционному и обратнофазному). Стабильность таких фаз в водных системах несколько ниже, чем с Cjg фазами (63). ІУ.2. Общая xa;paKTej?HCTEK jo a Каждый обратнофазный носитель характеризуется тремя параметрами: степенью введения углерода на поверхность матрицы; диаметром пор матрицы и диаметром частиц носителя, используемого для разделения.
Каждый из этих параметров оказывает влияние на хроматографическое разделение вещества (67). Рядом авторов (66, 68) были исследованы хроматографические свойства обратнофазных носителей в зависимости от длины цепи углеводородного радикала, от степени введения углерода на поверхность силикагеля и от диа- метра пор матрицы (силикагеля) и показано, что с увеличением длины цепи углеводородного радикала содержание углерода на поверхности носителя увеличивается с 3.1 до 20 %, Содержание органических о молекул на единицу площади (100 А) уменьшается с 5 молекул до 2 молекул для Cjg, покрывая при этом площадь поверхности силикагеля Ор в 50 А . С увеличением диаметра пор уменьшается поверхность носителя (67) и в этом случае при химической модификации содержание Cjg углеводородного радикала достигает только 6.25 % с концентра- Ор цией 5.4 молекулы на 100 А . Поэтому при разделении низкомолекулярных органических соединений наилучшее разрешение наблюдается для стационарных фаз характеризующихся высоким процентным содержанием углерода на матрице и минимально возможным (для данного типа матрицы) диаметром пор. ІУ.З. Влияние диамет]эа_пр ат вдпедода_на разделениеJ5елков методом о_братнофазной хроматогда ии Разделение белков высокоэффективной обратнофазной хроматографией определяется силой их взаимодействия с гидрофобной стационарной фазой. Выход белка при этом находится в прямой зависимости от процентного содержания углерода на матрице (69). Поэтому для получения хорошего разрешения белков на обратнофазном носителе необходимо уменьшить сродство белка к стационарной фазе, которое может быть достигнуто двумя путями: во-первых, за счет модификации матрицы углеводородами с короткой цепью. Во-вторых, за счет модификации крупнопористого носителя лигандом с длинной углеводородной цепью (69,70). Более предпочтителен второй путь, так как углеводороды с длинной цепью обладают большей способностью покрывать поверхность матрицы. Влияние процентного содер- жания углерода на поверхности матрицы хорошо прослеживается при разделении крупных полипептидов и белков.
Систематическое изучение (69,70,71) хроматографического поведения белков на обратно-фазных носителях с различной длиной алкильного радикала показало, что с увеличением длины цепи углеводорода увеличивается время удержания данного вида белка и выход стандартного белкового образца (45 килодальтон) для Cjg носителя составляет 8 %, с Cg носителя - 22 %, а для С3 носителя - 78 %9 при элюировании пропано-лом, что указывает на сильное взаимодействие его со стационарной фазой. Типичное разделение стандартных белков на обратнофазном носителе представлегона рис.5. Разделение высокомолекулярных белков, таких как цитохром С, -цепь коллагена, бычьего сывороточного альбумина и тирозиназы на крупнопористом обратнофазном носителе (72), показало, что выход белковых образцов для носителя с диаметром пор 50 нм близок к 80 %, в то время как на носителе с диаметром пор 10 нм наблюдается значительная сорбция. При высоких концентрациях белков лучшее разрешение наблюдается для обратнофазных носителей с размером пор в 50 нм. ІУ.4. Сольво обня_хомато2)афия_на обратнофазных носителях Поскольку у обратнофазных носителей полярность подвижной фазы выше полярности стационарной фазы, то полярные вещества при обратнофазной хроматографии элюируются раньше. Менее полярные вещества удерживаются сильнее. Для родственных соединений взаимодействие вещества с сорбентом отличается незначительно, и поэтому селективность системы определяется элюентом (73,74). Меха- низм удержания для этого типа хроматографии подробно изложен в работах Говарда (74,75), согласно которому неионизированные органические молекулы распределяются между стационарной и подвижной фазами. Данный вид хроматографии носит название сольвофобной. Ионизированные соединения при этом виде хроматографии либо элюи-руются очень быстро, либо дают плохо определенные пики. Поэтому, для разделения таких соединений необходим тщательный контроль рН элюента. Также можно использовать обратнофазный носитель, функционирующий по ион-парному механизму. ІУ. 5. Ион-паная__хдоматография Ион-парная хроматография основана на способности обращенной фазы удерживать ионизированные соединения при наличии липофильных ионов в подвижной фазе (76). В зависимости от гидрофильности ион-парных реагентов возможно два механизма взаимодействия вещества со стационарной фазой. В случае "динамического ионного обмена , гидрофильный ион сильно адсорбируется на стационарной обращенной фазе, которая приобретает свойства ионообменника (77). Разделение вещества протекает при этом главным образом за счет ионных групп. При "ион-парной хроматографии" ионизированный образец и гидрофильный цротивоион подвижной фазы образуют нейтральную пару в элюенте, которая может быть адсорбирована стационарной фазой (78). Число ионизированных групп разделяемого образца определяет удержание. Например, для таких ионизированных соединений, как пептиды, удержание значительно увеличивается с увеличением длины цепи противоиона, оказывая более сильное влияние на длинные пептиды, чем на короткие (79).
Буферные системы для разделения пептидов и белков
Многие полипептиды и белки в водных буферных раотворах сильно связываются с углеводородной стационарной фазой, что обусловлено взаимодействием неполярных боковых групп белков или полипептидов с обращенной фазой, уменьшающее площадь поверхности стационарной фазы, необходимую для водного буфера (86). Увеличение концентрации органического растворителя подавляет эти взаимодействия, но из-за низкой растворимости полипептидов и белков в большинстве из них, имеется предел рабочих концентраций. Гидро- фильные ион-парные реагенты, взадаодейетвующие с аминогруппами, такие как фосфорная кислота, фосфаты и им подобные противоионы, в ряде случаев позволяют преодолеть эти трудности. Так, сравнение хроматографического поведения пептвдов при обратнофазяой хроматографии в 0.1 % Н3РО4 в присутствии и отсутствии сю и органических элюентов - изопропанола и ацетонитрила показывает, что введение перхлорат иона в подвижную фазу увеличивает время удержания пептидов и одновременно уширяет пики. Применение изопропанола улучшает хроматографическое поведение гидрофобных пептидов, в то время как ацетонитрил более предпочтителен для разделения пептидов малого размера. На рис.7 приведены хроматограммы сравнительного разделения триптического гидролизата основного панкреа- тического трипсинового ингибитора, в 0.1 % Н3Р04, О.ОІ М нею. о ацетонитрилом (а), изопропанолом (в) с детектированием при 220 шив 0.125 М fy/HCOOH рН 3.0 с изоцропанолом и детектированием пептидов по флуоресценции» У. Разделение белков методом обтэатноФазной хвоматогтэаФии Большие белки, такие как альбумин, миоглобин, цитохром с, интерферон,могут быть разделены методом обратнофазной хроматографии (87,88). Примером удачного использования обратнофазной хроматографии может служить разделение Н-2 тяжелой цепи и д 2-микроглобулина антигена гие оеовместимости (89). Типичный профиль элшрования субъединиц приведен на рис.8. Выход белков составил для Н-2 тяжелой цеш 35 %, а для микроглобулина 80 %. Данная техника выделения позволила провести структурный анализ этих цепей. Разрешающую силу метода обратнофазной хроматографии можно видеть при разделении апоглипо белков (90).
Данное оемейство бел: ков, участвующее в метаболизме липобелков, может быть разделено методом колоночной хроматографии или электрофорезом на три фракции (3-І, С-П- и G-ІЇЇ. Фракционирование общей фракции С-айолипобел-ков на Cjg-обратнофазной колонке позволяет разделить ее на 19 индивидуальных пиков.ІТ (см. рис.9). Так, апо-С-Ш белок должен состоять из шести полиморфных фракций по данным изо электрофокусировки, отличающихся количеством опаловых кислот. Высокоэффективная обратнофазная хроматография позволила обнаружить для апо-С-Ш двенадцать полиморфных форм. В случае апо-С-П фракции обнаружено четыре полиморфные формы. Все полученные формы, для каждого вида апобелка, идентичны по своему аминокислотному составу. Для ряда иммунологических исследований необходимы белки, не содержащие примесей пептидов, солей или других белков. Например, использование обратнофазного носителя Hypersyl CJQ для раз- Развитие ВЭЖХ и, в частности, обратнофазной хроматографии дало в руки исследователей метод микроколичественного разделения энзиматических гидролизатов. Примером успешного использования этого метода явилась структурная. характеристика множества аномальных гемоглобинов человека, основанная на анализе триптических пептидов (92) индивидуальных цепей и их гибридных форм. Поскольку разделение триптических пептидов этим методом достигается за несколько часов, авторам удалось провести сравнительное изучение 25 различных вариантных гемоглобинов. Типичный профиль элюирова-ния триптических пептидов гемоглобина представлен на рис.II. Высокая скорость и воспроизводимость высокоэффективно! обратнофазной хроматографии в совокупности с высокой чувствительностью детектирования позволяет проводить сравнительные структурные исследования биологически важных белков, например, интерфе-роны. Так, для всех видов интерферонов, доступных в микроколичествах методом обратнофазной хроматографии,.были получены профили элюирования триптических пептидов и установлена идентичность d4, г Pi ж fta. видов и показаны различия между р3, yt , и %ъ видами (93). У.2. Применение_высокоэффективнай_х]эрматрграфии пр.и.. исследовании_ст ы елкрв Для выяснения возможности микропрепаративного разделения смесей пептидов Шайвели и соавторы (94) провели сравнительное исследование подвижных систем, стационарных обращенных фаз и систем детектирования для выделения микрограммовых количеств пептидов - продуктов протеолитических расщеплений белков. Авторы провели разделение триптических пептидов цитохромас сердца лошади обратнофазной хроматографией на алкилфенильной колонке Bonda-pak - фенил в системах 0,09 % трифторуксусная кислота (ТРА) -ацетонитрил и пиридин-ацетат рН=4.0 - пропанол, а также на колонке uitrasphere Octyl в системе пиридин-ацетат-пропанол, с постколоночным детектированием флуоресценции. В случае ион-парной системы с трифторуксусной кислотой, примененной для элгоирования триптических пептидов цитохрома с на колонке с алкилфенильным носителем было получено 17 индивидуальных пептидов, в то время как элюирование пептидов пиридин-ацетатной системой при рН=4.0 позволило разделить пептиды только на девять фракций.
Разделение этого же гидролизата на колонке Ultra-sphere-Octyi в пиридин-ацетатной системе, позволяет распределить пептиды по 13 фракциям. Анализ последовательности аминокислот выделенным пептидам показал, что наиболее эффективное разделение пептидного гидролизата достигается в ион-парной системе с трифторуксусной кислотой. Кроме этого авторы провели сравнение эффективности разделения триптических пептидов на различных стационарных фазах. Одинаковое количество триптического гидролизата анализировалось на колонках: алкилфенильной, С-8 и C-I8 в идентичных условиях. Сравнение профилей элюирования пептидов (см.рисДЗ) показало, что на различных носителях достигается примерно одинаковое разрешение пептидов, но более предпочтительно использование С-8 обратнофазного носителя (по количеству разделяемых пептидов). В случае алкилфенильного носителя, наилучшее разрешение наблюдается для более "длинных пептидов. Для разделения сложных энзиматичееких гидролизатов на примере фибронектина плазмы человека (см. рис„13) авторы предлагают использовать предварительное фракционирование энзиматического гидролизата по молекулярному весу, затем каждую фракцию хроматографировать на обратнофазном носителе. Определение аминокислотной последовательности в выделенных пептидах показывает возможность использования метода высокоэффек тжвной хроматографии для проведения структурных исследований. Примером, показывающим возможности ВЭЖХ для установления структуры белков».могут служить структурные исследования -цепи коллагена (95). Для этих работ использовали коллаген I. Выделение ос , (Ь и у компонент было проведено на высокоэффективной колонке TSKG4000SW с использованием нелетучего буфера. Для разделения -1и л-2 цепей была применена обратнофазная хромато- графин на крупнопористом силикагеле Vidac 201 ТР в 0.01 % гепта-фтормасляной кислоте и градиенте концентрации АсСН ОТ 24 до 48 %. Очищенная « -I цепь была подвергнута расщеплению бромцианом и полученные пептиды разделены на обратнофазном носителе Vidac 201 ТР цри градиенте концентрации от 12 до 44 % ацетонитрила. Один из крупных пептидов бромцианового расщепления «-I (I) СВ-3 подвергался расщеплению трипсином, а пептиды выделялись в тех же условиях, что и о(-1 цепь коллагена, но при более низких концентрациях ацетонитрила (4-32 %), На рис.14 приведены профили элюирования субъединиц коллагена I на колонке TSK G-4000 sw(a), обратнофазном носителе Vidac 201 ТР (б), пептидов бромцианового расщепления -I субъединицы на колонке vidac 201 ТР (в) и триптических пептидов бромцианового фрагмента СВ-3 (с) на колонке Vidac 201 ТР. Выделенные по данной схеме пептиды подвергались определению аминокислотной последовательности. Для проведения таких структурных исследований понадобилось только 3 мг очищенного коллагена. Таким образом, на примере разделения пептидов коллагена, показано, что структурные исследования крупных белков, доступных в незначительных количествахіс успехом могут быть проведены с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии различных типов.
Разделение пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 обратнофазной хроматографией
Для разделения модифицированных пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 и модифицированных малеиновым и ЭТГФ ангидридами использовали обратнофазные носители Lichrosorb RP-8, Lichrosorb RP-18 и Separon c-18. Элюирование пептидов проводили повышающейся концентрацией ацетонитрила. Стартовый буфер (А) состоял из 0,01 М аммоний ацетатного буфера с рН 6,0. Буфер "В" состоял из 20 % 0,01 М аммоний ацетатного буфера рН 6,0 и 80 % ацетонитрила. Смесь пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 ( I мкмоля) растворяли в 2 мл стартового аммоний-ацетатного буфера и доводили рН до 8,5 10 % аммиаком. Полученный раствор центрифугировали и аликвоту осветленного раствора (200-500 мкл, содержащую 2-5 нм смеси пептидов) наносили на обратнофазную колонку и промывали ее начальным буфером в течение 5-Ю мин для удаления всех видов солей и свободных аминокислот. Затем пептиды элюировали линейной концентрацией ацетонитрила. ІУ. Разделение ПРОДУКТОВ гидролиза G-Фактора ТРИПСИНОМ по остаткам аргинина Для разделения пептидов триптического гидролиза по остаткам аргинина проводили фракционирование общего триптического гидролиз ата на колонке с сефадексом G-25, затем на обратнофазном носителе Lichrosorb RP-8. ВГ.І. Малеин овадие_свободных_амшог цп фактора Малеинирование свободных аминогрупп EP-G -фактора перед триптическим гидролизом проводили по тому же методу, как указано в Ш.2 для пептидов бромцианового гидролиза фрагмента Т-5, в 0,5 М натрий-боратном буфере и в присутствии 7 М мочевины. После окончания реакции, модифицированный EP-G обессоливали на колонке с сефадексом G-25 в аммиачной воде рН 9,0 и лиофильно высушивали. 2 мкмоля EP-G, модифицированного малеиновым ангидридом растворили в 10 мл аммиачной воде, рН 9,5, рН довели до 8,1 уксусной кислотой и раствор термостатировали при 37 С в ячейке титратора. К раствору добавили трипсин (I % раствор в воде, ТРСК-обработан-ный) в соотношении фермент-субстрат 1:50 двумя равными порциями. Вторую порцию добавили через 4 часа и смесь инкубировали при 37 С в течение 12 часов, рН раствора поддерживали с помощью автотит-ратора (Radiometr, Дания) I % раствором аммиака.
Затем раствор подкислили уксусной кислотой до рН 3, выпавший осадок отделили центрифугированием (30 мин, 16000 об/мин), затем ресуопендировали в 5 мл 5 % уксусной кислоты и снова центрифугировали. ІУ. 3. Гель-хроматогр ияjip_oдуктов__тдиптического_гидролиз а_ на__с ефадексeSz? _ 2 мкмоля триптического гидролизата фракционировали на колонке 2,5x150 см с сефадексом G-25. Элюирование проводили 0,01 М аммоний бикарбонатным буфером рН 7,8 со скоростью 20 мл/ч и детектированием пептидов при 206 и 280 нм. ІУ.4. Обратнофазная хдюматография т иптических ептиаов EJM jaKTppa_ Разделение триптических пептидов, находящихся во фракциях после гель-хроматографии на сефадексе G-25 проводили на обратно-фазном носителе Lichrosorb RP-8, в буферных системах как указа- но в Ш.4. Аликвоту фракции, содержащую 5-30 нм пептидов наносили на обратнофазную колонку в объеме 200-1500 1 , и промывали стартовым буфером в течение 10 мин для удаления солей и свободных аминокислот. Затем пептиды элюировали линейным градиентом концентрации ацетонитрила с детектированием при 210 нм. Чистоту пептидов, находящихся во фракциях, определяли установлением аминокислотной последовательности. У. Выделение пептидов избирательным связыванием с инертным носителем УД. Избирательное выделение гомосер_ин.-сол,ер.жащих_ пептидов Для определения С-концевой аминокислотной последовательности, бромциановые пептиды CBG-8, CBG-II, CBG-14 И CBG-18, В количестве 50-100 нм подвергали ферментативному гидролизу стафи-локкоковой протеазой, или термолизином, или трипсином по стандартному методу ( 98). Полученный гидролизат ковалентно связывали с р -аминоэтил-N-у-аминопропил стеклом (AEAPG) по методу как указано в П.6. Заполняли реакционную колонку носителем со связанным пептидом, тщательно промывали метанолом, дихлорэтаном, трифторуксусной кислотой и снова метанолом, собирая растворители в реакционную ячейку, в которой проводилась иммобилизация пептида. Растворители упаривали досуха на роторном испарителе, остаток растворяли в аммиачной воде рН 9,0 и обессоливали на сефадек-се G-25. Несвязанные пептиды подвергали дальнейшему разделению.
Пептид, ковалентно связанный с AEAPG подвергали автоматической деградации по Эдману на твердофазном секвенаторе. Пептиды LTiv-з, LTI7-13, LTIV-20 и CBG-15, содержащие лизин в середине полипептидной цепи в количестве 5Ф-І00 нм, ковалентно связывались с APG как указано в П.5 и подвергались деградации по Эдману на твердофазном секвенаторе. После отщепления лизинового остатка пептид вымывался безводной трифторуксусной кислотой. Так как местоположение лизина в цепи неизвестно, то для предотвращения разрушения вымываемого пептида при конверсии, превращение анилинотиоазолинона в фенилтиогидантоин проводили 20 % трифторуксусной кислотой при температуре 60 С в течение 15 мин. Для обнаружения снятого с колонки пептида, определяли к-концевую аминокислоту дансилышм методом. Выделенные пептиды анализировали ручным методом Эдмана. УІ. Блокирование первичных аминогрупп пептидов ФЛУОРЄ- скамином Блокирование первичных аминогрупп пептидов неспецифического расщепления G-фактора, полученных при гидролизе по связям Asp-Pro проводили флуорескамином в реакционной ячейке секвенатора. 20-30 нм продуктов кислотного гидролиза EP-G высушивали в реакционной ячейке секвенатора, добавляли 2-3 мг флуорескамина в 400 fJ абсолютного ацетонитрила и 200 ОД М квадрольного буфера. Продували азотом и термостатировали при 55 С в течение 15 мин. Затем реакционную смесь высушивали, а избыток флуорескамина и квадрол удаляли длительной промывкой (10-20 мин) этил-ацетатом. Деградацию по Эдману начинали с реакции карбомилирова-ния и проводили 15-40 циклов отщепления. Идентификацию фенилтио-гидантоинов аминокислот проводили как указано в П.2. Деградацию по Эдману после обработки анализируемого пептида флуорескамином необходимо начинать с реакции карбомилирования, а не с реакции отщепления,как указано в (99), так как под действием безводной кислоты приходит разрушение пролинового остатка и следующая за Pro аминокислота появляется при идентификации.
