Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение процесса передачи нервного импульса на молекулярном уровне является одной из наиболее актульных задач современной нейрохимии. Существенная роль в этом процессе принадлежит нейрорецепторам (HP), представляющим собой трансмембранные белки, участвующие в передаче сигнала от одной нервной клетки к другой. Знание пространственной организации HP и, в особенности^ структуры лиганд-связывающих участков, является ключевым моментом в установлении механизма их функционирования. Использование для установления структуры HP физико-химических методов, таких как рентгеноструктурный анализ или ядерный магнитный резонанс, ограничено как природой рецепторов (трансмембранные белки, редко поддающиеся кристаллизации), так и их размерами (молекулярная масса от нескольких десятков до сотен килодальтон). Лишь использование электронной микроскопии позволяет в большинстве случаев установить общую форму молекулы или взаимное расположение ее достаточно крупных доменов.
Таким образом,встает задача получения информации о структуре HP с помощью иных методов. Большой объем информации к настоящему времени получен с использованием методов иммунохимии, генетической инженерии (направленный мутагенез и конструирование химерных белков) и аффинной модификации. Фотоаффинная модификация, при проведении которой высокореакцнонные соединения генерируются непосредственно в комплексе лиганд-рецептор, позволяет в принципе идентифицировать не только определенные фрагменты аминокислотной последовательности HP, формирующие его функциональные домены, но также установить отдельные аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании лиганда. Следует отметить, что фотоаффинная модификация широко используется для исследования взаимодействия макромолекул. Однако, в случае белок-белковых взаимодействий это исследование как правило ограничено использованием одного типа метки, расположение которой в аминокислотной последовательности не всегда точно установлено. При использовании фотоактивируемых производных низкомолекулярных лигандов непептидной природы в ряде случаев удалось установить расположение функциональных доменов в аминокислотной последовательности HP, однако такие лиганды доступны не для всех типов рецепторов. Более рациональным представляется использование для этих целей пептидно-белковых лигандов HP, содержащих фотоактивируемые группы в строго определенных положениях аминокислотной
последовательности. Следует отметить, что к настоящему времени идентифицирован целый ряд немропептидных рецепторов, к которым в частности относятся G-белок-зависимые рецепторы тахикининов. Введение фотоактивируемых групп в различные положення эндогенных пептидов позволяет не только идентифицировать функциональные домены рецептора, но и установить их взаимное расположение. В этом плане особый интерес представляют полипептидные нейротоксины, широко использующиеся для исследования различных HP. Так, постсинаптнческие нейротоксины змей, являющиеся конкурентными антагонистами никотинового ацетилхолннового рецептора, представляют собой небольшие белки (60-75 аминокислотных остатков) с жесткой структурой, стабилизированной 4-5 дисульфндными связями. Использование фотопроизводных этих токсинов, содержащих метки в различных положениях, может дать ценную информацию о структуре лиганд-связывающего участка рецептора.
В настоящей работе предложен подход к установлению структуры активных центров нейрорецепторов, основанный на использовании фотоактивируемых производных белково-пептидных лигандов, содержащих фотометки различного типа в идентифицированных положениях молекулы, и локализации образующихся высокоспецифичных ковалентних связей лиганд-рецептор. Предложенный подход использован для исследования рецепторов различных типов: олигомерных лнганд-управляемых ионных каналов, G-белокзависимых рецепторов, а также рецепторов, состоящих из субъединиц различного размера.
Исследование никотинового ацетнлхолинового рецептора проводилось совместно с лабораторией проф. Ф.Хухо (Свободный университет Берлина), а масс-спектрометрический анализ продуктов пришивки токсина к рецептору выполнен совместно с лабораторией проф. Р.Кауфмана (Университет Генриха Гейне, Дюссельдорф). Автор выражает свою глубокую признательность проф. Хухо и проф. Кауфману.
Цель и задачи работы. Основной целью исследования явилась разработка метода многоточечной фотоаффинной модификации для изучения структуры нейрорецепторов. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Осуществить синтез фотоактивируемых производных лигандов, содержащих фотоактивнруемые группы различного типа в вдентифпцнрованных положениях аминокислотной последовательности, и разработать метод введения радиоактивной метки, не затрагивающий лабильные аминокислотные остатки.
-
Для каждой серии производных разработать оптимальные условия образования ковалентных поперечных сшивок лиганд-рецептор.
-
Разработать условия расщепления ковалентного комплекса и выделения пептидов, содержащих ковалентно связанные фрагменты лиганда и рецептора.
4. С использованием современных аналитических методов установить
структуру выделенных пептидов.
Предложенный подход был использован для исследования следующих рецепторов: никотинового ацетилхолннового рецептора электрического органа ската Torpedo californica, рецептора вещества Р мозга крысы, а также потенциалзависимого натриевого канала мозга крысы.
Научная новизна и практическая значимость работы. Разработан подход к установлению структуры функциональных доменов HP с применением фотоактивируемых производных пептидно-белковых лигандов, содержащих фотометки различного типа в идентифицированных положениях аминокислотной последовательности. Получено большое число производных нейротоксинов змей и скорпионов, а также тахикининового пептида вещества Р, и исследовано их взаимодействие с соответствующими рецепторами.
В случае никотинового ацетилхолннового рецептора впервые установлено, что характер мечения субъединнц зависит не только от положения метки в молекуле токсина, но и от природы выбранной метки. С использованием различных производных токсина показано, что лигандсвязьшающне участки рецептора находятся в областях контакта субъединиц.
Впервые показано наличие в ацетилхолиновом рецепторе двух участков связывания а-конотоксина GI, при этом участок, обладающий высоким сродством к конотоксину, включает у-субъединицу, а низкоаффинный - 8-субъединицу.
Предложен метод локализации фотоактивируемых групп в молекуле лиганда с использованием масс-спектрометрнн. Метод MALDI-масс-спектрометрии использован также для установления структуры кросс-сшитого пептида рецептора, при этом установлено включение метки в остаток 8-субъдиницы А1а2б8, входящий в предполагаемый трансмембранный фрагмент М2.
На основании полученных данных установлено расположение молекулы токсина в одном из участков связывания на расстоянии не менее 40 А от экстрацеллюлярной поверхности рецептора.
Предложенный метод может применяться для исследования различных рецепторов соединений пептидно-белковой природы. Полученная информация о структуре активных центров рецепторов может быть использована для конструирования лигандов с заданными свойствами и создания на их основе лекарственных препаратов, обладающих высокой специфичностью.
Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: VI СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков (Гамбург, 1987), V Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Рига, 1988 ), II Пептидном форуме (Нанси, 1988), Коллоквиуме UCLA "Синтетические пептиды: подходы к биологическим проблемам" (Парк Сити, 1988), IX Советско-индийском симпозиуме по химии природных соединений (Рига, 1989), I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989), Конференции "Нейропептиды и иммунопептиды: передатчики в нейроиммунной системе" (Нью-Йорк, 1989), Международном симпозиуме по рецепторам и ионным каналам (Западный Берлин, 1989), IX Европейском симпозиуме по животным, растительным и микробным токсинам (Лоохусалу, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллинн, 1990), IV СССР-ФРГ симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991), X Всемирном конгрессе по животным, растительным и микробным токсинам (Сингапур, 1991), II Российско-израильском симпозиуме по пептидам и белкам (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва, 1992), Международном симпозиуме "Синапсы и рецепторы. Молекулярные перспективы" (Кембридж, 1992), 9 Конференции Европейского общества нейрохнмнн (Дублин, 1992), 14 Бланкенезской конференции "Модуляция сигналов в нервных системах" (Гамбург, 1994), Конференции "Нейрональные никотиновые рецепторы: разнообразие, функции и патолопія" (Страсбург, 1994), Конференции "Холинергическин синапс: структура, функция и регуляция" (Балтимор, 1994), 23 Конференции Федерации европейских биохимических обществ (Базель, 1995), 21 Симпозиуме ЕМВО (Европейской организации молекулярной биологии) "Структура и функции белков" (Гейдельберг, 1995), З ШРАС симпозиуме по бноорганической химии (Дагомыс, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 статей в отечественных и зарубежных журналах и сборниках.
