Введение к работе
Актуальность проблемы. Транскрипция является первой стадией экспрессии генетического материала в клетках всех организмов. Именно на уровне транскрипции действуют основные механизмы генетической регуляции. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза (РНКП) -сложная молекулярная машина, обладающая многими каталитическими активностями и способная к разнообразным структурным перестройкам. Структура РНКП и механизм синтеза РНК высоко консервативны у всех организмов, от бактерий до человека. РНКП бактерий имеет наиболее простое строение и может служить удобной моделью для изучения механизмов транскрипции с применением самых современных методов молекулярной биологии.
Наиболее сложной и жестко регулируемой стадией транскрипции является стадия инициации. Инициация транскрипции происходит в специфических участках ДНК - промоторах, - и сама состоит из нескольких стадий. В отличие от ДНК-полимераз, РНКП способна самостоятельно осуществлять инициацию и начинать синтез РНК в отсутствие затравки. В ходе инициации РНКП должна: (1) узнать промотор; (2) расплавить цепи ДНК вокруг стартовой точки транскрипции; (3) связать инициаторные нуклеотиды и начать синтез РНК; (4) разорвать контакты с промотором и перейти к продуктивному синтезу РНК - элонгации транскрипции. Детальный молекулярный механизм инициации транскрипции и механизмы структурных превращений РНКП, происходящих на разных стадиях инициации, во многом остаются неизвестными. Расшифровка данного механизма является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии.
У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъединичный состав агРР'со) и фактора инициации -су-субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции. Одной из основных функций су-субъединицы является узнавание промоторов и плавление ДНК в районе стартовой точки транскрипции. В последние годы появились данные, показывающие, что ст-субъединица может также играть активную роль на последующих стадиях инициации, в том числе, в процессах инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора. Таким образом, ст-субъединица является одним из основных регуляторов транскрипции, действующим на всех стадиях инициации. Анализ функций су-субъединицы представляет огромный интерес для понимания механизма транскрипции в целом и основных принципов транскрипционной регуляции.
Анализ трехмерной структуры РНКП, проведенный для РНКП термофильных бактерий Т. aquaticus и Т. thermophilus, позволил создать структурные модели промоторного и элонгационного комплексов. Предложенные модели, хотя и не дают исчерпывающей информации о механизмах структурных превращений РНКП на разных стадиях синтеза РНК, позволяют предположить функции различных участков фермента и могут являться основой для расшифровки детального молекулярного механизма транскрипции. Наличие структурных моделей транскрипционных комплексов открывает возможности для исследований конформационной подвижности РНКП на всех стадиях транскрипции, начиная от взаимодействия су-субъединицы с кор-ферментом, узнавания и плавления
промоторов до структурных перестроек транскрипционного комплекса в ходе инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП.
Термофильные бактерии являются исключительно интересной моделью для изучения механизмов транскрипции и структурной подвижности РНКП, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они приобрели уникальные особенности, связанные с адаптацией к высоким температурам. В частности, РНКП термофилов обладают повышенной жесткостью структуры и сниженной конформационной подвижностью, обеспечивающей термостабильность. Анализ транскрипционных свойств термофильных РНКП дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и обеспечивающих адаптивные различия между различными группами бактерий.
Понимание детального механизма транскрипции представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важнейшее практическое значение, поскольку многие заболевания человека связаны с нарушениями процессов инициации и элонгации транскрипции. Кроме того, анализ механизма транскрипции необходим для разработки новых методов подавления активности РНКП, получения новых ингибиторов фермента и антибиотиков, которые могут найти применение в терапии многих инфекционных заболеваний.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась расшифровка детального молекулярного механизма инициации транскрипции у различных групп бактерий и анализ структурных перестроек РНКП, происходящих в ходе данного процесса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать новые подходы к анализу структуры РНКП и механизмов узнавания промоторов с использованием аптамеров.
-
Установить молекулярные механизмы взаимодействий РНКП с различными промоторными элементами.
-
Изучить механизм плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса РНКП и механизмы стабилизации открытого комплекса.
-
Установить механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП.
-
Исследовать механизм ухода РНКП с промотора.
-
Охарактеризовать молекулярные механизмы, лежащие в основе различий транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате работы получены важнейшие данные о молекулярных механизмах всех стадий инициации транскрипции, а также о механизмах структурных превращений РНКП, происходящих на данных стадиях. Установлены молекулярные механизмы узнавания основных промоторных элементов РНКП, открыт и охарактеризован новый элемент бактериальных промоторов (GGGA-элемент). Показано, что GGGA является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов РНКП. Показано, что <т-субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, TG и GGGA-элементы промотора в составе нематричной цепи ДНК. Изучен процесс образования открытого промоторного комплекса РНКП различных мезофильных и термофильных бактерий, показано, что важную роль в
плавлении ДНК играют аминокислотные остатки в участках су-субъединицы, взаимодействующих с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП. Показано, что стабильность промоторных комплексов определяется контактами <т-субъединицы РНКП с промоторными элементами, а также контактами кор-фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции. Изучен механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП; показано, что в образовании первых связей РНК решающую роль играет су-субъединица, которая способствует связыванию инициаторных нуклеотидов. Показано, что ст-субъединица также играет важную роль в процессе ухода РНКП с промотора при переходе к элонгации транскрипции; установлено, что растущий РНК-транскрипт конкурирует с су-субъединицей за связывание с кор-ферментом РНКП, что в результате приводит к разрыву контактов с промотором. Выявлены структурные элементы РНКП, обеспечивающие различия в каталитических свойствах РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Получен новый тип лигандов к РНКП - аптамеры, - которые открывают широкие возможности для дальнейших исследований механизма транскрипции, а также для создания эффективных ингибиторов фермента.
В целом, полученные в работе данные существенно углубляют наши знания о молекулярных механизмах транскрипции и представляют значительный интерес для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии. Кроме большой фундаментальной значимости, результаты работы имеют важное практическое значение и могут найти применение во многих прикладных исследованиях. В частности, открытия, сделанные в работе, могут быть использованы для создания новых типов промоторов и высокоэффективных систем генной экспрессии, разработки новых стратегий направленной регуляции транскрипции, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XX Международном генетическом конгрессе (Берлин 2008), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям, III и IV Съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург 2002, Новосибирск 2008), Летних исследовательских конференциях Федерации Американских обществ экспериментальной биологии (FASEB) (Вермонт 1997, 2004, 2007), 8-й Международной конференции им. Энгельгардта по молекулярной биологии (Москва 2006), 17 Съезде французского биофизического общества (Нуан-ле-Фезелье, 2000) и др. Работа официально апробирована на заседании Ученого совета ИМГ РАН 22 декабря 2008 г.
Публикации. По результатам работы опубликовано 15 статей в рецензируемых научных изданиях, 11 тезисов международных и всероссийских конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и
их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа
изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков.
