Содержание к диссертации
Введение
1. Инициация трансляции у эукариот 8
1.1 Механизмы инициации трансляции 8
1.1.1 Сканирующая модель 9
1.1.2 Внутренняя инициация трансляции 10
1.2 Канонические факторы инициации трансляции у эукариот 11
1.2.1 Факторы, участвующие в образовании 4 8S предынициаторного комплекса 12
1.2.2 Факторы, участвующие в образовании 80S комплекса eIF5 20
1.3 Неканонические транс-действующие факторы в инициации трансляции 21
1.4 Общая модель инициации трансляции у эукариот 35
2. Метод тоупринта в изучении сборки инициаторного комплекса из индивидуальных компонентов 38
1. р50 влияет на связывание 40S рибосомной субчастицы с инициаторным кодоном в сборке 4 8S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов in vitro 44
2. р50 способен стимулировать образование аберрантного 4 8S комплекса на 5'-конце мРНК 51
3. Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков 51
4. р50 связывается с сахаро-фосфатным остовом мРНК, проявляя предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания 54
5. Связывание всего нескольких молекул р50 на молекулу (3-глобиновой мРНК достаточно для стимуляции образования 48S предынициаторного комплекса 58
6. р50- "менеджер" мРНК-белковых взаимодействий в мРНП млекопитающих 60
3 РТВ- активный участник инициации трансляции на IRES- элементе РНК вируса энцефаломиокардита 65
1. РТВ значительно усиливает сборку 48S инициаторного комплекса на РНК ВЭМК из очищенных компонентов in vitro 66
2 РТВ проявляет свойства РНК-шаперона 76
3. Функция РТВ в IRES-опосредованной инициации трансляции на РНК ряда пикорнавирусов специфична, но не распространяется на все пикорнавирусы 77
4 Материалы и методы
1. Реактивы и материалы 83
2 . Плазмидные конструкции 83
3 . Генноинженерные манипуляции 84
4 . Получение РНК-транскриптов 85
5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика 85
6. Реконструкция инициаторных комплексов из очищенных компонентов 85
6.1. Выделение рибосомных субчастиц и факторов инициации 85
6.2 Аминоацилирование инициаторной тРНК 86
6.3. Собственно сборка инициаторных комплексов 86
6.4. Тоупринт 86
7. Центрифугирование комплексов в сахарозном градиенте 87
8 Зондирование вторичной структуры мРНК 87
9. Иммуноблоттинг-анализ 87
10. Ультрафиолетовые сшивки 88
11. Количественная обработка результатов 88
Выводы. 89
- Канонические факторы инициации трансляции у эукариот
- Общая модель инициации трансляции у эукариот
- Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков
- РТВ проявляет свойства РНК-шаперона
Введение к работе
В последнее время наблюдается значительный подъём интереса к вопросам регуляции трансляции у млекопитающих. Следует подчеркнуть, что основная регуляция трансляции происходит на стадии инициации. Исследование механизмов инициации трансляции очень актуально на сегодняшний день, так как они точно установлены лишь для простых матриц с короткими и слабоструктурированными 5'-НТО и ряда вирусов с IRES-зависимой инициацией трансляции.
Безусловно, одним из наиболее перспективных методов в изучении -инициации трансляции является реконструкция инициирующих комплексов из очищенных и охарактеризованных компонентов. Его сочетание с техникой тоупринта, применяемой для визуализации комплексов, позволяет убедиться не только в их наличии, но и в "правильности" положения рибосомы на стартовом AUG-кодоне (при седиментации в сахарозном градиенте нельзя установить "правильность" комплекса, так как метод позволяет определить лишь коэффициент седиментации). По интенсивности сигнала тоупринта в сравнении с суммарной интенсивностью сигналов в дорожке можно оценивать эффективность сборки инициаторного комплекса. А точно известный набор используемых в сборке факторов дает возможность исследовать механизмы инициации трансляции. Метод реконструкции инициирующих комплексов помимо перечисленных преимуществ ещё и совершенно незаменим при исследовании трансляционного аппарата млекопитающих, поскольку в данном случае использование генетических методов крайне затруднено.
Помимо канонических факторов инициации трансляции, для активности ряда матриц в трансляции необходимы дополнительные белковые факторы, которые регулируют клеточную активность в развитии клетки, делении и апоптозе. Такие неканонические факторы инициации трансляции специфичны в трансляции на определённой стадии клеточного цикла, специфичны для клеток тех или иных тканей, а также отвечают на характерный стресс. Есть лишь общие соображения, касающиеся функциональной роли таких белков в клетке при трансляции, -механизм же их действия доподлинно не известен. Многообразие и загадочность поведения в трансляции ставят по важности исследования неканонических факторов инициации трансляции в один ряд с каноническими.
По направленности действия в инициации трансляции есть специфические и общие неканонические белковые факторы. Например, РАВР и р50 связываются с большинством или даже со всеми видами мРНК и в целом контролируют белковый синтез. Р50 является наиболее широко представленным белком и неактивных, и активных полисомальных глобиновых мРНП, хотя последние содержат его в два раза меньше в расчёте на молекулу РНК. Переходы мРНК из неактивного в активное состояние и обратно сопровождаются изменением содержания р50 в составе мРНП.
РТВ, La-аутоантиген, unr, поли(С)-связывающие белки РСВР1 и РСВР2, hnRNPK и другие, в отличие от р50, являются специфическими неканоническими белковыми факторами, и их функциональная роль в инициации трансляции проявляется лишь для ряда определённых матриц. РТВ, в частности, требуется для образования 48S комплекса с IRES-элементами РНК ряда пикорнавирусов и с клеточной мРНК Apaf-1, продукт которой вовлечён в регуляцию клеточного апоптоза.
Обладая навыками реконструкции инициирующих комплексов из очищенных и охарактеризованных компонентов в сочетании с техникой тоупринта, мы поставили своей целью в данной работе исследовать по одному примеру неканонического фактора того и другого класса (р50 и РТВ) и выявить их функциональную роль и механизм действия в инициации трансляции у млекопитающих.
Канонические факторы инициации трансляции у эукариот
На сегодняшний день известно как минимум 16 белков, принимающих непосредственное участие в инициации трансляции у эукариот. Они носят название факторов инициации: elF1, 1А, 2, 2А, 2В, 2С, 3, 4А, 4В, 4Е, 4F, 4Н, 5, 5А, 5В, 6. Кроме того, в этом сложном процессе задействованы и другие участники: мРНК-связывающие белки (р50, РТВ, РАВР и др.); киназы, фосфорилирующие факторы инициации (Mnk1, p70S6, CKII, GCN2, PERK, HRI, PKR); регуляторные и прочие ассоциированные с факторами и рибосомами белки (4Е-ВР, РОЕР, Hsp27, У СВС, TRiC). В данном литературном обзоре речь пойдет о наиболее изученных факторах и, в частности, о мРНК-связывающих транс-действующих белках-регуляторах инициации трансляции. 1.2.1 Факторы, участвующие в образовании 48S предынициаторного комплекса. elF2. Это один из главных факторов инициации [37]. Его роль состоит в доставке в инициаторный комплекс Мет-тРНК, и поэтому он абсолютно необходим для инициации (поскольку синтез белка всегда начинается с метионина, даже / если роль стартового кодона выполняет не AUG [17] - кроме единичных экзотических случаев, когда инициация действительно происходит без участия Мет-тРНК и elF2 [38]). Эукариотический elF2 является гетеротримером (у млекопитающих три его субъединицы имеют массы 36(a), 38(0) и 52(у) кДа). Он способен последовательно связывать GTP и Мет-тРНК с образованием т.н. тройного комплекса, который затем может садиться на 40S субчастицу рибосомы (см. обзор [39]); считается, что elF2 способен связываться с рибосомой самостоятельно [40], хотя, по некоторым данным [41], для этого обязательно необходим elF1A и/или elF3. Связывание стабилизируется также при кодон- ""f/ антикодоновом взаимодействии Мет-тРНК с AUG в Р-сайте рибосомы [42]. После нахождения рибосомой AUG и образования кодон-антикодонового взаимодействия с Мет-тРНК, elF2 под действием elF5 гидролизует GTP и диссоциирует из 48S комплекса в форме elF2GDP [44], которая не способна связывать Мет-тРНК. Для замены GDP на новую молекулу GTP и повторения цикла elF2 требуется фактор-"обменник" - пятисубъединичный белок elF2B [37]. у-субъединица elF2 гомологична фактору элонгации EFu/eEF1A и вносит основной вклад в связывание обоих лигандов [47].
По-видимому, именно она и является главным компонентом, обеспечивающим функциональную активность -Сі 1 elF2 [37], а также служит связующим звеном между двумя другими субъединицами [48]. Р-субъединица также участвует в связывании Мет-тРНК [49] и, кроме того, необходима для взаимодействия с факторами elF2B [49] и elF5 [50]. elF2p также способна связывать мРНК [52]. Некоторые мутации в р-субъединице elF2 влияют и на вТРазную активность elF2 [55]. 1? elF2a является регуляторной субъединицей: она может фосфорилироваться по Ser51 четырьмя е1Р2-специфичными киназами (GCN2, PERK, HRI и PKR), активизирующимися в условиях различных клеточных стрессов, когда клетке необходимо снизить общий уровень белкового синтеза (см. обзор [57]). elF2, содержащий фосфорилированную a-субъединицу, не способен диссоциировать из комплекса с elF2B, и цикл обмена GDP на GTP таким образом блокируется. Модификация обратима: elF2a дефосфорилируется фосфатазой РР1 [59]. Кроме того, в клетке есть специальный гликопротеин, р67РОЕР, защищающий elF2a от ,- спонтанного фосфорилирования [60]. Описанный механизм является одним из "ГЦ основных и наиболее хорошо изученных механизмов тотальной регуляции синтеза белка у эукариот. Белок, лишённый a-субъединицы, сохраняет способность участвовать в образовании тройного комплекса [63], что согласуется с её скорее регуляторной, чем каталитической функцией. elF2 принимает непосредственное участие в выборе AUG кодона: известны мутации по каждой из трёх субъединиц, приводящие к аберрантной инициации на UUG [64]. elF3 также является важнейшим фактором инициации (см. обзор [37]). За Т/ исключением единственного пока случая, касающегося вирусной мРНК, которая сама активно связывает 80S рибосому [38], он абсолютно необходим для инициации [68]. Это огромный белковый конгломерат с молекулярной массой -600 кДа, состоящий у млекопитающих и у растений из 11 субъединиц, часть из которых, по-видимому, является вспомогательными, поскольку функционально активный elF3 дрожжей содержит лишь 5 "коровых" субъединиц, и ещё три-четыре ассоциированы с ним нестабильно [69]. elF3 выполняет множество функций, большинство из которых, по-видимому, можно свести к структурной: он способствует диссоциации и препятствует ассоциации рибосомных субчастиц; стабилизирует связывание с 40S субчастицей тройного комплекса elF2GTP Мет- тРНК и сам связывается с 40S; необходим для связывания мРНК с рибосомой [37,68]. Всё это оказывается возможным благодаря многочисленным белок-белковым и РНК-белковым взаимодействиям, в которые вовлечены субъединицы elF3. Этот фактор - своеобразная "платформа", собирающая на себе других участников процесса инициации: 40S субчастицу [42] (благодаря контакту с рибосомным белком RPS0A и с 18S рРНК [70] как минимум двух его субъединиц [71]), белки elF1, elF2 и elF5, образующие мультифакторный комплекс [72], факторы elF4G [73] и elF4B [69], а также саму мРНК (многие субъединицы elF3 имеют РНК-связывающие свойства [37], и, кроме того, взаимодействие опосредуется 4G и 4В). К сожалению, из-за сложного устройства функции elF3 изучены пока весьма поверхностно. elF1 13 кДа-белок, гомологичный С-концевому домену прокариотического " фактора IF3 [74]. Подобно IF3, он связывается с малой рибосомной субчастицей в окрестности Р-сайта [75] и вообще, по-видимому, выполняет сходные с ним функции. Генетические исследования на дрожжах показали [77], что мутантный elF1 (SUM) способствует инициации на UUG-кодоне, а в биохимических опытах по реконструкции 48S из очищенных компонентов млекопитающих отсутствие elF1 приводило к сборке аберрантного комплекса в районе б -конца мРНК [78].
Более тщательные исследования с использованием разных матриц [79] позволили сделать вывод, что elF1 не нужен для связывания мРНК с 40S, но необходим для процессивного сканирования, отрицательной селекции «неправильных» кодонов типа AUU, а также AUG, находящихся в плохом контексте или расположенных слишком близко к 5 -концу (такие AUG пропускаются рибосомой в соответствии с правилами "leaky scanning", см. выше). Иными словами, функция elF1, как и прокариотического IF3, может состоять в дестабилизации кодон-антикодоновых взаимодействий: при этом ошибочные спаривания разрушаются, и рибосома продолжает сканирование, пока не обнаружит «правильный» инициаторный триплет, взаимодействие с который окажется достаточно сильным, чтобы противостоять дестабилизирующему действию elF1. elFIA Этот белок, ранее именовавшийся elF4C, также имеет небольшую молекулярную массу (-17 кДа) и является ортологом прокариотического фактора IF1 [74]. Он стимулирует связывание тройного комплекса с 40S субчастицей [41,68], и сам связывается с ней [81]. Считается, что elFIA, как и elF3, имеет ч рибосом-антиассоциативную активность [81], однако этот факт является спорным [41]. elFIA имеет неспецифические РНК-связывающие свойства [83], возможно, необходимые для взаимодействия с 18S рРНК [84], а также взаимодействует напрямую с elF2 и elF3 [85]. В системе сборки 48S in vitro elFIA увеличивал выход 48S комплекса и был необходим для нахождения AUG-кодона на мРНК Р-глобина [78], однако практически не оказывал влияние на сборку 48S на мРНК с неструктурированной 5 -НТО, лишь немного увеличивая процессивность сканирования и стимулируя сборку комплекса в отсутствие факторов группы elF4 [79]. Прокариотический фактор IF1, структурно и функционально сходный с elF1A, вероятно, связывается с А-сайтом рибосомы [86] и вместе с IF2 направляет Мет-тРНК в Р-сайт [87]. Возможно, что то же справедливо и для elF1A [88], тем более что недавно было показано его взаимодействие с эукариотическим ортологом IF2 - фактором elF5B [89]. elF4F. Большой белковый комплекс, играющий ключевую роль в первичном связывании мРНК с 40S субчастицей. Несмотря на то, что 4F был открыт в числе последних [91], он является одним из наиболее хорошо изученных факторов инициации.
Общая модель инициации трансляции у эукариот
Попробуем теперь на основе данных о структуре и функциях отдельных компонентов, описанных в предыдущем разделе, составить целостную картину событий, происходящих при инициации трансляции у эукариот. Согласно современным представлениям, этот процесс протекает по следующей схеме (рис.2 и обзоры [187,188]). elF2 GDP, освободившийся в предыдущем цикле, взаимодействует с elF2B, -в результате чего происходит обмен GDP на GTP. После этого elF2GTP связывает Мет-тРНК с образованием тройного комплекса, к которому могут присоединяться elF5, elF1 и elF3. Этот белковый конгломерат, а также elF1A, садятся на 40S субчастицу, диссоциировавшую от 60S после терминации синтеза предыдущего полипептида, и дают 43S комплекс. Параллельно факторы группы elF4 готовят мРНК: elF4F связывается с 5 -концом благодаря взаимодействию 4Е с кэпом (в случае кэп-зависимой инициации) и мРНК-связывающим свойствам 4G; в этом же комплексе оказывается РАВР, что замыкает мРНК в кольцо (замыкание мРНК в кольцо на рис.2 не показано). Хеликаза, помещённая на мРНК фактором 4F, начинает расплетать вторичную структуру на 5 -конце с затратой энергии АТР; по-видимому, при этом происходит обмен 4А, связанного в 4F, со свободной формой. 4В, находящийся в этом же комплексе, стимулирует реакцию, обменивая ADP на АТР в составе 4А (свободного или связанного в 4F). На расплетённый участок мРНК вблизи 5 -конца привлекается 43S комплекс благодаря взаимодействию elF3 с 4G, elF3 с мРНК и 40S субчастицей рибосом, и, возможно, 18S рРНК с 4В. Если 5 -НТО мРНК не имеет вторичной структуры, 43S может связывать её и без помощи факторов группы elF4. Связавшая мРНК 40S субчастица, нагруженная факторами, начинает движение по мРНК в направлении от б -конца с одновременным АТР-зависимым расплетанием вторичных структур (если они отсутствуют, АТР для движения не требуется). При этом Мет-тРНК в составе тройного комплекса постоянно "прощупывает" последовательность в поисках AUG кодона, a elF1 разрушает "неправильные" кодон-антикодоновые взаимодействия (это и есть пресловутое "сканирование"). Наконец подходящий триплет обнаружен, и это является сигналом к elF5- -стимулируемому гидролизу GTP, связанному с elF2, после чего elF2GDP и elF5 покидают комплекс (не исключено, что elF2 "пересаживается" на подходящую в этот момент 60S субчастицу). После этого появляется elF5BGTP и связывается с 48S, окончательно помещая Мет-тРНК в Р-сайт. В этот момент к комплексу присоединяется 60S, вытесняя все факторы, кроме elF5B и, видимо, elF1A. Эти факторы последними покидают 80S рибосому после гидролиза GTP, связанного с elF5B.
Далее в А-сайт приходит фактор элонгации eEF1A, заряженный GTP, и соответствующая аминоацил-тРНК, и начинается синтез полипептида. К сожалению, сейчас нет ни малейшей уверенности в том, что всё происходит именно по этому сценарию. Сомнения касаются не только деталей, но и самой изложенной схемы процесса, а также очерёдности событий. К тому же, она разрабатывалась для мРНК с простыми 5 -НТО. В ней нет места для мРНК с сильно структурированными 5 -НТО, не говоря уже об инициации по IRES-зависимому механизму, для описания которых необходима совсем другая схема. В предложенной схеме также нет места для транс-действующих факторов инициации трансляции. Принципиальным является вопрос о порядке связывания мРНК и Мет-тРНК с 40S субчастицей. Изложенная выше модель, в которой посадка тройного комплекса на 40S предшествует связыванию её с мРНК, основана на старых работах, в большинстве из которых не удалось обнаружить комплексов 40S MPHK в отсутствие elF2 GTP MeTPHK, но были зафиксированы комплексы 40S elF2 GTP MeTPHK (подробнее см. обзор [39], с.121). Тем не менее, в [189] принципиальная возможность существования таких комплексов была показана. Из этой работы следует, что 40S способна связываться с б -концом мРНК и в отсутствие elF2 GTP MeTPHK, однако это связывание является нестабильным, и стабилизируется лишь при продвижении 40S "внутрь" лидера, что возможно либо в случае неструктурированной мРНК, либо в присутствии факторов группы elF4, расплетающих вторичные структуры [189]. Именно нестабильностью могут объясняться неудачи в попытках обнаружить комплексы 40S MPHK В упомянутых выше старых работах. Не так давно было показано накопление "нестандартных" 48S комплексов, содержащих мРНК, но не имеющих в своём составе elF2 MeT-тРНК, в клетках, подвергнутых стрессу (см. обзор [58]). Более того, ряд феноменов, связанных с регулируемым выбором инициаторных кодонов [6], просто невозможно объяснить, не допустив возможности сканирования без elF2 MeTPHK. Остаётся предположить, что в различных ситуациях порядок связывания 40S с мРНК и с тройным комплексом может быть различным. Вопрос о времени диссоциации большинства факторов также остаётся , открытым. Известно, что elF2 покидает 48S после гидролиза первой молекулы GTP [44], однако elF1, elF1A и elF3, по-видимому, остаются связанными с рибосомой. Тем не менее, в составе полисом они не обнаруживаются. Скорее всего, они покидают комплекс в момент присоединения 60S [199]. Глава 2. Метод тоупринта в изучении сборки инициаторного комплекса из индивидуальных компонентов.
Очистка большинства факторов инициации трансляции у млекопитающих была осуществлена группами Стехелина (Швейцария), а также Херши и Меррика-Андерсона в США уже более четверти века назад [202]. Тогда же была впервые осуществлена реконструкция 48S и 80S инициирующих комплексов из очищенных компонентов in vitro для единственной доступной в то время мРНК млекопитающих - суммарной глобиновой мРНК из ретикулоцитов кролика [68, 179]. Сейчас уже ясно, что не все факторы инициации были тогда очищены до полной гомогенности, поскольку в то время еще не был открыт кэп-связывающий комплекс elF4F, и существовала путаница с факторами, необходимыми для объединения субчастиц. Кроме того, наличие комплексов в этих экспериментах фиксировалось методом центрифугирования в градиенте сахарозы, что не исключает ошибочной интерпретации результата: комплекс может иметь коэффициент седиментации 48S или 80S, но не быть при этом аутентичным интермедиатом инициации, как, например, в [147]. К сожалению, биохимические эксперименты 25-летней давности по реконструкции инициирующих комплексов in vitro с природной мРНК не получили в то время должного развития. Возникшая в те же годы сканирующая модель инициации трансляции, предложенная Козак [17], столь просто и доступно описала процесс инициации трансляции, что он приобрел широкую популярность даже у людей, не интересующихся трансляцией. О методе вспомнили только в середине 90-х гг. в связи с проблематикой внутренней инициации на вирусных мРНК. Уровень развития биохимических технологий к этому времени был уже достаточным для того, чтобы очищать эукариотические факторы до чистоты более 95% (в качестве источника использовали ЛРК или клетки асцитной карциномы Кребс-2), а также получать рекомбинантные белки и искусственные мРНК. В качестве препарата Мет-тРНК, правда, приходилось использовать тотальную тРНК из тимуса телёнка, аминоацилированную суммарным препаратом аминоацил-тРНК-синтетаз из Е. coli. Для визуализации 48S инициаторных комплексов И.Н. Шатским было предложено использовать технику тоупринта [203]. Данный метод не раз эффективно использовался как в нашей, так и во многих других лабораториях и доказал свою высокую продуктивность в исследованиях. Этот метод даёт ответ на вопрос, достигла ли 40S субчастица инициирующего кодона (рис.3). Применимость тоупринта к эукариотам была продемонстрирована, в частности, Антони и Мерриком [204]. Тоупринт представляет собой вариант метода "ингибирования удлинения затравки" в применении к рибосомным инициирующим комплексам. После сборки инициирующего комплекса, на мРНК в 50-100 нуклеотидах в З -сторону от инициирующего кодона отжигается олигонуклеотидная затравка непосредственно в реконструкционной смеси (т.е. при физиологической температуре). После повышения концентрации Мд2+ добавляется ревертаза, которая, синтезируя кДНК, направляется в сторону связанной с мРНК 40S субчастицы. Как только ревертаза достигает входа в мРНК-связывающий канал 40S субчастицы, она останавливается, причем всегда в одном и том же месте - в положениях +16 -+18 от остатка А инициирующего
Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков
Пестовой и др. [78] ранее было показано, что исключение инициаторных факторов elF1 и elF1A из реконструкционной смеси приводит к образованию аберрантного инициаторного комплекса на самом 5 -конце мРНК. Для образования подобного аберрантного комплекса необходимы все другие факторы , инициации трансляции, включая инициаторную мет-тРНК. Хотя такой комплекс не является промежуточным в образовании функционального инициаторного 48S комплекса, по его образованию и динамике можно судить о стадии, на которой в инициации трансляции функционирует р50: стимулирование связывания рибосомы с матрицей, или он необходим для сканирования 5 -НТО матрицы в поисках стартового кодона. В частности, обладая расплетающей активностью [197], участвует ли р50 в расплетании вторичной структуры 5 -лидера р-глобиновой мРНК в ходе сканирующего процесса? Для ответа на поставленный вопрос нами был проделан эксперимент по реконструкции 48S инициаторного комплекса из очищенных компонентов по описанной выше методике, причём в конечную смесь не добавляли лишь факторы первой группы: elF1 и elF1A. В такой системе можно наблюдать образование аберрантного 48S комплекса на 5-конце р-глобиновой мРНК (рис.6). В присутствии же факторов первой группы собирается функциональный 48S инициаторный комплекс на AUG кодоне. Добавление р50 в систему с аберрантным комплексом (вплоть до 30-кратного молярного избытка по отношению к матрице) приводит к пропорциональному нарастанию количества последнего. Дальнейшее увеличение р50 в системе до 60-кратного молярного избытка приводит уже к ингибирующему эффекту, по аналогии с реконструкцией функционального 48S инициаторного комплекса (см. выше). Таким образом, поставленный эксперимент позволяет сделать вывод, что стимулирующий эффект р50 не основан на участии белка в сканирующем процессе 5 -лидера р-глобиновой мРНК. 3. Способность р50 стимулировать образование 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов при низких отношениях р50/мРНК не является универсальным свойством мРНК-связывающих белков. Можно предположить, что любые мРНК-связывающие белки, содержащие высокоосновные домены, могут, подобно р50, способствовать сборке 48S комплекса. Такой стимулирующий эффект можно назвать неспецифичным, то есть ч не связанным с индивидуальной природой белка.
Из литературных данных можно привести следующий пример: основные РНК-связывающие белки, такие как гяРНПА1, La аутоантиген, РТВ и р50, все делают трансляцию в кроличьем ретикулоцитном лизате более кэп-зависимой, безотносительно от их клеточной функции и индивидуальных характеристик [224]. Для проверки подобного предположения, нами был поставлен эксперимент по сравнительной сборке 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов в присутствии разных количеств высокоосновных мРНК-связывающих белков РТВ и р50. На рисунке 7 видно, что РТВ не стимулирует образование 48S комплекса на р-глобиновой мРНК. Более того, добавление РТВ приводит к ингибирующему эффекту. Полученный результат плохо согласуется с данными работы [224], но согласуется с данными нашей лаборатории о невозможности РТВ стимулировать трансляцию р-глобиновой мРНК в клеточных экстрактах, истощённых по РТВ [196]. Более того, при высоких концентрациях РТВ сильно ингибирует не только образование 48S комплекса, но также и реакцию обратной транскрипции, о чём свидетельствует уменьшение полноразмерного продукта удлинения праймера (см. рис.7, дорожки 6-9, верхние полосы). Возможно, РТВ либо препятствует отжигу праймера на цепи мРНК, либо мешает элонгации продукта кДНК, либо имеют место оба процесса, так как РТВ связывается с нуклеотидными основаниями (пиримидинами). В отличие от РТВ, р50 не ингибирует реакцию обратной транскрипции (количество полноразмерного продукта на геле остаётся постоянным) даже при стократном (данные не показаны) молярном отношении р50/мРНК (когда образование 48S комплекса сильно подавлено) (см. также рис.5). Из этого можно сделать предположение, что в отличие от РТВ, р50 оставляет, по-видимому, нуклеотидные основания доступными для взаимодействия с РНК и белковыми компонентами трансляционного аппарата. 4. р50 связывается с сахаро-фосфатным остовом мРНК, проявляя предпочтение к последовательностям, содержащим полностью неспаренные нуклеотидные основания. Как следует из представленных выше результатов, р50 не ингибирует реакцию обратной транскрипции даже при высоких отношениях р50/мРНК.
Данные наблюдения и опубликованные ранее результаты [216] позволяют предположить, что р50 не узнаёт нуклеотидные основания мРНК. Проведённое нами химическое зондирование комплекса р50/р-глобиновая мРНК подтвердило это предположение. При обработке бинарного комплекса р50/мРНК реактивами DMS (А и С нуклеотидные остатки) и СМСТ (U остатки) защит нуклеотидных оснований выявлено не было. При низких отношениях р50/мРНК защита сахаро-фосфатного остова мРНК от модификации комплексами Fe(ll)-EDTA также не была обнаружена (данные не показаны). При соотношении р50/мРНК около 30, сайты защиты белком р50 сахаро-фосфатного остова оказались распределены по всей длине р-глобиновой мРНК с предпочтением к некоторым последовательностям мРНК (рис.8, дорожки 1 и 4). Такое предпочтение может быть объяснено различным потенциалом разных нуклеотидных последовательностей к спариванию оснований. В свою очередь, это может приводить к разной силе связывания р50 с различными участками мРНК. Р50, как известно, имеет намного большую аффинность к одноцепочечным, чем двуцепочечным нуклеиновым кислотам. Рисунок 9 представляет очевидную иллюстрацию данного утверждения. В показанном эксперименте эффект р50 на сборку 48S комплекса изучался на (САА)п-р-глобиновой мРНК (рис.1 ОБ). Эта мРНК отличается от природной р- глобиновой мРНК только 5 -нетранслируемой областью, CAAGAA(CAA)igCACCAUGG которая составляет всего 1/10 от длины целой мРНК и не имеет поли(А) хвоста. (САА)п-лидер на все 100% находится в одноцепочечной конформации [193]. Такая особенность лидера понижает требования к некоторым факторам инициации и делает матрицу очень эффективной в образовании 48S комплекса. С (САА)п-р-глобиновой гибридной мРНК заметное ингибирование тоупринта наблюдается уже при 10-кратном соотношении р50/мРНК (рис.9, дорожка 4), что в б раз меньше соотношения, при котором ингибируется сборка 48S комплекса в случае р-глобиновой матрицы (сравн. с рис.4 и 5). Для природной р-глобиновой матрицы при 10-кратном Приведённые данные представляют убедительное доказательство о значительном предпочтении белком р50 последовательных участков из неспаренных нуклеотидов. Молекулы р50, связываясь с (САА)п-мРНК, концентрируются, прежде всего, в пределах её неструктурированного 5 -лидера и, таким образом, обеспечивают локальный ингибирующий эффект (см. рис.12). С этой точки зрения неудивительно, что мы не наблюдали стимуляции белком р50 образования 48S комплекса с (САА)плидером при отношениях р50/мРНК меньших, чем 10. В данном случае, эффект стимуляции нивелировался конкурентным по отношению к факторам инициации связыванием р50 с (САА)П-лидером.
РТВ проявляет свойства РНК-шаперона
Полученные результаты можно объяснить следующим образом. В силу того, что І-домен имеет относительно длинный стебель, можно предположить, что он вовлечён во взаимодействие с крупными молекулами: большим мультимерным фактором elF3 или 40S субчастицей, а невозможность обнаружить подобные комплексы пробингом связана с низкими константами комплексообразования. Действие РТВ, видимо, не распространяется на все домены IRESa РНК ВЭМК, в частности на І-домен. РТВ, вероятно, одинаково хорошо выполняет свою функцию РНК-шаперона на обеих матрицах: в случае РНК дикого типа это приводит к значительному усилению сборки 48S комплекса; а в случае мутированной РНК для значительного усиления сборки 48S комплекса выполнения белком РТВ своей функции оказывается недостаточно. Возможно, при инициации трансляции параллельно и независимо от функционирования РТВ протекает другой процесс, в котором задействована мутированная петля домена I, и так как вследствие мутации этот процесс нарушается, то мы и не видим в результате сильного суммарного эффекта. 3. Функция РТВ в lRES-опосредованной инициации трансляции на РНК ряда пикорнавирусов специфична, но не распространяется на все пикорнавирусы. РТВ имеет четыре RRM и относится к РНК-связывающим белкам. Казалось бы, по аналогии с предположением о неспецифичности функционирования рассмотренного ранее в этой работе белка р50, можно подумать, что любые мРНК-связывающие белки, содержащие высокоосновные домены, могут в той или иной мере способствовать сборке 48S комплекса на РНК ВЭМК подобно продемонстрированному выше РТВ. Тогда подобный стимулирующий эффект можно назвать неспецифичным, то есть не связанным с индивидуальной природой белка. Для подтверждения специфичности функции РТВ в инициации трансляции на РНК ВЭМК, нами был поставлен эксперимент по сборке 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов в присутствии разных количеств высокоосновных мРНК-связывающих белков: РТВ и уже нам знакомого р50. Каждый из этих белков добавляли в разных концентрациях в интервале 2-20 молекул белка в расчёте на одну молекулу РНК ВЭМК. На рисунке 20 видно, что р50, в отличие от РТВ, не стимулирует образование 48S комплекса на РНК ВЭМК, но и не приводит к ингибирующему эффекту. Отсутствие стимуляции легко объяснить.
Сборку 48S комплекса проводили в насыщающих условиях по каноническим факторам инициации трансляции, а в таких условиях количества факторов даже за вычетом неспецифически связанных с РНК всё равно оказывается достаточно для сборки предельно возможного количества для данной системы 48S предынициаторных комплексов. Легко объяснить и отсутствие ингибирующего эффекта. В отличие от 5 -НТО р-глобиновой мРНК, IRES-элемент РНК ВЭМК высокоструктурирован, поэтому р50, обладая сродством к одноцепочечным участкам РНК, не может взаимодействовать и конкурировать с факторами инициации за функциональные места на IRESe. Действительно, IRES-элемент РНК ВЭМК по сравнению с 5ЧНТО р-глобиновой мРНК имеет высокоаффинные участки связывания для факторов инициации elF4G [232] и, возможно, elF2 (по неопубликованным данным Меррика с сотр. для IRES-зависимой инициации трансляции РНК ВЭМК может обходиться более низкой концентрацией elF2 по сравнению с инициацией на р-глобиновой мРНК, что может указывать на высокое сродство elF2 к IRESy), и это также свидетельствует не в пользу эффективной конкуренции р50 с факторами инициации за функциональные места связывания последних на IRESe. Как и ожидалось, добавление р50 не ингибирует реакцию обратной транскрипции (количество полноразмерного продукта на геле остаётся постоянным), что является ещё одним убедительным доказательством высказанного нами ранее предположения о взаимодействии р50 с РНК по сахаро-фосфатному остову. При таком взаимодействии нуклеотидные основания РНК остаются свободными в растворе и доступны для взаимодействия с другими РНК и белками. В противоположность р50, РТВ увеличивает выход 48S комплекса на РНК ВЭМК прямо пропорционально своей концентрации в системе. И если вспомнить описанный нами ранее эксперимент, в котором добавление РТВ в аналогичную систему сборки не только не стимулировало образование 48S комплекса на р-глобиновой мРНК, но, более того, приводило к ингибирующему эффекту, то можно смело утверждать, что функция РТВ в инициации трансляции на РНК ВЭМК специфична. Своими экспериментами мы обобщили необходимость РТВ для трансляции всех известных пикорнавирусов. Но это не означает, что и новые семейства пикорнавирусов будут требовать РТВ для трансляции. А также не означает, что РТВ необходим вообще для любых IRESOB. Чтобы это проверить, нами был поставлен опыт по сборке 48S инициаторного комплекса из очищенных компонентов в присутствии и отсутствии РТВ по уже описанной выше методике, однако в качестве контрольной пикорнавирусной матрицы мы использовали РНК - PTV-1 (от англ. porcine teschovirus-1 Talfan) - представителя недавно открытого нового класса тешовирусов семейства пикорнавирусов. Здесь уместно несколько слов сказать о самом вирусе. Совместно с группой Белшама (Великобритания), которая предоставила нам РНК данного вируса и локализовала минимальный участок 5 -НТО, сохраняющий свойства IRESa РНК PTV-1, мы определили минимальный набор факторов инициации трансляции, достаточный для реконструкции 48S предынициаторного комплекса на РНК PTV-1.
Вспомним, что IRES-элементы пикорнавирусов содержат порядка 450 нуклеотидов и для трансляции используют большинство клеточных канонических факторов инициации. Группа Белшама показала, что 280 нуклеотидов 5 -нетранслируемой области РНК PTV-1 достаточно для эффективной внутренней инициации трансляции как in vitro, так и in vivo. Используя метод тоупринта, нами было показано, что для сборки 48S предынициаторного комплекса из очищенных компонентов на IRESe РНК PTV-1 (см. рис.ЮЕ) достаточно только 40S рибосомной субъединицы, фактора elF2 и инициаторной метиониновой тРНК, заряженной метионином. Далее, методом центрифугирования в сахарозном градиенте мы показали возможность образования бинарного комплекса 40S IRES PTV-1, а обнаружив дополнительные полосы в области IRESa в эксперименте футпринтинга бинарного комплекса elF3 IRES PTV-1, доказали возможность прямого взаимодействия фактора elF3 с IRESOM PTV-1 (данные не показаны). Таким образом, можно утверждать, что IRES PTV-1 обладает свойствами, полностью отличными от других пикорнавирусных IRES-элементов, но сильно напоминающими свойства IRESa HCV (вируса гипатита С) (от англ. hepatitis С virus). Сравнение нуклеотидных последовательностей IRESOB PTV-1 и HCV (с помощью компьютерных программ) выявило существование островков высокой гомологии, соответствующих областям, необходимым для взаимодействий IRESa HCV с 40S рибосомной субъединицей и фактором elF3. К тому же были найдены схожие элементы вторичной структуры, в частности, псевдоузел, расположенный непосредственно перед инициаторным AUG-кодоном, который абсолютно необходим для эффективного функционирования IRES-элемента HCV. Таким образом, можно смело утверждать, что существует высокая степень функционального и структурного сходства между IRES-элементами из пикорнавируса PTV-1 и HCV, флавивируса. Факт существования такого сходства между вирусами из двух разных вирусных семейств кажется нам довольно значимым. Мы предполагаем, что либо имел место генетический обмен данного элемента между вирусными семействами, либо существует очень ограниченное число путей, с помощью которых исключительно цитоплазматические РНК могут напрямую взаимодействовать с рибосомой по кэп-независимому механизму. Вернёмся к эксперименту по сборке 48S инициаторного комплекса из очищенных компонентов на РНК PTV-1. Для сборки комплекса на этой матрице необходимо и достаточно, как было установлено нами ранее, трёх компонентов: 40S рибосомной субъединицы, фактора elF2 и инициаторной метиониновой тРНК, заряженной метионином. Добавление в такую систему РТВ в 20-кратном молярном избытке над матрицей лишь слабо усиливало интенсивность сигнала тоупринта (можно высказать предположение, что РТВ работает на РНК PTV-1 неспецифически) (рис.21). Тогда как добавление РТВ в избытке аналогичной
