Содержание к диссертации
Введение
Глава первая. Реакции в комплементарных комплексах (Обзор литературы) з
1.1. Образование мекнуклеотидной связи между олигонуклеотидами химическими методами на комплементарных матрицах з
1.1.1. Реакции с непосредственной активацией олигонуклеотидов в комплементарном
комплексе 3
1.1.2. Реакции конденсации предварительно активированных моно- и олигонуклеотидов 17
1.2. Некоторые другие реакции, протекающие в комплементарных комплексах .,... 23
1.3. Комплементарно-адресованное алкилирование нуклеиновых кислот 32
Глава вторая. Материалы и методы исследования 46
2.1. Исходные материалы 46
2.2. Общие методы исследования 47
Глава третья. Комплементарно-адресованное алкилирование в комплексах олигонуклеотид-олигонуклеотид 57
Глава четвертая. Кинетические характеристики алкилирования производными олигонуклеотидов в прочных комплементарных комплексах 77
Глава пятая. Некоторые исследования протекания реакций алкилирования бензилиденовыми производными неионных аналогов олигонуклеотидов в комплементарных комплексах 32
Выводы 94
Литература 96
- Образование мекнуклеотидной связи между олигонуклеотидами химическими методами на комплементарных матрицах
- Исходные материалы
- Комплементарно-адресованное алкилирование в комплексах олигонуклеотид-олигонуклеотид
- Кинетические характеристики алкилирования производными олигонуклеотидов в прочных комплементарных комплексах
- Некоторые исследования протекания реакций алкилирования бензилиденовыми производными неионных аналогов олигонуклеотидов в комплементарных комплексах
Введение к работе
Для химического воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты в определенных точках Н.И.Гриневой с сотрудниками был предложен и разработан метод комплементарно-адресованной модификации, основанный на внутрикомплексной реакции полинуклеотида и реакционноспособного производного адресующего олигонуклеотида, комплементарного определенному участку модифицируемого полинуклеотида [I]. Метод был широко исследован на примере комплементар' но-адресованного алкилирования нуклеиновых кислот. Для этой цели были получены специальные "адресующие" реагенты - производные олиго- и полинуклеотидов, несущие алкилирующую группу либо на з'-, либо на 5-конце олигонуклеотидного фрагмента: 2',3-0-[4-(N--2-хлорэтил-N-метиламино)бензилиден]олиго- и полинуклеотиды [2-4] и 4-(N -2-хлорэтил-N -метиламино)бензил-5-фосфамиды олиго-нуклеотидов [5,6].
Процесс алкилирования в комплементарных комплексах реагентами такого типа был исследован на примере модификации высокополимерных РНК и ДНК производными гомоолигорибонуклеотидов или стати' стических смесей изоплит рибоолигонуклеотидов [7-Ю], а также дрожжевой tPHK-j- производным pd(CG)rA [II,12).
С помощью данного метода была осуществлена комплементарно-адресованная фрагментация одноцепочечных и денатурированных ДНК [із]. Модифицированный вариант метода комплементарно-адресованного алкилирования был применен Салгаником и др. [14] для проведения направленного мутагенеза определенных генов фага Т7 in vitro.
В последние годы метод нашел применение для осуществления комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот в клетке [15-17]. Для этого было предложено использовать бензили-деновые производные неионных аналогов олигонуклеотидов - олиго- - б - нуклеотидов, этерифицированных по межнуклеотидньш фосфатам [15], поскольку было известно, что замена межнуклеотидных фосфодиэфир-ных групп на триэфирные не приводит к потере способности олиго-нуклеотидов к комплементарным взаимодействиям [18,19]. В то же время такие производные становятся достаточно гидрофобными для прохождения через клеточную мембрану и приобретают устойчивость к нуклеазам [20].
Одним из основных вопросов, стоящих при разработке метода, было выяснение локализации точек, по которым происходит алкили-рование в комплементарном комплексе реагент-нуклеиновая кислота. Это могло быть сделано только на объекте с известной первичной структурой. Однако в силу того, что до последнего времени синтетические олигонуклеотиды были малодоступны, первое исследование этого вопроса было проведено на достаточно сложном объекте, дрожжевой валиновой тРНК, обладающей, к тому же, уникальной третичной структурой. Было установлено, что алкилирование дрожжевой валиновой tPHKj 2,3-0-[4-(М-2-хлорэтил-М-метиламино)] -бензилиденовым производным pd(CG)rA протекает по четвертому в сторону 5-конца нуклеотиду, считая от (CG) -фрагмента тРНК [її]. В силу специфичной третичной структуры тРНК, малого размера олигонуклеотидной части реагента и, тем самым, малой прочности комплекса, представлялось необходимым исследовать вопрос о локализации точек модификации на более простой модели с прочным комплексообразованием, лишенной специфической пространственной структуры. С этой целью в настоящей работе было проведено исследование внутрикомплексно-го алкилировавия синтетических додекадезоксирибонуклеотидов общей структуры pd(xxccTGTTTGCC) (ГДЄX=G (I), х = а(П),х = с(Ш), X = Т Ш)) 2', ЗЧЗ-[ 4- ( N -2-хлорэтил-М -метиламино)] -бензилиденовым производным нонануклеотида d(TGCCAAAC)rA.
Для выяснения некоторых закономерностей алкилирования нуклеиновых кислот бензилиденовыми производными неионных аналогов оли-гонуклеотидов было исследовано алкилирование полиаденидовой кислоты 2^0-[4-(К-2-хлорэтил-М-метиламино)]-бензилиденовым производный нонатимидилилуридина, этилированного по нежнуклеотидныи фосфатам - [Tp(6t)]grU.
Впервые на модельных дезоксирибоолигонуклеотидах с известной первичной структурой - pd(xxcCTGTTTGGC) показано, что внутри-комплексное алкилирование происходит по фрагменту рхрх независимо от природы модифицируемого основания, а на примере алкилирования олигонуклеотида I показано, что алкилированию подвергается остаток гуанина G-2 . Обнаружено, что реакции алкилирования данных олигонуклеотидов в прочном комплементарном комплексе протекают со скоростью, на Ь порядка превосходящей скорость образования этилевиммовий катиона, через который, как правило, протекают реакции алкилирования ароматическими 2-хлорэтидаминами«
Найдено, что при алкилировании поли(А) реагентами, полученными из разных фракций диастереоизомеров нонатимидилилуридина, этилированного по межнуклеотидным фосфатам, степень модификации и направленность алкилирования зависят от набора диастереоизомеров данных реагентов.
Образование мекнуклеотидной связи между олигонуклеотидами химическими методами на комплементарных матрицах
Среди реакций, протекающих в высокоспецифичных комплексах, образованных биополимерами, важное место занимают реакции, протекающие в комплементарных комплексах полинуклеотид-полинукле-отид и полинуклеотид-олигонуклеотид. К ним относятся процессы репарации нуклеиновых кислот, осуществляемые ДНК-лигазой, химические методы синтеза межнуклеотидной связи, имитирующие "лигаз-ную сшивку", методы направленного воздействия на отдельные участки нуклеиновых кислот, а также другие реакции, моделирующие некоторые этапы эволюции. Эффективность протекания таких реакций может быть резко повышена по сравнению с реакциями вне комплекса за счет сближения реагирующих групп соседних молекул в комплементарном комплексе и ориентации их определенным образом. Образование межнуклеотидной связи между олигонуклеотидами химическими методами на комплементарных матрицах
Реакции образования межнуклеотидной связи между олигонуклеотидами можно разделить на 2 типа: I) реакции, в которых активация концевой фосфатной группы одного из олигонуклеотидов происходит непосредственно в составе комплементарного комплекса с помощью конденсирующих агентов и 2) реакции, в которых используются предварительно активированные производные нуклеотидов или олигонуклеотидов.
Исходные материалы
Модификацию комплекса I с ХУ [ С]-ЦМЗ-карбодиимидом выполняли по ГІ4ІІ. К 20 мкл раствора 0,1 М трис-HCt , рН 8,0, содержащим 0,4 0Е2б0 комплекса I с ХУ, добавляли I мг [ чЗ]-ЦМЭ-кар-бодиимида и реакционную смесь выдерживали при 40 в течение 20 часов. Модифицированный комплекс I с ХУ выделяли из реакционной смеси гельфильтрацией на колонке с сефадексом G -25 (0,3 8,5.см) в 0,005 М трис- HCt , рН 8,0. Скорость элюции - 440 мкл/час. Степень модификации определяли по оптической плотности и радиоактивности фракции, содержащей модифицированный комплекс I с ХУ. Разделение модифицированного комплекса на компоненты проводили ионообменной хроматографией на капиллярной колонке ( "ЗО мкл) с ДЭ:АЭ. (ДВ-4І)-целлюлозой в градиенте концентраций КН2Р0 от 0,04 до 0,5 М, рН. 7,5 в 7 М мочевине при 50. Фракции, содержащие I и ХУ, собирали, просчитывали в них радиоактивность и определяли количество молей [ СІ-ІШЗ-карбодиимида, ковалентно присоединившихся к одному моль I и ХУ.
Комплементарно-адресованное алкилирование в комплексах олигонуклеотид-олигонуклеотид
Направленное специфическое алкилирование было проведено на простых модельных соединениях - олигонуклеотидах общей структуры pd(XXCCTGTTTGGC) (X=G , (I); x= A , (П); X=C, (Ш); X= T ,(ІУ)) с помощью реагента - z % 3 -0-4-(N -2-хлорэтил-N -метиламино) бен-зилиден d(TGCCAAAC)rA (ХУІ). Данные модельные соединения были выбраны с целью изучения направленности алкилирования в прочных комплементарных комплексах, лишенных специфичной третичной структуры в отличие от работы [12], где данный вопрос был исследован на примере алкилирования дрожжевой валиновой TPHKJ 2,3-0-(4-N-2-хлорэтил-N -метиламино) бензилиденовым производным pd(CG)rA.
Перед проведением реакций алкилирования в комплементарных комплексах была проверена способность синтетических олигонуклеотидов (І-ІУ, ХУ) к комплексообразованию.
Смешивание одного из олигонуклеотидов І-ІУ с олигонуклеотидом ХУ в эквимолярных количествах в 0,04 М NaCt, 0,01 М трис- НС6 , рН 7,4 (буфер 6) с общей концентрацией 3-4 0Е2б0/мл и дальнейшая гельфильтрация на G-25 в буфере б при 40 обнаруживает появление только одного пика (рис. За), отличающегося по положению от контрольных пиков исходных олигонуклеотидов (рис. 36). Это свидетельствует об образовании прочного комплекса. Дальнейшая хроматография комплекса I с ХУ на капиллярной колонке с ДЭАЭ-целлюло-зой в градиенте концентрации Ш РО в 7 М мочевине при 50 приводит к количественному разделению его на исходные олигонуклеотиды I и ХУ (рис. 4).
Кинетические характеристики алкилирования производными олигонуклеотидов в прочных комплементарных комплексах
При исследовании реакции алкилирования олигонуклеотида I реагентом ХУІ было замечено, что алкилирование гуанинаG-2, которое является практически единственной реакцией в этом комплексе, при 40 проходит количественно уже за 10 минут, тогда как время полупревращения реагента в активную промежуточную частицу при 40 составляет 100 минут [ЮО]. Можно было предположить, что такой быстрый процесс протекает за счет сближения реакционноспособной группы реагента и такого достаточно сильного нуклеофила, как остаток гуанина. Поэтому процесс алкилирования был исследован на серии доде-кадезоксирибонуклеотидов П-ІУ, содержащих в положении, удобном для внутрикомплексного алкилирования, разные основания.
Для построения кинетических кривых алкилирования реакцию алкилирования эквимолярных количеств одного из олигонуклеотидов I, Ш,1У реагентом ХУІ (с общей концентрацией Л 0Е2б0/мл) останавливали обработкой реакционных смесей І н НСЄ , 100, I час. (В этих условиях происходит отщепление олигонуклеотидного фрагмента от модифицирующей группы в реагенте и гидролиз гликозидных и фосфоди-эфирных связей в олигонуклеотидах) Гидролизаты реакционных смесей анализировали с помощью хроматографии на бумаге в системе А, 0 глубине протекания реакции судили по накоплению количеств алкилирован-ныхК7-алкилгуанина,МЗ-алкилцитозина в олигонуклеотидах I и Ш соответственно, а в олигонуклеотиде ІУ - по накоплению продуктов алкилирования фрагмента рТрТ. В случае исследования процесса алкилирования олигонуклеотида П, реакцию останавливали гидролизом бензили-деновой связи в реагенте при рН 4, 40, I час, затем проводили обработку 0,6 н NaOH , 37, 24- часа (см. главу Ш) и только потом гид-ролизовали I н HCfc , 100, І час. О накоплении алкилированных аде-нинов судили по данным хроматографии реакционной смеси на бумаге в системе Г.
Некоторые исследования протекания реакций алкилирования бензилиденовыми производными неионных аналогов олигонуклеотидов в комплементарных комплексах
Для осуществления комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот в клетке большой интерес представляет использование алкилирующих производных неионных аналогов олигонуклеотидов (олигонуклеотидов, этерифицированных по межнуклеотидным фосфатам), поскольку такие аналоги не теряют способности образовывать стабильные комплексы с комплементарными олигонуклеотидами [18,19] , проникают через клеточную мембрану и устойчивы к нуклеазам [20].
Изучение процесса алкилирования 0,17 и 1,7 мМ (в расчете на остаток нуклеотида) растворов поли(А) в буфере I проводили при концентрациях реагента ХУШ (0,8 и 2,2 мкМ), далеких от эквимолярных, в связи с низкой растворимостью реагента ХУШ в воде (максимально достижимая концентрация реагента ХУШ в воде составляла 4,5 мкМ).
Выдерживание реагента ХУШ с раствором поли(А) в буфере I при 20, дальнейшее отделение продуктов превращения непрореагировавше-го реагента ХУШ от поли(А) гелъфильтрацией реакционной смеси на се-фадексе G -75 в буфере 7 при 45 (в этих,условиях происходит полное разрушение комплекса поли(А) с реагентом) и анализ фракций обнару - 83 живает некоторое количество радиоактивности в полимерном пике. Следовательно, происходит ковалентное присоединение реагента ХУШ к по-ли(А). Степень модификации поли(А) определяли по соотношению оптической плотности и радиоактивности в полимерном пике. Ошибка в определении степени модификации поли(А) за счет вклада реакции алки-лирования вне комплекса за время гельфильтрации реакционной смеси при 4-5, оцененная по работе [103], составляет 0,1%.
Кинетическая кривая модификации 0.17 мМ раствора поли(А) 2,2 мкМ реагентом ХУШ приведена на рис. 10. Видно, что предельная степень модификации составляет 0,025 молей остатков реагента на моль декануклеотидных остатков поли(А). Если бы реагент полностью расходовался на алкилирование, то максимальная степень модификации должна была составлять 0,13 молей остатков реагента ХУШ на моль дека-адениловых фрагментов поли(А).
