Введение к работе
Актуальность исследования. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости бактериальных клеток к повреждениям ДНК представляют собой несомненный интерес как эволюционно консервативные системы защиты клеток прокариотов и эукариотов. Нерепарированные однонитевые повреждения ДНК вызывают ингибирование и дезинтеграцию репликативных вилок, приводящую к появлению потенциально-летальных двунитевых разрывов ДНК. В E. coli дезинтегрированные двунитевые вилки собираются заново благодаря RecBCD-пути рекомбинационной репарации через направляемую гомологией инвазию однонитевой ДНК в интактный сестринский дуплекс. Репарация как прямо индуцированных, так и возникших при дезинтеграции репликативных вилок двунитевых разрывов ДНК в E. coli возможна прежде всего в реплицированной части хромосомы.
Уровень радиорезистентности бактерий определяется эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК. Репарация двунитевых разрывов у E. coli идет по механизму гомологичной RecBCD-зависимой рекомбинации. RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов за пределами репликативной вилки может рассматриваться как комбинация двух независимых событий репарации, вовлекающих гомологичную хромосому. RecBCD-путь рекомбинационной репарации двунитевых разрывов сопровождается значительной деградацией ДНК и ассоциирован с рестартом репликации. В клетках дикого типа возможна репарация двунитевых разрывов без участия RecBCD-пути. RecF-пути рекомбинационной репарации приписывается роль в заделке брешей, хотя и признается его способность репарировать двунитевые разрывы при выключении RecBCD-пути.
У высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans нет экзонуклеазы RecBCD и репарация двунитевых разрывов идет по RecF-пути рекомбинационной репарации, либо по гипотетическому механизму зависимого от протяженного синтеза отжига нитей. Взаимоотношения несомненно главного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК с альтернативными RecF- и RecE-путями репарации в E. coli еще не выяснены.
Механизмы повышенной радиорезистентности снова в центре внимания:
-
обсуждается зависимый от протяженного синтеза отжиг нитей (ESDSA) как способ репарации двунитевых разрывов у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans,
-
белок RecA из D. radiodurans обладает особенными свойствами,
-
индукция стрессовой системы теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа,
-
в условиях холодового шока (при переносе с 37о на 10о) повышается дифференциальная скорость синтеза белков RесА и GyrA (субъединица А ДНК-гиразы). Белки холодового шока рассматриваются как активаторы транскрипции и РНК-шапероны,
-
взаимодействия стрессовых систем клетки с системами репарации повреждений ДНК до конца не изучены.
В решении актуальных вопросов могут оказаться полезными исследования мутантов кишечной палочки с повышенной радиационной устойчивостью, в которых может быть усилена функция RecF-пути при сохранении роли RecBCD-пути рекомбинационной репарации.
Моделью для молекулярно-генетического анализа факторов радиорезистентности стал радиоустойчиввый мутант E. coli Gamr444. Радиорезистентность мутанта Gamr444 зависит от recA+-lexA+-функций (Бреслер и др., 1984). Штаммы бактерий Gamr имеют пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК (Бреслер и др., 1982). Мутация recF в большей степени снижает радиоустойчивость мутанта Gamr444, чем клеток дикого типа (Бреслер и др., 1984). Повышенный уровень белков теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа и rpoH-recA-зависимому росту радиоустойчивости у мутанта Gamr444 (Вербенко и др., 1986), при этом гены-регуляторы репарационной системы и белков теплового шока – recA и rpoH, соответственно, в мутантах Gamr не изменились (Бреслер и др., 1984; Вербенко и др., 1986).
Анализ штаммов Gamr позволил предположить, что усиление радиоустойчивости у мутанта Gamr444 обусловлено мутациями по меньшей мере 3 типов. Одна из них предотвращает избыточную пострадиационную деградацию ДНК, вторая повышает эффективность работы рекомбинационных систем репарации (особенно RecF) и третья повышает уровень белков теплового шока, играющих вспомогательную роль в репарации. Для того, чтобы наиболее полно изучить механизмы высокой устойчивости бактерий к ДНК-повреждающим факторам, необходимо исследовать свойства мутантных локусов, дающих фенотип Gamr.
Процесс деградации поврежденной нити ДНК играет важную роль в рекомбинационной репарации. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому могут осуществлять клеточные белки аналогичные белкам gam и gp2 фагов l и T4. Плазмида pGam26, вероятно, несет клонированный мутантный ген, кодирующий клеточный ингибитор деградации ДНК, не совпадающий с белком RecA. Свойства этого продукта кажутся интересными для исследования.
Одним из факторов, лимитирующих репаративный потенциал бактериальных клеток, является сложный, разветвленный процесс рекомбинационной репарации. Существование различных путей рекомбинации (Clark, 1973) может приводить как к кооперативным, так и к конкурентным взамоотношениям генетических продуктов, использующих один и тот же субстрат. Полученные ранее данные указывают на то, что важной причиной повышения устойчивости клеток E. coli к летальному действию g-излучения является увеличение эффективности работы SOS-системы и RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). Вместе с тем взаимоотношения различных путей рекомбинации при репарации повреждений ДНК остаются невыясненными и требуют дальнейших исследований.
Вклад стрессовых систем клетки в радиорезистентность не вызывает сомнения, однако механизмы усиления экспрессии остаются не выясненными.
Белок RecA оказывает плейотропный эффект и занимает центральное место в индуцибельной репарации. Этот белок, будучи хорошо изученным у E. coli, продолжает оставаться объектом сравнительного исследования у разных микроорганизмов. С точки зрения эффективной репарации ДНК несомненный интерес представляет RecA-подобный белок у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans (Battista et al., 1999, Kim et al., 2002, Narumi et al., 1999). Возможным способом повышения радиоустойчивости выглядит перенос гена recA и экспрессия гена recA из грамположительной бактерии D. radiodurans в клетках E. coli.
Целью работы являлось исследование молекулярно-генетических механизмов повышенной устойчивости бактериальных клеток к потенциально-летальным повреждениям ДНК – двунитевым разрывам, на примере радиоустойчивых мутантов Escherichia coli.
В задачи исследования входило: изучение роли различных путей рекомбинационной репарации и прежде всего генов RecF-пути в повышении радиоустойчивости клеток, клонирование и изучение мутантных локусов gam, повышающих эффективность репарации; изучение вклада основных белков системы теплового шока в радиоустойчивость, исследование возможности активации RecA-зависимых функций в репарации, изучение роли мажорных белков холодового шока в феномене радиоустойчивости.
Научная новизна исследования состоит в том, что экспериментально установлена ассоциация репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК (включая двунитевые разрывы как основные летальные повреждения) с активностями RecBCD- и RecF-путей рекомбинационной репарации не только в клетках дикого типа, но и в радиоустойчивых мутантах. Есть несколько особенностей репарационных систем в мутантах Gamr: 1) при низких дозах облучения (на уровне D37) штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации; 2) при более высоких дозах (> 500 Гр) RecBCD-путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов; 3) относительный вклад SOS-функций значительно выше в мутантах Gamr по сравнению с диким типом и объем репарации ДНК и/или её эффективность значительно выросли; 4) вероятно, эти SOS-функции, крайне важные для репарации g-повреждений, идентичны ферментам RecF-пути рекомбинационной репарации ДНК, о чем говорит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего, по крайней мере в диапазоне доз до 1 кГр, 5) мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа.
Понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gamr444, обнаруженное прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта T4 2-, согласуется с предположением о "конститутивном", т.е. присутствующим уже в необлученных клетках, ингибиторе пострадиационной деградации ДНК, который не контролируется репрессором SOS-системы LexA и не совпадает с белком RecA. Свойства плазмиды pGam26, несущей один из клонированных мутантных генов штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что этот аллель способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа.
Мутантный локус радиорезистентности gam18 из штамма Gamr444 Escherichia coli, клонированный на плазмиде pGam18, компенсирует мутации в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и относящемся к RecF-пути.
Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не способен компенсировать дефект гена recA грамотрицательной бактерии Escherichia coli K-12. Однако после серии последовательных облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток E. coli, несущих плазмиды с клонированными аллелями гена recA Deinococcus radiodurans, получены мутантные аллели recA-300 и rec30-212, комплементирующие делецию гена recA E. coli и, по-видимому, кодирующие мутантные белки RecADR, способные эффективно взаимодействовать с компонентами рекомбинационной репарации E. coli.
Доказано существование у радиоустойчивых мутантов E. coli Gamr смешанного RecBCD-RecFOR-пути рекомбинационной репарации ДР в гомологичных хромосомах, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Белки холодового шока субсемейства CspA: CspA’ и CspG’, регулируют экспрессию генов, кодирующих БТШ, и генов SOS-регулона.
Положения, выносимые на защиту
1. Предполагается существование у радиоустойчивых мутантов E. coli Gamr смешанного RecBCD- и RecF-зависимого пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути сопровождается активацией геликазы на RecF-пути.
2. Гиперпродукция белков теплового шока DnaK, DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB и Lon создает благоприятные условия для репарации: ренатурации или гидролиза поврежденных протеинов. Модифицированные белки CspA’ и CspG’ системы холодового шока могут повышать устойчивость клеток E. coli как дикого типа, так и радиоустойчивого мутанта Gamr444, к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, регулируя экспрессию генов и синтез белков холодового шока, теплового шока и RecA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные демонстрируют существование эволюционно-консервативного механизма защиты клеток от опасных повреждений ДНК, включающего координированное действие различных репарационных и стрессовых систем бактериальной клетки. Работа вносит существенный вклад в разработку методов создания рекомбинантных плазмид, повышающих устойчивость клеток к генотоксичным факторам среды. В связи с задачей биологической очистки радиоактивных отходов штаммы микроорганизмов, способные селективно накапливать тяжелые металлы, в том числе и радионуклиды, должны обладать устойчивостью к повышенному радиационному фону. Клонированные мутантные локусы, повышающие эффективность репарации ДНК, дают возможность создания радиоустойчивых форм микроорганизмов для решения задач биоремедиации.
Результаты работы использованы при составлении программы курса “Регуляция транскрипции” и лабораторного практикума по молекулярной биологии для студентов кафедры биофизики Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях: 25th Annual Meeting European Society Radiation Biology, Stockholm, 1993, Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1995 г., Molecular Genetics of Bacteria and Phages" в Колд-Спринг-Харборе (Cold Spring Harbor Laboratory) в 1996 г., на 2 съезде ВОГиС в Санкт-Петербурге в 2000 г., на международной конференции, посвященной 100-летнему юбилею Н.В. Тимофеева-Ресовского "Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции" в Дубне в 2000 г., на международной конференции "Проблемы радиационной генетики на рубеже веков" в Москве в 2000 г. и на школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” в Москве – Пущино в 2008 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы, насчитывающего 501 источник. Работа изложена на 310 страницах, иллюстрированных 81 рисунком и 19 таблицами.
