Содержание к диссертации
Введение
1 Механизмы трансляции у прокариот и эукариот 9
1.1 Инициация трансляции 9
1.1.1 Прокариоты 9
1.1.2 Эукариоты 11
1.2 Элонгация 15
1.3 Терминация 17
2. Структура и функции рибосомы 18
3. Сравнение малых рибосомных субьединиц 19
3.1 рРНК 20
3.2 Рибосомные белки 23
3.2.1 Гомологичные рибосомные белки прокариот и эукариот 23
3.2.2 Рибосомные белки, уникальные для прокариот 40
3.2.3 Рибосомные белки, уникальные для эукариот 43
4 Результаты и их обсуждение 53
1. IRES-элемент вируса RhPV способен направлять внутреннюю инициацию in vivo
2. Безлидерная СІ мРНК способна связываться с недиссоциированной 80S рибосомой и инициаторной Мет-тРНКиМет в отсутствии факторов инициации трансляции 56
3. Тройной комплекс 808*С1мРНК*Мет-тРНК„Мст является функциональным элонгационным комплексом. 58
4. Образование 48S инициаторного комплекса на CllacZ мРНК 60
5 Необычные трансляционные свойства безлидерной мРНК С1 lacZ 66
5.1 Увеличение уровня трансляции безлидерной мРНК CllacZ при повышении ее концентрации в бесклеточной трансляционной системе 66
5.2 Трансляция безлидерной мРНК CllacZ не зависит от кепа
5.3 Безлидерная мРНК CllacZ эффективно транслируется при частичной инактивации eIF2
6. Свойства безлидерной мРНК CllacZ, которые позволяют ей связываться с 80S рибосомой. 68
7 Материалы и методы 74
1 Реактивы и материалы 74
2 Плазмидные конструкции 75
3 Генноинженерные манипуляции 77
4 Получение РНК-транскриптов 77
5 Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика 78
6 Реконструкция инициаторных и элонгационных комплексов из очищенных компонентов 79
7 Количественная обработка результатов 82
8 РНК-трансфекция 82
Выводы 83
- Элонгация
- Безлидерная СІ мРНК способна связываться с недиссоциированной 80S рибосомой и инициаторной Мет-тРНКиМет в отсутствии факторов инициации трансляции
- Трансляция безлидерной мРНК CllacZ не зависит от кепа
- Реконструкция инициаторных и элонгационных комплексов из очищенных компонентов
Введение к работе
До недавнего времени считалось, что механизмы инициации трансляции у прокариот и эукариот кардинально различны. В последнее десятилетие, однако, появились данные, которые похоже начали "перекидывать мостик" между механизмами инициации трансляции у эукариот и прокариот. Обнаружено, что несмотря на отсутствие гомологии в первичной структуре и на различные размеры, эукариотические факторы инициации elFl, elFIA и eIF5B являются структурными и функциональными аналогами бактериальных IF3, IF1 и IF2. Кроме того, оказалось, что для некоторых эукариотических мРНК, прежде всего вирусного происхождения, несомненно возможен механизм связывания рибосомы на их специфических внутренних участках - т.н. IRES-элементах (от англ Internal Ribosome Entry Site). Следует подчеркнуть, что если в случае прокариотических мРНК внутренняя посадка рибосомы требует только белка S1 и/или наличия в них последовательности Шайна-Дальгарно, а также участия в процессе инициации только трех факторов инициации (IF1, IF2 и IF3), то IRES-элементы это протяженные участки с развитой вторичной структурой. Классические IRES-элементы РНК пикорнавирусов содержат высоко специфические сайты связывания для инициирующих факторов, чего нет в бактериальных мРНК. Для инициации трансляции на таких элементах РНК пикорнавирусов требуются почти все эукариотические факторы инициации трансляции (за исключением кеп-связывающего фактора eIF4E), и ряд вспомогательных мРНК-связывающих белков. Гораздо большее сходство с бактериальной системой обнаруживают IRES-элемент из РНК вируса гепатита С {Hepatitis С Virus, HCV), который для образования 40S инициирующего комплекса (48S комплекс) обходится всего двумя факторами инициации, eIF2 и eIF3, и таким образом не требует ни кепа, ни процесса сканирования цепи мРНК при выборе инициирующего кодона. До недавнего времени IRES-элемент HCV, не считая совсем экзотического
случая IRES-элемента РНК вируса паралича сверчка (Cricket Paralysis Virus, CrPV), где не нужны никакие факторы инициации трансляции и даже инициаторная Мет-тРНК, был по-существу единственным примером, показывающим сходство в механизмах связывания мРНК у про- и эукариот.
Автор диссертации и его коллеги исходили из предположения, что сравнение не только структур рибосом или отдельных факторов трансляции, но и самих механизмов трансляции у бактерий и эукариот может быть весьма полезным для более глубокого понимания этого фундаментального процесса. Подробный анализ этих механизмов позволяет более четко выявить, что же в них является сходным, а что кардинально различным и тем самым сфокусировать внимание исследователей на еще совсем неисследованных проблемах. В данной работе обсуждаются новые примеры, которые показывают очевидное сходство во взаимодействии мРНК с рибосомами бактерий и эукариот (млекопитающих).
< Нами было показано, что 'внутренняя инициация трансляции для IRES-элемента РНК вируса черемуховой тли (Rhopalosiphum Padi Virus, RhPV) возможна не только в бесклеточных системах, но и in vivo - следовательно, все данные, полученные ранее in vitro методом реконструкции инициаторных комплексов-из-очищенных компонентов (совместно с И.М. Терениным) отражают "упрощенный" способ инициации трансляции, который напоминает инициацию трансляции у прокариот.
Основное внимание в диссертационной работе было уделено изучению
механизмов инициации трансляции для безлидерных мРНК. Ранее в нашей
лаборатории Балакиным и др. было показано, что безлидерная О мРНК фага
X способна связываться с недиссоциированной прокариотической 70S
рибосомой и инициаторной тРНКи в отстутствие факторов инициации
трансляции. В ходе данной работы было показано, что модельная
безлидерная С1 мРНК способна связываться с 80S рибосомой и
инициировать белковый синтез в отсутствие факторов инициации
)
трансляции. Установлено, что связывание безлидерной мРНК с 80S
1 рибосомой обусловливается расположением инициаторного триплета на самом 5' конце мРНК и одноцепочечной конформацией мРНК непосредственно за инициаторным триплетом.
Чтобы приблизиться к пониманию механизма инициации трансляции безлидерных мРНК, который может реализовываться in vivo в условиях конкуренции с обычными мРНК и в присутствии полного набора факторов инициации, нами был проанализирован возможный "стандартный" механизм инициации через образование 48S предынициаторного комплекса. Методом реконструкции 48S комплексов из очищенных компонентов было показано, что фактор инициации elFl оказывает дестабилизирующее влияние на 48S комплекс, собранный на безлидерной мРНК, что делает инициацию трансляции для безлидерной мРНК через связывание с 80S рибосомой предпочтительной..
Исследованные нами трансляционные свойства безлидерной мРНК в бесклеточной системе (ЛРК) представили весомые аргументы в пользу того, что в системе, в которой присутствуют все компоненты трансляционного аппарата, для безлидерной мРНК реализуется (хотя бы частично) фактор -независимый механизм инициации через связывание с 80S рибосомой.
Таким образом, в данной работе был предложен новый механизм инициации трансляции у эукариот и показана практически полная аналогия в связывании безлидерной мРНК с 70S и 80S рибосомами.
Элонгация
В процессе элонгации аминоацил-тРНК доставляется в А-сайт рибосомы в комплексе с EF1A GTP [32,55]. фактор элонгации EF1A универсальный, связывает большинство аминоацилированных тРНК, хотя обладает пониженным сродством к некоторым аа-тРНК (например - к инициаторной тРНКи и к селеноцистеиновой тРНК). Афинность EF1А к тРНК определяется афинностью к самой тРНК и афинностью к аминокислоте, ковалентно связанной с этой тРНК. Эукариотический аналог, eEFIA, использует такой же механизм узнавания[5б]. Изначальное связывание тройного комплекса EFlA GTP aaPHK около ГТФаз-ассоциированного центра (GAC) приводит к помещению аа-тРНК в гибридный А/Т сайт (где антикодоновая петля аа-тРНК находится в области А-сайта, а остальная часть тРНК - еще нет). После первичного связывания происходит раунд селекции (так как тройной комплекс с "неподходящей" аа-тРНК имеет такие же шансы связаться с рибосомой). Скоординированные конформационные изменения в тройном комплексе и в рибосоме позволяют установить кодон-антикодоновое взаимодействие в А-сайте рибосомы, затем происходит проверка геометрии кодон-антикодонового дуплекса в А-сайте. После установления правильного кодон-антикодонового взаимодействия происходят конформационные изменения в рибосоме, которые позволяют ей стимулировать гидролиз GTP, связанный с EF1A. После гидролиза GTP EF1A диссоциирует, и аа-тРНК помещается в А-сайт, причем ее акцепторный конец помещается в пептидил-трансферазный центр (РТС). На этой стадии происходит еще один раунд селекции -"правильная" тРНК за счет более стабильного кодон-антикодонового взаимодействия более быстро и эффективно помещается в РТС, в то время как "неправильные" тРНК с большой вероятностью диссоциируют из А-сайта прежде, чем их связывание стабилизируется за счет их взаимодействия с РТС. За счет двух раундов селекции удается достигнуть высокой точности трансляции - всего одной ошибки на 1000-10000 прочитанных триплетов при высокой скорости элонгации (10-15 ак/с)[57,58]. После связывания аа-тРНК в А-сайте рибосомы формируется пептидная связь. Затем с тем же сайтом, что и EF1A, связывается фактор элонгации EF2 GTP. При связывании происходит транслокация тРНК из А-сайта в Р-сайт с одновременным перемещением мРНК на один триплет, при этом наблюдается "ratchet-like" вращение 40S субъединицы относительно 60S. В процессе транслокации EF2 гидролизует GTP и диссоциирует с рибосомы в форме EF2-GTP. После окончания транслокации А-сайт рибосомы способен связать новый тройной комплекс EF1 A GTP aaPHK. Для обмена связанного с EF1A GDP на GTP существует обменный фактор EF1B.
Для второго фактора элонгации обменного фактора не обнаружено, считается, что скорость спонтанной диссоциации от EF2 достаточна для достижения равновесия между GTP - и GDP - связанной формой[58]. Стадия элонгации весьма консервативна во всех царствах жизни, эукариотические eEFIA и eEF2 являются гомологами прокариотических EF1A и EF2. Несмотря на гомологию между элонгационными факторами прокариот и эукариот, эукариотические элонгационные факторы не могут работать с прокариотической рибосомой, и наоборот. Однако было показано, что если бактериальные рибосомные белки ГТФаз-ассоциированного центра (L7-L12 протуберанец) заменить in vitro на их эукариотические аналоги, то такие гибридные рибосомы становятся способными использовать эукариотические элонгационые факторы, и теряют способность использовать Г59І прокариотическиеl . 1.3 Терминация В бактериях за узнавание стоп-кодонов ответственны факторы терминации I KrcaccajRF 1 и RF2, RF1 узнает UAA и UAG стоп-кодоны, RF2 узнает UAA и UGA стоп-кодоны. У эукариот существует только один фактор терминации I класса - eRFl, который узнает все три стоп-кодона. Терминационный фактор II класса - RF3 GDP связывается с рибосомой в присутствии фактора терминации I класса. В процессе высвобождения пептида GDP, связанный с RF3, замещается на GTP, что приводит к конформациооным изменениям в рибосоме и к диссоциации фактора терминации I класса. Гидролиз GTP приводит к диссоциации RF3. Фактор RRF вместе с EF2 завершает процесс терминации, диссоциируя рибосомные субъединицы. У эукариот не обнаружен аналог RRF, но, возможно, эти функции выполняет эукариотический eRF3 [60 32-55]. Рассмотренные выше механизмы трансляции у прокариот и эукариот позволяют сделать вывод, что основные различия наблюдаются на стадии инициации трансляции. А поскольку в процессе выбора инициаторного кодона и установлении первого кодон-антикодонового взаимодействия определяющую роль играет малая рибосомная субъединица, целью данного обзора будет детальное сравнение именно малых рибосомных субъединиц прокариот и эукариот. Морфологически малую рибосомную субъединицу можно условно разделить на "голову" с "клювом", "шею", "тело" с "плечом" и "выступом", и "платформу". Форма рибосомной субъединицы большей частью определяется РНК-составляющей. 16S рибосомную РНК разделяют на 4 домена - 5 домен, центральный домен, 3 основной домен и 3 минорный домен. 5 домен располагается в области тела, центральный домен образовывает большую часть платформы, 3 основной домен находится в районе головы, а 3 минорный домен составляет часть тела в межсубъединичной области.
Все домены являются структурно независимы и имеют возможность двигаться друг относительно друга в процессе синтеза полипептида. 3 минорный домен проходит практически через всю рибосомную субъединицу, связан с 3 другими основными структурными доменами, и, таким образом, может вызывать конформационные изменения во всей субъединице. Распределение рибосомных белков на малой рибосомной субъединице асимметрично. Межсубъединичная область практически свободна от рибосомных белков, которые по большей части находятся на ее границе, что позволяет им участвовать в контактах с большой рибосомной субъединицей. В отличие от малой субъединицы, большая субъединица состоит из неподвижного "кора", и конформационные изменения в субъединице ограничиваются лишь подвижностью незначительных сегментов, расположенных на периферии. Из структурных элементов большой субъединицы выделяют центральный протуберанец, L1 протуберанец, L7/L12 протуберанец, палец А сайта (A site finger), межсубъединичный мостик. Сайт связывания мРНК находится на малой рибосомной субъединице, вдоль шеи между головой и телом, т.наз. мРНК связывающий канал. Пептидил-трансферазный центр (peptidyl transferase center, РТС) находится на большой рибосомной субъединице. Между двумя субъединицами располагаются три сайта связывания тРНК A (aminoacyl) сайт обладает большим сродством к аминоацилированной тРНК, Р (peptidyl) сайт обладает большим сродством к пептидил-тРНК, Е (exit) сайт обладает большим сродством к деацилированной тРНК. тРНК ориентированы антикодоновой петлей в сторону мРНК на малой рибосомной субъединице. Акцепторная часть тРНК, находящейся в А и Р сайте, находится в пептидил-трансферазном центре. В районе L7-L12 выступа находятся ГТФаз-ассоциированный центр (GTPase associated center, GAC) и сарцин-рициновая петля (sarcin/ricin binding loop, SRL). Синтезируемый полипептид выходит через канал, находящийся на большой рибосомной субъединице. 3 Сравнение малых рибосомных субъединиц 40S рибосомная субъединица, так же, как и малая прокариотическая рибосомная субъединица, структурно разделяется на голову, тело и платформу. Однако, из за изменения пространственной ориентации некоторых элементов и благодаря наличию избыточных элементов в 18S рРНК (expansion segments) и дополнительных рибосомных белков, 40S субъединица длиннее бактериальной 30S, и в основании тела можно четко определить левую и правую "ноги". По данным криоэлектронной микроскопии избыточные морфологические элементы в основном присутствуют в: 1) основании рибосомной субъединицы - по большей части из за этого 40S субъединица длиннее прокариотической 2) под "платформой", образуя левую "ногу" и нижнюю долю (back lobe) 3) в области "клюва" 4) на части "головы", открытой растворителю, образуя долю головы (head lobe).
Безлидерная СІ мРНК способна связываться с недиссоциированной 80S рибосомой и инициаторной Мет-тРНКиМет в отсутствии факторов инициации трансляции
Для того чтобы исключить присутствие примесей факторов инициации трансляции в препарате 80S рибосом, мы выделили индивидуальные 40S и 60S рибосомные субъединицы, реассоциировали их в присутствии Mg2+, и отделили 80S рибосомы от свободных рибосомных субъединиц центрифугированием в градиенте сахарозы. Комплекс 80S рибосомы и С1 мРНК собирался в присутствии прокариотической Мет-тРНКиМет, которая полностью способна заменять эукариотическую Мет-тРНКиМет (по литературным данным; кроме того, дальнейшие наши эксперименты по реконструкции стадии элонгации полностью подтверждают этот факт). Образование инициаторного комплекса анализировалось двумя независимыми методами - методом тоу-принта, основанным на ингибировании обратной транскрипции, и методом центрифугирования в сахарозном градиенте. Эти методы хорошо дополняют друг друга, так как каждый из них по отдельности имеет свои недостатки. Метод тоу-принта основан на том, что обратная транскриптаза, удлиняющая [32Р]-меченный праймер, отожженный примерно в 60 нт от интересующей области мРНК, способна останавливаться, если с мРНК стабильно связан какой-либо лиганд. О такой остановке свидетельствует укороченный фрагмент кДНК, который можно наблюдать на авторадиограмме. Взаимодействие лиганда с мРНК должно быть достаточно стабильным, большинство мРНК связывающих белков неспособно вызывать остановку ревертазы. В случае рибосомы остановка обратной транскрипции (сигнал тоу-принта) наблюдается в 16-18 нт от триплета, находящегося в Р-сайте рибосомы, и, как правило, только тогда, когда в Р-сайте уже установлено кодон-антикодоновое взаимодействие (которое стабилизирует комплекс и не дает обратной транскриптазе "сбросить" его с мРНК). Таким образом, главными преимуществами метода являются не только регистрация мРНК-рибосомных комплексов, но также и определение положения рибосомы на мРНК (что особенно важно в случае, когда возможно использование нескольких триплетов в качестве инициаторных). Некоторый недостаток метода наблюдается при изучении перехода 48S предынициаторного в 80S инициаторный комплекс. Для 80S комплекса наблюдается такое же положение сигнала тоу-принта, как и для 48 S комплекса, но меняется распределение интенсивности полос в сигнале, и при количественном переходе 48S комплекса в 80S комплекс метод тоу-принта применим. Но если переход не полный, т.е. в системе присутствуют и 48S, и 80S комплексы, то говорить об их соотношении из результатов тоу-принта представляется затруднительным. Метод центрифугирования в сахарозном градиенте, напротив, позволяет точно определить соотношение 48S и 80S комплексов, однако он не дает никакой информации относительно расположения рибосомы на мРНК.
Кроме того, метод центрифугирования в градиенте сахарозы менее чувствителен, чем метод тоу-принта, и не позволяет обнаруживать менее стабильные или промежуточные комплексы, анализ которых, безусловно, важен для более полного понимания молекулярных механизмов инициации трансляции. можно видеть из рис.5, 80S рибосома образует стабильный комплекс с мРНК и Мет-тРНКиМет (дорожка 4). Для 40S субъединицы не наблюдается образование тройного комплекса (дорожка 2), что говорит о факте стабилизации комплекса с 80S рибосомой, по-видимому, за счет взаимодействия Мет-тРНКиМет с 60S рибосомной субъединицей в составе 80S инициаторного комплекса. Замена 5 концевого инициаторного триплета AUG на GUG или на UAA (контроль) приводит к исчезновению тройного комплекса (дорожки 5 и 6). Поскольку в системе отсутствуют факторы инициации, которые способствуют разрушению "неправильных" инициаторных комплексов, то неспособность мРНК с GUG и UAA триплетом участвовать в образовании инициаторного комплекса с 80S рибосомой объясняется только менее стабильным кодон-антикодоновым взаимодействием мРНК с Мет-тРНКиМет. З.Тройной комплекс 808 С1мРНК Мет-тРНКиМет является функциональным элонгационным комплексом Для того, чтобы в дальнейшем говорить о механизме инициации трансляции безлидерных мРНК через прямое связывание мРНК с 80S субъединицей, необходимо было показать, что комплекс, который мы получили in vitro в системе очищенных компонентов, является функциональным инициаторным комплексом, а не каким-либо артефактом. Единственным способом проверить это являлась реконструкция стадии элонгации в системе из очищенных компонентов, так как очевидно, что только "настоящий" инициаторный комплекс способен участвовать в синтезе полипептида. Для реконструкции стадии элонгации нами были выделены суммарные человеческие аа-тРНК синтетазы, с помощью которых была проаминоацилирована суммарная тРНК, кроме того, был очищен фактор элонгации eEFlH (eEFIA в комплексе со своим мультисубъединичным обменным фактором). Фактор элонгации eEF2 был любезно предоставлен Л.П. Овчинниковым. Нами была использована стратегия, при которой мы сначала собирали тройной инициаторный 80S комплекс, а затем добавляли в систему факторы элонгации, суммарную тРНК и GTP (чтобы избежать влияния избытка суммарной тРНК на образование инициаторного комплекса). Анализ стадии элонгации проводили методом тоу-принта. Чтобы наблюдать стадию элонгации методом тоу-принта, седьмой триплет С1 мРНК был заменен стоп-кодон (получена мРНК С1 (стоп)). Седьмой триплет был выбран для того, чтобы исключить влияние изменяемой последовательности на образование инициаторного комплекса.
Поскольку в системе отсутствуют факторы терминации, элонгирующая рибосома должна инвариантно останавливаться на мРНК со стоп-кодоном в А-сайте и предыдущим, 6 триплетом, в Р-сайте рибосомы. В этом случае мы должны были наблюдать возникновение сигнала тоу-принта на расстоянии +16-+18 нт от 6 триплета мРНК С1 (стоп). Действительно, добавление обоих факторов элонгации, суммарной аа-тРНК и GTP к инициаторному комплексу, собранному на С1 (стоп) мРНК, приводило к появлению нового сигнала тоу-принта в предсказанной позиции (дорожка 4). При отсутствии какого либо из элонгационных факторов возникновение нового сигнала тоу-принта не наблюдалось (дорожка 2 и 3). Более того, при замене GTP на его негидролизуемый аналог GMPPNP также не наблюдалось возникновение сигнала тоу-принта (дорожка 5). GTP не нужен для образования тройного комплекса 808 С1-мРНК Мет-тРНКиМет, но необходим для элонгации. Представленные результаты все вместе подтверждают предположение о том, что комплекс, который образуется на безлидерных мРНК через прямое связывание с Мет-тРНК„Мет и 80S рибосомой, является функциональным. Поскольку в реальных условиях в клетке присутствуют все факторы инициации трансляции, мы решили определить эффективность образования 48S инициаторного комплекса на безлидерной мРНК, поскольку было необходимо оценить возможность реализации стандартного пути инициации трансляции. Все факторы инициации, которые необходимы для трансляции обычных клеточных кеп-зависимых мРНК, имеются у нас в виде индивидуальных компонентов. Для инициации трансляции обычных кеп-зависимых мРНК необходимы факторы инициации: elFl (участвует в выборе инициаторного триплета, необходим для сканирования мРНК, разрушает нестабильные инициаторные комплексы), elFIA (стимулирует посадку инициаторной Мет-тРНКиМет в Р- сайт рибосомы, необходим для сканирования), eIF2 (фактор инициации, связывающий инициаторную тРНК и направляющий ее в Р-сайт рибосомы), eIF3 (фактор-"платформа", необходимый для взаимодействия компонентов инициации трансляции между собой), eIF4F (мультисубъединичный комплекс, который необходим для связывания с 5 концом мРНК и для сканирования предынициаторным комплексом 5 нетранслируемой области мРНК в поиске инициаторного триплета: в процессе сканирования расплетаются вторичные структуры, мешающие движению рибосомы). Главная субъединица eIF4F - eIF4G. Субъединица eIF4E отвечает за связывание с кепом, хеликаза eIF4A отвечает за расплетание вторичных структур. eIF4B увеличивает процессивность eIF4A и абсолютно необходим для образования инициаторных комплексов на мРНК, содержащих в своих 5 нетранслируемых областях стабильные вторичные структуры.
Трансляция безлидерной мРНК CllacZ не зависит от кепа
Все клеточные мРНК котранскрипционно кепируются. Хотя некепированные мРНК также способны транслироваться (механизм не ясен, так как и в этом случае наблюдается зависимость от 5 конца мРНК), эффективность трансляции таких мРНК несравненно ниже, чем у кепированных мРНК. Для мРНК, содержащих в своих 5 НТО IRES-элементы, уровень трансляции никак не зависит от присутствия или отсутствия кепа на 5 конце. Независимость какой либо мРНК от присутствия кепа является очень сильным аргументом в пользу того, что трансляция открытой рамки считывания такой мРНК направляется IRES-элементом. Кеп на 5 конце мРНК, как уже упоминалось выше, необходим для привлечения через фактор eIF4F предынициаторного комплекса для последующего сканирования в поисках инициаторного триплета. Для производных мРНК С1 LacZ, как с полностью неструктурированным лидером САА19, так и с лидером мРНК (3-актина, наблюдалась значительная стимуляция трансляция в случае, если такая мРНК была кепирована. Однако для безлидерной мРНК наблюдалось полное отсутствие эффекта кепирования на уровень трансляции. Отсутствие этого эффекта можно объяснить только тем, что для данной мРНК не выполняется стандартный сценарий, при котором одной из важнейших стадий является связывание eIF4F с 5 концом мРНК посредством взаимодействия его субъединицы eIF4E с кепом. 5.3 Безлидерная мРНК CllacZ эффективно транслируется при частичной инактивации eIF2. В стрессовых условиях клетке не выгодно поддерживать высокий уровень трансляции клеточных мРНК, поскольку это весьма энергоемкий процесс. Этого понижения уровня трансляции удается добиться инактивацией каких-либо компонентов инициации трансляции. В случае вирусной инфекции в цитоплазме зачастую появляется вирусная двухцепочечная РНК. Клеткой выработан защитный механизм, призванный остановить развитие зараженной клетки путем глобального подавления уровня трансляции и клеточных, и вирусных мРНК, для того чтобы инфицированная клетка была уничтожена до того момента, как новые вирусные частицы покинут ее.
Протеин-киназа R (PKR) присутствует в цитоплазме в неактивной форме, после связывания в виде димера с двухцепочечной РНК активируется и фосфорилирует а-субъединицу фактора инициации eIF2. Фосфорилированный eIF2, связываясь со своим обменным фактором eIF2B, не способен диссоциировать от него, и обменный фактор "запирается" в неактивной форме. Так как обменный фактор присутствует в значительном недостатке по сравнению с eIF2, довольно быстро весь eIF2 оказывается инактивированным, и за счет этого трансляция подавляющего большинства клеточных (и вирусных) мРНК драматически падает. Как можно видеть из рис. 12, при инактивации eIF2 в лизате ретикулоцитов кролика экзогенной двухцепочечной РНК наблюдается значительное понижение уровня трансляции мРНК с 5 НТО, причем уровень ингибирования трансляции зависит от количества добавленной дцРНК. В случае безлидерной мРНК наблюдается лишь незначительное подавление ее трансляции. То, что подавление трансляции мРНК с 5 НТО связано именно с фосфорилированием и инактивацией eIF2, демонстрирует эксперимент по иммунопреципитации этого фактора инициации (рис. 12Б). Так как источником фосфата для фосфорилирования а-субъединицы eIF2 служит фосфат из АТФ, добавление радиоактивно-меченого у-[ Р]-АТР одновременно с добавлением дцРНК в лизат ретикулоцитов кролика позволяет оценить фософорилирование по радиоавтограмме белкового геля (рис 12В). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансляция безлидерной мРНК, в отличие от ее производной с 5 НТО, в бесклеточной трансляционной системе слабо зависит от концентрации активного eIF2. Если рассмотреть все результаты, полученные при изучении трансляционных свойств безлидерной мРНК в ЛРК, то становится понятно, что инициация трансляции для этой мРНК протекает по нестандартному механизму. Полученные данные, хотя и не являются прямым доказательством нашей модели инициации трансляции через прямое связывание с 80S рибосомой, являются серьезными аргументами в ее пользу. 6. Свойства безлидерной мРНК CllacZ, которые позволяют ей связываться с 80S рибосомой Для того, чтобы определить, какие именно особенности CllacZ мРНК позволяют ей связываться непосредственно с 80S рибосомой в отсутствии факторов инициации трансляции, мы решили проверить, способна ли 80S рибосома связываться как с уже имеющимися производными С1 lacZ мРНК с 5 НТО Р-актина и с искусственной 5 НТО САА)9, так и с другими производными этой мРНК с короткими 5 НТО, а также с искусственными безлидерными мРНК, полученными из природных мРНК путем удаления их 5 НТО. Нами были дополнительно получены две искусственные мРНК с короткими 5 НТО, за которыми следовал инициаторный триплет и кодирующая часть мРНК CllacZ. Одна из них содержала лидер GGGCCG (мРНК 5G-CUacZ), другая - А-богатый лидер GAAAAG (мРНК 5A C\lacZ). Из рис.13 видно, что добавление 5 НТО к безлидерной мРНК (даже полностью неструктурированной последовательности CAAi9 и коротких 6 нт лидеров) полностью ингибирует образование тройного инициаторного комплекса 80S Cl/acZMPHK MeTPHKHMeT, хотя в случае лидера GAAAAG и наблюдается незначительное образование такого комплекса.
Следовательно, вторым фактором, препятствующим связыванию 80S рибосомы с безлидерной мРНК, является присутствие вторичных структур в области, прилежащей к инициаторному триплету. Тот факт, что вторичные структуры в области непосредственно после инициаторного триплета способны ингибировать связывание 80S рибосомы с мРНК, не кажется удивительным, поскольку рибосома сама по себе не обладает значительной хеликазной активностью, кроме того, по всей видимости для связывания необходима стерическая доступность 5 конца мРНК, что вряд ли возможно, если он участвует в формировании вторичных структур. В данный момент становится очевидным факт, что основные принципы связывания мРНК с прокариотическими и эукариотическими рибосомами имеют гораздо больше общих черт, чем казалось еще 5-Ю лет назад. Такой вывод позволяют сделать необычные свойства некоторых неканонических мРНК, для которых реализуется способ инициации трансляции, сходный с прокариотическим. В случае с безлидерными мРНК по всей видимости имеет место полное сходство в механизме их связывания с прокариотическими и эукариотическими рибосомами. Можно предположить, что такие мРНК представляют собой реликт эволюции трансляционного аппарата. Материалы и методы. 1. Реактивы и материалы. В работе были использованы следующие реактивы и материалы: немеченые дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфаты, рибонуклеозид-5 -трифосфаты фирмы Pharmacia (Швеция), a-[32P]-dATP, у-[32Р]-АТР из Обнинска, негидролизуемые аналоги GMP-PNP, AMP-PNP и кеп-аналог (Pharmacia (Швеция)). 1,4-дитио-0,Ь-треитол (DTT); (3-меркаптоэтанол фирмы Serva (Германия); акриламид, N.N -метиленбисакриламид, персульфат аммония и Ы,Ы,К ,К -тетраметилэтилендиамин фирм Serva (Германия) и Reanal (Венгрия); агароза фирмы Sigma (США). В качестве красителей для электрофореза использовали бромфеноловый синий фирмы Merck (Германия), кселенцианол фирмы Chemicals (Англия). Использовали неорганический реагенты фирм Sigma (США) и Merck (Германия). В работе использовали бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт фирмы DIFCO (США); ампициллин завода "Синтез" (Пенза). Все использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы на фирме Synthol (Россия). Биопрепараты: обратные транскриптазы из AMV фирмы Promega (США), ингибитор рибонуклеаз фирмы Fermentas (Литва), эндонуклеазы рестрикции фирм Fermentas (Литва) и Сибэнзим (Россия), полинуклеотидкиназа фага Т4, ДНК-лигаза фага Т4, РНК-полимераза фага Т7 и РНК-полимераза ТЗ фирмы Fermentas (Литва), набор для секвенирования ДНК фирмы USB (США), маркеры молекулярного веса ДНК фирм Fermentas (Литва) и Хеликон (Россия), свободная от РНКаз ДНКаза RQ1 фирмы Promega (США).
Реконструкция инициаторных и элонгационных комплексов из очищенных компонентов
Все операции с ДНК плазмид: расщепление эндонуклеазами рестрикции, кинирование 5 -концов, лигирование, ПЦР, очистку ДНК в агарозном геле, трансформацию клеток Е. coli, выделение плазмид и прочее проводили в соответствии со стандартными протоколами. Секвенирование ДНК осуществляли по Сенгеру с использованием набора фирмы USB согласно протоколу изготовителя или в фирме ЦКП "Геном" (Россия). 4. Получение РНК-транскриптов РНК получали с помощью Т7-транскрипции или ТЗ-транскрипции. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 80 мМ Hepes-KOH рН 7.4, 12 мМ Mg(CH3COO)2, 2 мМ спермидина, 10 мМ DTT, по 10 мМ ATP, UTP, СТР и GTP, 3-5 мкг линеаризованной ДНК, 20 ед. акт. рибонуклеазного ингибитора HPRI и 20 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7 (или РНК-полимеразы фага ТЗ). После смешивания всех компонентов смесь инкубировали при 37С в течение 1ч. Для получения кепированных мРНК использовали смесь рибонуклеотидтрифосфатов по 10 мМ ATP, UTP, СТР, и 5 мМ m7GpppGTP, после предынкубации при 37С в течение 5 мин добавляли GTP до концентрации 0.5 мМ и инкубировали еще 1 ч. Для получения изотопно-меченой мРНК концентрацию UTP снижали до 1 мМ и добавляли 10 мМ a-[32P]-UTP. ДНК разрушали обработкой 3 мкл RQ DNase в течение 5 мин. После фенольной депротеинизации реакционную смесь очищали от солей и нуклеотидов гель-фильтрацией на сефадексе G50, РНК осаждали этанолом и растворяли в воде. Для получения мРНК, используемых для трансляции или РНК-трансфекции (РНК больше 2000 нт) реакционную смесь после разрушения ДНК инкубировали 1 час во льду с LiCl, добавленным до концентрации 2М, после инкубации РНК центрифугировали на охлажденной центрифуге 10 мин при 14000 об/мин, промывали 70% этанолом и растворяли в воде. 5. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика Для трансляции использовали обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов кролика фирмы "Promega". Реакционная смесь содержала 4.3 мкл лизата, дополненного смесью аминокислот и [ SJ-метионином согласно рекомендации изготовителя, и 1.7 мкл водного раствора мРНК разной концентрации. Для проведения трансляции в комбинированной трансляционной системе JIPK-HeLa к пробе добавляли 1/3 объема лизата клеток HeLa, предварительно обработанного микрококковой нуклеазой. Для того, чтобы наблюдать фосфорилирование eIF2a, к 20 ці ЛРК добавляли добавочное количество eIF2 (4.5 мкг), 200 нг дцРНК и 6 цСі of [у-32Р] ATP.
Смесь инкубировали 30 мин при 30 С, после чего добавляли 20 мкл козлиных антител против eIF2 (любезно предоставленных W.C. Merrick), и 460 мкл буфера для связывания (50 тМ Tris-HCl, рН 8.0, 120 тМ NaCl, 1 тМ EDTA и 0.5% Tween 20). После аккуратного перемешивания 3 ч во льду, к смеси добавили 40 мкл 50% суспензии А-белок сефарозы, после чего инкубация и перемешивание смеси продолжались еще 1 ч во льду. Затем А-белок сефароза промывалась тем же буфером для связывания, и связавшиеся белки элюировались кипячением с буфером для нанесения для SDS-электрофореза. Электрофорез продуктов трансляции проводили по Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле. Радиоавтографы гелей получали с помощью прибора "Phosphorimager". 6. Реконструкция инициаторных и элонгационных комплексов из очищенных компонентов 5.1 Выделение рибосомных субчастиц и факторов инициации eIF2, eIF3 из цитоплазматического экстракта проводили в соответствии с протоколом, подробно описанным в [240\ однако факторы на последнем этапе подвергали FPLC-хроматографии на колонке с Mono Q (градиент КС1 100-500 мМ). В качестве источника факторов использовали коммерческий лизат ретикулоцитов кролика, для получения субчастиц брали экстракт клеток асцитокарциномы Кребса. eIF4F получали из ЛРК в соответствии с t241], причём диализовали сначала против буфера, содержащего ЇМ КС1 (для полного освобождения от m GTP, использующегося на последней стадии очистки для элюции с m G-агарозы), и только после этого - против буфера со 100 мМ КС1. Рекомбинантные белки elFl, elFIA, eIF4A и мутантный eIF4A (R362Q) были получены согласно описанию в[239]. Ассоциированные 80S рибосомы получали следующим образом: 10 опт. ед. (А2бо) 40S и 20 опт. ед. (А2бо) 60S субъединиц для реассоциации инкубировали в буфере, содержащем 20 mM Tris-HCl, рН 7.5, 150 тМ КС1, 6 тМ Mg(Ac)2, ImM DTT, при 30С в течении 10 мин. После инкубации смесь наносили на 5%-20% сахарозный градиент, сделанный на том же буфере. После центрифугирования при 16000 об/мин в течение 13 ч при 4С градиенты фракционировались, отбирались фракции, соответствующие 80S рбосомам. Эти фракции объединяли, 80S рибосомы сажали цетрифугированием 40000 об/мин 4 ч при 4 С, растворяли в буфере 20 тМ Tris-HCl, рН 7.5, 0.25 М сахароза, 50 тМ КС1, 1 тМ Mg(Ac)2, ImM EDTA, и ImM DTT, замораживали в жидком азоте и хранили на -70С. Фактор элонгации eEFlH был получен из экстракта клеток асцитокарциномы Кребса по методике, описанной в [2А2\ Фактор элонгации eEF2 был любезно предоставлен Л.П. Овчинниковым. 5.2 Индивидуальная тРНКимет была любезно предоставлена В. Махно и Ю. Семенковым. Рекомбинантную Мет-тРНК-синтетазу получали, как описано в [24Ч Эксперссирующий вектор (рЕТ21 met-Rsase-His6) был любезно предоставлен П. Сергиевым. Для получения суммарной аминоацилированной тРНК белковую фракцию, содержащую суммарные эукариотические аминоацил-тРНК-синтетазы, получали следующим образом: супернатант S100 экстракта клеток асцитокарциномы Кребса осаждали очищали от нуклеиновых кислот на DEAE целлюлозе элюцией буфером, содержащим 250 мМ KCI, затем осаждали сульфатом аммония и диализовали.
Аминоацилирование инициаторной тРНК проводили в 200 мкл смеси, содержащей 40 мМ HEPES-Na(OH) рН 7.5,15 мМ Mg(Cl)2,1 мМ СТР, 10 мМ АТР, 0.1 мМ L-метионина, 20 мкг индивидуальной тРНКимет и 20 мкг рекомбинантной Мет-тРНК-синтетазы Е. coli в течение 30 мин при 37С. По окончании в смесь добавляли SDS до 0.2%, тщательно депротеинизовывали фенол-хлороформом, высаживали спиртом, растворяли в воде, очищали от трифосфатов и солей гель-фильтрацией на сефадексе G50 и снова переосаждали, после чего растворяли в 20 мкл воды и хранили на -80С. Аминоацилирование суммарной тРНК суммарными эукариотическими аминоацил-тРНК-синтетазами проводили по протоколу, аналогичному протоколу для получения Мет-тРНКиМет, за исключением того, что вместо индивидуальной тРНКимет использовали 800 мкг суммарной тРНК из печени теленка, а вместо рекомбинантной Мет-тРНК-синтетазы добавляли 50 мкг фракции суммарных эукариотических аминоацил-тРНК-синтетаз. 5.3 Сборка инициаторных комплексов проводилась в 20 мкл смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 7.4), 120 мМ КС1, 2.5 мМ Mg(OAc)2, 0.25 спермидин-НС1, 1 мМ DTT, 1 мМ АТР (или 1 мМ AMP-PNP), 0.4 мМ GTP (или 0.4 мМ GMP-PNP), 0.5 мкг elFl, 0.5 мкг elFIA, 2 мкг eIF2, 3 мкг eIF3, 0.5 мкг eIF4A (или 0.5 мкг eIF4A (R362Q)), 0.5 мкг eIF4F, 0.5 мкг Мет- тРНКиМет, 2.5 пмоль 80S субчастиц (или 2.5 пмоль 40S субъединиц) и 0.5 пмоль мРНК. Смесь готовили во льду, затем помещали на 10 мин на 30С. Реконструкцию стадии элонгации осуществляли следующим образом: сначала составляли смесь объемом 10 мкл, содержащую 20 мМ трис-HCl (рН 7.4), 120 мМ КС1, 2.5 мМ Mg(OAc)2, 0.25 спермидин-НС1, 1 мМ DTT, 0.4 мМ GTP (или 0.4 мМ GMP-PNP), 0.5 мкг Мет-тРНКиМст, 2.5 пмоль 80S субчастиц и 0.5 пмоль мРНК С1(ТАА7) (см п. 2). Смесь инкубировали 5 мин при 30С. Затем объем смеси увеличивали до 20 мкл, добавляя соответствующее количество солей и трифосфатов, а также 5.4 Тоу-принтинг осуществляли, добавляя к собранным комплексам 1 мкл (5 пмоль) Р-меченного праймера C1R60 (кпомплементарного к области нт +60-+76 от инициаторного триплета мРНК CllacZ), 2 мкл смеси 5 мМ dNTP, 0.5 мкл 0.5 М Mg(OAc)2 и 1 мкл (10 ед. акт.) ревертазы AMV. Обратную транскрипцию проводили 15 мин при 30С. По окончании инкубации смесь подвергали тщательной фенол-хлороформной депротеинизации и кДНК высаживали спиртом.
