Содержание к диссертации
Введение
4 Криоэлектрокная микроскопия «одной частицы» в исследовании структуры макромолекул 7
4. 1 Метод криоэлектронной микроскопии «одной частицы» и его перспективы 7
4.1.1 Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы» 8
4.1.2. Суть метода крио-ЭМ «одной частицы» 11
4.1.3. Микроскопы, различия и особенности 15
4.1.4. Оценка качества полученных микрофотографий 17
4.1.5. Выбор частиц 17
4.1.6. Коррекция частотно-контрастной характеристики 20
4.1.7. Выравнивание частиц (Alignment) 23
4.1.7.1. Выравнивание частиц без использования образца 24
4.1.7.2. Выравнивание с использованием репроекций, полученных на базе известной трехмерной реконструкции 25
4.1.8. Множественный статистический анализ 26
4.1.8.1. Сжатие данных и их классификация после выравнивания частиц. 26
4.1.9. Определение углов и построение трехмерной модели 28
4.1 10. Интерпретация данных крио-ЭМ путем сравнения с данными рентгеноструктурного анализа 34
4.1.11. К вопросу о разрешении в методе крио-ЭМ 3 5
4.1.12. Ограничения метода и способы их преодоления 37
4.2. Применение крио-ЭМ в исследовании структуры рибосом и рибосомных комплексов 38
4.2.1. Инициация трансляции 42
4.2.2. Элонгация трансляции 43
4.2.3. Терминация трансляции 46
4.2.3.1. Декодирование стоп сигнала и высвобождение (путем активации гидролиза) растущего полипептида с пептидил-тРНК в Р участке 48
4.2.3.2. Фактор терминации второго класса вызывает высвобождение факторов терминации первого класса 57
5. Исследование различных функциональных комплексов рибосом методом криоэлектронной микроскопии 59
5.1. Изучение структурных перестроек в мутантных 50S субчастицах рибосом E.coli 59
5.2. Изучение структуры комплекса белка FfhM с рибосомой 62
5.3. Изучение структуры комплекса фактора терминации RP2 с рибосомой 64
5.4. Изучение структуры комплекса фактора терминации RF3 с рибосомой 72
6. Материалы и методы 82
Выделение комплекса FfliM-рибосома методом аффинной хроматографии 92
Выводы 94
Список литературы 95
- Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы»
- Выравнивание частиц без использования образца
- Декодирование стоп сигнала и высвобождение (путем активации гидролиза) растущего полипептида с пептидил-тРНК в Р участке
- Изучение структуры комплекса белка FfhM с рибосомой
Введение к работе
Прорывы в той или другой области знаний часто связаны с созданием принципиально новых методов исследования. Одним из ярких примеров является электронная микроскопия, оказывающая большое влияние на развитие химии и биологии. Человек всегда хотел быть богом, он хотел творить и создавать, а как можно что-либо создавать, не познав, как оно устроено?! Поэтому современная наука старается понять строение всего живого, понять, как все организовано и из чего состоит. Мы все дальше и дальше проникаем в суть процессов, которые идут в клетке — элементарной единице всего живого. Мы уже знаем многое о строении клетки и клеточных органелл, и кажется, что осталось дело за малым - понять, как же устроены отдельные молекулы внутри клетки, а узнав их строение, попробовать понять, как эти сложные молекулярные ансамбли работают вместе. В данной работе показаны возможности одного из современных методов исследования структуры макромолекул -криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) для изучения структуры и функции макромолекул на примере рибонуклеопротеидного комплекса - рибосомы. Большая часть обзора литературы посвящена описанию этого метода.
Прокариотическая рибосома, седиментирующая как 70S частица, состоит из двух субъединиц - большой, с коэффициентом седиментации 5 OS, и малой, с коэффициентом седиментации 30S. Каждая из субъединиц на 60% (по массе) состоит из РНК. Малая содержит декодирующий центр, координирующий правильные взаимодействия между матричной РНК (мРНК) и транспортной РНК (тРНК), что определяет аминокислотную последовательность синтезируемого на рибосоме белка. Большая субъединица катализирует образование пептидной связи.
Рибосома была открыта в 50-х годах, и тогда никого не удивило, что помимо РНК она содержит еще и белки. Поскольку она катализирует биосинтез белка, а ферменты являются белками, то все бьшо ясно - роль рибосомных белков заключается в катализе образования пептидной связи. Представления о роли и функции рибосомной РНК (рРНК) и белков были, по мере накопления биохимических данных, пересмотрены. После установления структуры рибосомы и ее субчастиц с атомным разрешением стало понятно, что рибосома является рибозимом, в то время как белки помогают поддерживать компактную структуру рРНК. Тем не менее, знания структуры рибосомы явно не достаточно для понимания механизма трансляции. Дело в том, что процесс синтеза белка многостадиен, причем в каждую стадию вовлечены определенные белковые факторы. Как же работают эти факторы, как они взаимодействуют между собой!? Получить ответ на этот вопрос с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) в большинстве случаев не удается.
В то же время криоэлектронная микроскопия формирует отдельное направление в изучении молекулярных ансамблей биологических молекул, которые часто бывают либо слишком велики, либо слишком лабильны для изучения их методом РСА. Важно, что крио-ЭМ позволяет характеризовать перестройки в макромолекулярньгх комплексах и таким образом изучать динамику биологических процессов. Примеры таких исследований для рибосомных комплексов рассматриваются в обзоре литературы и этому посвящена диссертационная работа.
Принцип криоэлектронной микроскопии «одной частицы»
Как особый метод крио-ЭМ используется уже в течение 20 лет [[2]; [3]]. Сам же метод был изобретен около 40 лет назад Тэйлором и Глайсером (Taylor & Glaeser). Изначально крио-ЭМ использовали только для изучения высоко упорядоченных образцов, таких, как скрученные белковые волокна (актин), двумерные кристаллы (например, кристаллы с одним или двумя липидными слоями), и высоко симметричных структур, таких, как вирусы. Только образцы такого рода позволяли получать результаты с хорошим разрешением. Хотя при исследовании вышеперечисленных объектов были достигнуты большие успехи, для белков с нормальными размерами рентгеноструктурный анализ был предпочтительней. При исследовании двумерных кристаллов метод крио-ЭМ столкнулся с непреодолимыми трудностями, такими как нарушения в структуре двумерных кристаллов и проблемы при использованием больших углов ячейки, используемой в криоэлектронной микроскопии в так называемой «серии углов» (tilt series). Наиболее перспективным для изучения методом крио-ЭМ оказались мембранные белки, но, к сожалению, лишь в нескольких работах удалось достичь атомарного разрешения. Для высокомолекулярных комплексов одинаково трудным оказалось получение как двумерных (пригодных для крио-ЭМ ), так и трехмерных (пригодных для РСА) кристаллов.
Все попытки разрешить структуру рибосом, используя микроскопию двумерных кристаллов [[4], [5]], провалились из-за плохой упорядоченности кристаллов. Потенциально более широкая область применения крио-ЭМ была создана после разработки так называемого метода реконструкции «одной частицы», для использования которого нужно иметь много копий одной молекулы. Этот метод [[6], PL [8]. [9]] и его предшественник [[10] [11], [12], [13], [14], [15], [16]] были разработаны изначально для образцов, приготовленных методом негативного контрастирования, но успех метода был ограничен артефактными включениями в процессе приготовления образца. При негативном контрастировании, которое использовалось до изобретения крио-ЭМ, водный образец смешивали с 1-2% раствором соли тяжелого металла и высушивали на воздухе. На микроскопической ячейке молекулы, приготовленные таким образом, бьши хорошо видны, а ионы тяжелого металла повышали контраст на электронной микрофотографии. Рис. 1. А. Общая схема плунжерного устройства для быстрой заморозки образца. Б. Общий вид плунжерного устройства. В, Г. Мгновенная заморозка образца.
Однако, кроме того, что при этом нельзя было увидеть разницу в электронной плотности внутри молекулы, негативное контрастирование вело и к изменению формы молекулы. В современном варианте метод предполагает быстрое охлаждение образца в жидком этане (рис. 1): Образец, нанесенный на ячейку для крио-ЭМ, висящую на самом кончике пинцета, быстро помещают в жидкий этан, находящийся при температуре жидкого азота (рис. 1). Этан обладает высокой теплопроводностью, поэтому образец замерзает мгновенно, благодаря чему образуется аморфный лед, который обладает некоторыми общими оптическими свойствами с жидкой водой. Важно, что при этом не образуются кристаллы льда, которые могли бы повредить молекулу. Прогресс, достигнутый слиянием двух методов, крионегативного контрастирования и криоэлектронной микроскопии «одной частицы», может быть оценен при сравнении карт электронной плотности 70S рибосом E.coli, полученных методами негативного контрастирования и крио-ЭМ «одной частицы» [[17]]. В первом случее структура получилась рыхлой, без четкого межсубъединичного пространства; тогда как во втором - глобулярная и с четким разделением между 30S и 5 OS субчастицами. Другой пример дает сравнение карт электронной плотности для гемоцианина, полученных негативным контрастированием и методом крио-ЭМ «одной частицы» {[18]]. Они различались, по меньшей мере, в два раза, если считать по отношению к криоэлектронной ячейке, что объясняется коллапсом молекул после негативного контрастирования и высушивания на воздухе.
Метод трехмерной реконструкции «одной частицы» с использованием крио-ЭМ на сегодняшний день выделяется среди других методов трехмерной реконструкции молекул. Различные подходы в применении метода для реконструкции различных макромолекулярных комплексов описаны в монографиях Франка, Орловой, Сайбул Ц19],[20],[2И]. Метод крио-ЭМ «одной частицы» рассматривает множество копий одной молекулы, которые в идеальном случае идентичны друг другу.
Для получения трехмерной реконструкции с высоким разрешением необходимо получать микрофотографии при низком значении дефокуса, т.е. при разном расстоянии от реального фокуса линзы, однако, при работе с такими микрофотографиями появляется проблема локализации частиц на снимке из-за низкого контраста. Эту проблему можно решить, если увеличить значение дефокуса (рис. 4), но чем больше это значение тем меньшее разрешение мы получим после реконструкции. Поэтому обычно используют значения дефокуса от 0.5 до 2 цм. При определении значения дефокуса часто возникают ошибки ввиду того, что нулевое значение фокуса определяется каждый раз вручную. Изображение, полученное в электронном микроскопе, характеризуется частотно-контрастной характеристикой (ЧКХ), график которой представляет из себя в идеальном случае незатухающую волну. При реконструкции частиц мы можем использовать только положительные значения этой волны, поэтому для получения полной информации об изображении мы проводим коррекцию ЧКХ. Данная процедура позволяет не только перевести отрицательные значения ЧКХ в положительную область, но и скорректировать значение дефокуса, если оно было определенно неверно. Рассмотрение процедуры коррекции ЧКХ будет в одном из следующих разделов литературного обзора.
Выравнивание частиц без использования образца
После того, как частицы отобраны, они должны быть выровнены. Суть данной операции заключается в том, чтобы выровнять положение частицы на микрофотографии так, чтобы центр микрофотографии совпадал с центром масс частицы. Это необходимо для последующего анализа. Однако, вопрос заключается в том, как же выбрать центр масс всех частиц, ведь разные проекции имеют разный центр масс. Эту проблему легко решить, если имеется какая-либо аналогичная реконструкция молекулы. Если такой реконструкции нет, то необходимо провести т.н. «выравнивание частиц без использования образца» (Reference free alignment). Его задачей является нахождение общего центра масс для всех частиц, выравнивание всех частиц относительно этого центра и подготовка данных к последующему анализу методом мультивариационного статистического анализа (Multivariate Statistical Analysis (MSA)). Для нахождения общего центра масс все частицы суммируются, и выравнивание проводится относительно полученного общего изображения (общей массы). После окончания первого раунда начинается второй, который повторяет первый, причем берется положение частиц, которое они имели после первого раунда.
Процесс выравнивания частиц резко упрощается в том случае, если мы располагаем готовой моделью. Используя предварительно центрированную готовую модель, можно получить ряд проекций, обладающих центром масс молекулы. Следует заметить, что центр масс молекулы в этом случае будет отличаться от центра масс всех частиц, именно поэтому выравнивание без образца используют только как первый шаг для получения первой структуры, позволяющей затем получить первые проекции. Весь набор частиц теперь проходит выравнивание относительно проекций. Конечно же, не все проекции будут совпадать с ориентациями частиц, а некоторые не будут совпадать совсем. Между тем уже на уровне выравнивания можно будет говорить о преимущественной ориентации частиц, так как в процесс выравнивания с использованием репроекций (Multi Reference Alighnment (MRA)) включена операция по определению взаимного соответствия между проекцией и частицей. Таким образом, уже на уровне выравнивания мы классифицируем частицы, что в последующем приносит свои плоды при построении структуры. В случае симметричного объекта обычно используют 3-Ю проекций, если объект исследования не обладает симметрией (рибосома, РНК полимераза и т.д.), нужно использовать для выравнивания больше проекций (так, для рибосомы оптимальным считается 187 проекций). В такой ситуации возникает необходимость проанализировать результаты выравнивания, для чего данные выравнивания подвергаются множественному статистическому анализу (Multivariate Statistical Analysis (MSA).
Метод множественного статистического анализа (МСА) был разработан в 1981 году ван Хиллом и соавторами (Marin van Heel et. al.) [[13]] и сейчас широко используется во многих программах. С помощью МСА изображения частиц представляются как комбинации «собственных векторов» (eigenvector) или Первые 24 из 69 «собственных» изображений, полученных в результате MSA. Данные изображения определяются вектором в 69-мерном пространстве, что приводит к значительной компрессии данных. собственных изображений (eigenimages) (рис. 8). Это позволяет уменьшить общий объем данных и ускорить их обработку. Полное математическое описание метода можно найти в работе Борлонда и ван Хилла (Borland and van Heel) [[25, 40]].
Классификация частиц на характерные виды (классы) нуждается в сравнении каждой из частиц с каждой, что приводит к повышенным требованиям к процессору и объему памяти компьютера. Вектора вдоль осей уменьшенного пространства определяют т. н. «собственные изображения» (eigenimages). В результате этой операции каждая частица (изображение) может быть представленна как набор координат в данном пространстве, или, иначе говоря, линейной комбинацией «собственных изображений» системы.
Далее следует классификация изображений. Это подразумевает комбинирование изображений с наибольшим индексом схожести. С помощью данного индекса можно построить дерево «схожести», или дендрограмму «индекса схожести» (рис. 9). Данное древо может быть построено в соответствии с несколькими критериями, при этом наиболее часто используется критерий Варда (Warda) [[41]]. Этот критерий основан на принципе минимального добавления изменений в класс. Все изображения сортируются по классам с помощью «иерархической преобладающей классификации» (hierarchical ascendant classification). Изначально каждое изображение генерирует свой класс, дальше изображения с минимальными различиями (максимальным «индексом похожести») сливаются в один класс. Этот процесс идет до тех пор, пока все частицы не попадут в один класс. Для того, чтобы избежать суммирования всех изображений, нужно определить количество классов из расчета, что в каждый класс входит от 10 до 30 изображений. Причем, на первых этапах выбирается меньшее количество классов для того, чтобы получить более четкую модель (форма и размер, но не детали), при каждом последующем шаге количество классов возрастает.
Одним из наиболее трудных этапов во всем процессе трехмерной реконструкции, когда неизвестна структура молекулы, является определение ориентации частиц на снимке. Проблема усложняется наличием большого количества шумов на фотографии, которые возникают из-за низкой дозы радиации, необходимой для минимизации повреждений. Для решения этой проблемы применяют несколько методов:
В методе «произвольных углов» («random-conical tilt») [[42]] используют различные углы наклона ячейки с образцом в процессе получения фотографий. При этом одну и ту же область приходится снимать два раза, первый раз при нулевом угле ячейки для крио-ЭМ, затем ячейку поворачивают вплоть до 60. После выбора частиц на микрофотографии с нулевым углом наклона ячейки для крио-ЭМ устанавливается соответствие с микрофотографией при другом произвольном значении угла наклона. Таким образом, мы получаем изображение одной и той же частицы (произвольно выбранной на двух микрофотографиях) под двумя разными углами. В дальнейшем это помогает установить соответствие между частицей и ее ориентацией при реконструкции молекулы, кроме того данный метод позволяет взглянугь на частицу с разных сторон, под углом, определяемым углом поворота криоэлектроннои ячайгат, еще до финальной трехмерной реконструкции. Метод «общих линий» («method of common lines»). Метод «общих линий» основан на принципе «общих линий», сформулированном Краузером (Crowther) [[43]]. В данном методе [[9], [43], [44];] частицы сначала классифицируются, затем различные классы представляются как различные проекции трехмерной молекулы. Далее, путем сравнения «общих линий» находят ориентации для каждой из частиц.
Декодирование стоп сигнала и высвобождение (путем активации гидролиза) растущего полипептида с пептидил-тРНК в Р участке
Наличие гена, кодирующего факторы терминации первого класса, жизненно необходимо для клетки. Даже такой организм, как Mycoplasma genitalium, геном которого содержит только минимально необходимый для выживания набор генов, имеет ген фактора терминации первого класса [[87]; [88]]. У него сохранился только фактор терминации RF1, так как кодон UGA, в других организмах узноваемый фактором терминации RF2, декодируется тРНКТф [[89]]. Явление, когда стоп кодон меняет свою функцию на кодирующую, часто встречается в органнелах [[90], [91]]. В митохондриях дрожжей кодон UGA кодирует триптофан, при этом один фактор терминации узнает как UAG, так и UAA стоп кодоны [[92]].
В бактериях E.coli выделяют два фактора терминации первого класса - RF1 и RF2. Фактор терминации RF1 узнает стоп кодоны UAA, UAG, фактор терминации RF2 -UAA и UGA [[93], [94]]. Белки RF1 и RF2 кодируются генами prfA и рг/В, соответственно [[95], [96]], и имеют значительное сходство в аминокислотной последовательности. Основываясь на предсказании вторичной структуры Пел и соавторы (Pel at al) выделили в факторах терминации 5 доменов [[97]], в то время как Ито (Ito) и соавторы - 7 доменов [[98]].
Позже, на основе РСА данных для факторов терминации первого класса стало принято вьщелять 4 домена [[99]]. Два домена образуют участок для декодирования и отделены от домена, несущего функцию гидролиза пептида [[100], [101]]. N-домен (домен 1) состоит из 4 а-спиралей, которые формируют жесткую структуру, похожую на домен I в факторе RRP (факторе рециркуляции). Из рентгеноструктурных данных следует, что расстояние между предполагаемыми активными центрами в структуре RF2 - 23 А, что существенно меньше 72 А, определенных для активных центров тРНК. Данное противоречие не могло быть решено без помощи крио-ЭМ: одновременно появились две работы, в которых было показано, что фактор терминации RF2 изменяет свою структуру при связывании с рибосомой [[102], [103]].
Фактор терминации eRFl бьш впервые обнаружен в 1971 году [[104]], выделен в 1974 году [[105]]. В 1977 году показали, что он узнает все три стоп кодона [[106]]. Однако сравнительно недавно был корректно определен ген, кодирующий данный белок [[107]]. Стандартный метод сравнения аминокислотных последовательностей не выявил гомологии между прокариотическими факторами терминации RF1, RF2 и эукариотичкеским eRFl [[107]]. С другой стороны, фактор терминации aR.Fl из археобактерий обладает большой гомологией с eRFl, и даже содержит несколько гомологичных мотивов [[108-110]]. Более того, aRFl из Methanococcus jannaschii проявляет активность на рибосомах млекопитающих и узнает все три стоп кодона [[111]], было даже высказано предположение, белки aRFl и eRFl произошли от одного общего белкового предка [[112]].
РСА анализ показал, что человеческоий eRFl имеет структуру несиметричной буквы Y [[113]]. Стебель (домен 1) несет NIKS мотив, участвующий в узнавании стоп кодона, домен 2 несет консервативный GGQ мотив, который находится на кончике петли и учавствует в гидролизе пептида на птРНК. Домен 3 ответственен за взаимодействие с фактором терминации второго класса - eRF3 [[114]]. Если измерить расстояние между NIKS и GGQ мотивами eRF3 то получается, что оно равно 100 А, в то время, как между антикодоном тРНК и ССА концом только 75 А [[99]].
Существуют неоспоримые доказательства того, что фактор терминации узнает стоп кодон на мРНК. Прежде всего - это данные по химическому сшиванию, показавшие, что нуклеотид в первом положении стоп кодона [[115], [116]], в положении +4 от начала стоп кодона [[117]] и в положениях +5 и +6 [[118]] участвуют в образовании сшивок с фактором терминации.
Поиски домена, несущего декодирующую функцию, начали с генетического скрининга мутантных форм RF2. Первой обнаружили мутацию Е167К, в результате которой фактор узнавал все три стоп кодона, хотя специфичность такого узнавания остается вопросом, так как и некоторые значимые кодоны узнавались как терминирующие [[119]]. После этого была проведена серия изящных экспериментов, в которых идентифицировали мотивы PAT и SPF для RF1 и RF2, соответственно, эти мотивы располагались в третьем домене факторов [[120], [121]]. Первая и третья позиции в мотиве определяют второе и третье положения стоп кодона, так, например, мотив SXT узнает UGG кодон, а мотив PXF узнает UAA [[120]]. Положение узнающих стоп кодон мотивов было сюрпризом для сторонников концепции мимикрии, потому что по рентгеноструктурным данным казалось, что декодирующий мотив должен быть в домене 1, так как расстояние между предполагаемым местом декодирования в первом домене и GGQ мотивом было 64 А, что достаточно близко к 75 А, наблюдаемым в тРНК. Более того, если попытаться вписать рентгеноструктурные данные с правильным расположением декодирующего мотива в рентгеноструктурную карту рибосомы, то видно, что возникают точки пересечения последовательности белка (фактора терминации) и рРНК, что недопустимо. Более того, при таком расположении RF2 GGQ мотив находится на расстоянии 60 А от пептидилтрансферазного центра рибосомы [[99]].
Многие мутации, супрессирующие действие фактора терминации, располагаются недалеко от консервативного мотива [[122], ]. Особый интерес представляют две мутации в RF1 - P233I и R231K. Эти мутанты, как было показано в экспериментах in vivo [[123]] и in vitro [[124]], имеют пониженное сродство к рибосоме, которое может быть восстановлено вторичной мутацией в спирали 44 16S рРНК [[125]]. Четыре из выделенных вторичных мутаций в спирали 44 также вовлечены в корректное позиционирование мРНК: тРНК в процессе декодирования [[126]]. Три из четырех вторичных мутаций нарушают спаривание нуклеотидов, что ведет к устойчивости к паромицину, место связывания которого затрагивает нуклеотиды в данной области 16S рРНК [[127], [128], [129]]. Пятая мутация располагается в «переключающемся» районе спирали 27, который важен для точности трансляции [[130]]. Исходя из всего вышесказанного, можно предположить, что в узнавание кодона может играть роль не только узнавание кодона белком в А участке 30S субъединицы, но и сумма сложных взаимодействий, в результате которых отслеживается положение стоп кодона с помощью спирали 44 16S рРНК.
Переназначение стоп кодона в бактериях может привести к потере одного из факторов терминации, как было показано на примере Mycoplasma genitalium для фактора терминации RF2, Такое событие невозможно в эукариотических организмах только потому, что фактор терминации eRFl узнает все три стоп кодона. Следовательно, любые изменения в последовательности, отвечающей за узнавание кодона, должны приводить к изменению специфичности фактора. Петля в районе первого домена была первым кандидатом на роль узнающей последовательности. Так, TAS мотив в этой петле фактора терминации eRFl консервативен у всех организмов, кроме Tetrahymena thermophila, в данном организме произошла замена Т на К [[121]]. Вторым кандидатом был NIKS мотив, который также консервативен в факторе терминации eRFl всех эукариот за исключением тех, что используют измененный генетический код, например, в организме Tetrahymena. В данном организме кодоны UAA и UAG кодируют глутамин, и, соответственно, консервативный домен NIKS поменялся на NIKD [[131]].
Изучение структуры комплекса белка FfhM с рибосомой
Другим интересным объектом для исследования передачи сигнала между центрами рибосомы является изучения взаимодействия между частицей узнающей сигнал (Signal Recognition Particle (SRP)) и рибосомой в прокариотяческих организмах. Данная частица состоит из белка Ffh и 4.5S РНК. В белке Ffh выделяют три структурных домена: N, G, М. Белок Ffh имеет большое сходство с эукаротическим аналогом белком SRP54, который, как было показано, взаимодействует с сигнальным пептидом, аминокислостной последовательностью, отвечающей за транспорт белков через мембранные структуры клетки, и 7.5S РНК, являющуюся неотъемлимым компонентом в составе эукариотической SRP [[153]]. При взаимодействии SRP с рибосомой процесс трансляции останавливается, что было показано для эукариот. Существует ли остановка трансляции и как при этом передается сигнал у прокарнотических организмов, пока не понятно. В нашей лаборатории был разработан метод выделения комплекса белка FfhM с рибосомой (рис. 20). Удаление доменов NG белка Ffh препятствует его связыванию с рецептором, расположенным на мембране, но не влияет на процесс связывания белка с рибосомой и сигнальной последовательностью, приводя таким образом к накоплению комплекса рибосомы с белком FfhM в клетке. Для специфического выделения комплекса при помощи аффинной хроматографии мы создали плазмиду, в которой содержался ген, кодирующий химерный белок (рис, 20Д), N-концевой домен которого содержал FfhM домен белка Ffh, а С-концевой домен -аффинный хвост, представляющий собой двойной домен Z белка золотистого стафилококка S. Aureus. ZZ-домен специфически взаимодействует с константной частью белка иммуноглобулина IgG. Для отщепления данной последовательности и элюции комплекса, содержащего химерный белок, мы проклонировали сайт расщепления TEV-протеазой (Asp-Leuyr-Phe-Gln-Gly). В нашей лаборатории с помощью аффинной хроматографии был выделен такой комплекс и его структура исследована методом криоэлектронной микроскопии. В процессе анализа
Полученных данных мы получили удивительную картину - почти все классы были ориентированны в одну сторону (рис. 21). После детального анализа и сравнения с данными о структуре рибосомы дикого типа мы показали, что белок FfhM связывается с рибосомой в районе рибосомного белка L23, который располагается у выхода из пептидного туннеля, по которому движется растущая полипептидная цепь, что было показано в экспериментах по фотоафинному сшиванию [154]. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что именно белок Ffh ответственен за узнавание сигнального пептида в момент выхода последнего из туннеля. Комплекс фактора терминации RF2 с рибосомой, содержащей тРНК в Р участке и мРНК со стоп кодоном в А участке, для исследования методом криоэлектронной микроскопии был предоставлен лабораторией проф. М. Эренберга (Enrenberg М, Department of Cell and Molecular Biology, BMC, Uppsala University, Box 596, 75124 Uppsala, Sweden), Нам удалось получить структуру этого комплекса с разрешением 14 А. Для детальной интерпретации полученных данных было проведено встраивание кристаллических структур 70S рибосомы Thermus thermophilus [[155]] и фактора терминации RF2 E.coli [[99]] в электронную карту плотности. Наиболее полного совмещения структуры фактора терминации RF2 и электронной плотности удалось добиться путем перемещения доменов 1 и 3 фактора, в то время как домены 2 и 4 выступали как функциональная единица (один супердомен).
Домены 2 и 4 формируют структуру вытянутой формы, которая великолепно вписывается в электронную плотность, соединенную с декодирующим сайтом рибосомы (рис. 22А, 22Б). Небольшое смещение домена 1 (с испольованием Gly 121, как точки поворота) позволяет точно вписать домен 1 в электронную плотность, которая простирается от места связывания фактора терминации RF2 до области «головы» 30S субчастицы (рис. 22Б).
Оставшийся домен 3 может быть вписан в электронную плотность, которая находится между декодирующей областью и ПТЦ. Вписывание этого домена было произведено с помощью изменения положения петель, расположенных до и после домена 3. Эти петлн чувствительны к действию протеаз [[101], [156]], обладают высоким температурным фактором в кристаллической структуре [[99]] и содержат Данные о месте посадки фактора терминации RF2 на рибосоме, полученные с помощью криоэлектронной микроскопии, кореллирует с результатами, полученными методом иммунолокализации [[157]] и сайт-направленного «пробинга» [[138]].
Домен 1 является своеобразным мостом, связывающим большую и малую субчастицы (рис. 22 А, 22Б). При полученном разрешении можно видеть трехспиральный участок домена 1, который вытянут по направлению к спирали 33 16S рРНК (рис. 22Б). Другая часть домена 1 обвивает N-концевую область белка Lll 50S субчастицы, а так же контактирует со спиралью 43 и 44 23S рРНК (рис. 21 А, 22). Контакт в районе «головы» 30 S субчастицы, по-видимому, приводит к конформационным изменениям в структуре «головы», что видно из сравнения наших данных с рентгеноструктурными данными для 70S рибосомы и криоэлектронными данными, полученными для рибосом без RF2. Эта перестройка включает в себя небольшое смещение спирали 33 (30S «клюв»), белков S10, S3 и S5, локализованных у места входа мРНК в рибосому (рис. 20Б). Контакт RF2 со спиралями 43 и 44 23 S рРНК соответствует данным, показывающим, что основания А1067 и А1095, расположенные в этих спиралях, необходимы для связывания RF2 с рибосомой (рис. 23А) [[158]]. Эта область перекрывается с областью связывания антибиотика тиострептона [[159], [160]]. Можно предположить, что он конкурирует за место посадки с RF2.
Структура, полученная методом криоэлектроиной микроскопии, показывает, что домен 2/4 фактора терминации RF2 точно вписывается в декодирующий карман рибосомы, образованный с одной стороны спиралью 18 16S рРНК и белком S12, а с другой стороны спиралями 44 16S рРНК и 69 23S рРНК (рис. 23А, 24). Домен 4 фактора терминации RF2 близок к спирали 18, домен 2 ответственен за все другие контакты с декодирующим центром рибосомы. Петля домена 2, несущая консервативный SPF аминокислотный мотив, проникает в мРНК-туннель. мРНК на данной карте электронной плотности не видна из-за недостаточного разрешения, но о ее расположении на рибосоме можно высказать предположение, исходя из результатов рентгеноструктурного анализа [[161]]. Суммируя данные о расположении мРНК и домена 2 фактора терминации RF2, можно предположить существование прямого контакта между стоп ко доном мРНК и SPF мотивом фактора терминации RF2 (рис. 23А). Наша модель так же предполагает, что заряженные аминокислотные остатки, находящиеся в р-слое, не принимают непосредственного участия в процессе декодирования, так как они расположены ближе к спиралям 69 и 44, чем к мРНК.
