Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Механизмы действия ингибиторов хинонного типа 9
1.1. Ингибирование электронного транспорта 10
2. Механизмы защиты от ингибирующего действия хинонов 16
2.1. Антиоксидантные системы 16
2.2. Восстановление хинонов с участием НАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаз 17
3. Электрон-транспортная цепь тилакоидной мембраны цианобактерий... 20
3.1. Фотосинтетическая ЭТЦ 22
3.2. Дыхательная ЭТЦ 24
3.2.1. Доноры электронов для дыхательной ЭТЦ 24
3.2.2. МАБ(Р)Н-дегидрогеназы 26
3.2.2.1. NAD(P)H-дегидрогеназа типа 1 (NDH-1) 26
3.2.2.2. NADH-дегидрогеназа типа 2 33
3.3. Сукцинатдегидрогеназа 34
ЗАКомплексцитохромовЬ/ 36
3.5. Цитохромоксидазы дыхательной цепи 37
Материалы и методы 40
Штаммы и плазмиды 40
Условия роста 40
Трансформация Escherichia coli 43
Трансформация Synechocystis 6803 44
Выделение плазмидной ДНК методом кипячения (Holmes, Quigley, 1981) 44
Выделение хромосомной ДНК из клеток цианобактерий 45
Ферментативная обработка ДНК 45
Электрофорез в агарозном геле 46
Элюирование ДНК из агарозного геля 47
Полимеразная цепная реакция 47
Измерение МТТ-редуктазной активности 47
Выделение тилакоидных мембран из клеток Synechocystis 6803 48
Измерение ферментативной активности 48
ЭПР спектроскопия 49
Northern-блоттгибридизация 49
ОТ-ПЦР 50
Компьютерная обработка данных 51
Результаты 52
Дегидрогеназная активность в клетках дикого типа и мутантов 52
Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов 54
Конструирование двойных мутантов 55
Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC19::/rg/4::Cm (pBHS::CmR) 56
Конструирование рекомбинантной плазмиды p\JCl9::drgA::Gm (pBHS::GmR) 57
Трансформация клеток мутантов NDH-1, SDH, NDH-2 и Ох 59
Проверка сегрегации мутаций 60
Физиологические характеристики двойных мутантов. 62
Анализ устойчивости к менадиону 63
Ферментативная активность в бесклеточных препаратах дикого типа и мутанта DrgA 64
Восстановление Р700+ в клетках дикого типа и мутантов 66
Экспрессия гена drgA 68
Изучение функции гена drgA с помощью очищенного белка DrgA-12His. 71
Обсуждение 74
Список литературы
- Ингибирование электронного транспорта
- Фотосинтетическая ЭТЦ
- Выделение плазмидной ДНК методом кипячения (Holmes, Quigley, 1981)
- Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов
Введение к работе
Хиноны, такие как менадион (2-метил-1,4-нафтохинон) и плумбагин (5-гидрокси-2-метил-1,4-нафтохинон), индуцируют окислительный стресс в клетках аэробных организмов. Ингибирующее действие хинонов обусловлено одноэлектронным восстановлением до семихинонов. Семихинон может взаимодействовать с молекулярным кислородом с регенерацией исходного хинона и образованием супероксида, который индуцирует окислительный стресс (Hassan, Fridovich, 1979). При восстановлении хинонов по двухэлектронному механизму образуется нетоксичный гидрохинон (Lind et al., 1982).
У фотосинтезирующих организмов менадион может влиять на транспорт
электронов, как в фотосинтетической, так и в дыхательной электрон-
транспортной цепи (далее ЭТЦ). Липофильные хиноны с низкими
окислительно-восстановительными потенциалами, такие как менадион и
плумбагин, легко проникают в тилакоидные мембраны цианобактерий и
хлоропластов растений, где они могут акцептировать электроны из
фотосинтетической цепи на уровне разных компонентов. У цианобактерий
Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis 6803), дыхательная и
фотосинтетическая системы транспорта электронов совмещены в
тилакоидной мембране. Общими переносчиками, являются пул
пластохинона (PQ), комплекс цитохромов b$f и пластоцианин. Главными компонентами дыхательной ЭТЦ являются дегидрогеназный комплекс NDH-1, окисляющий преимущественно NADPH и восстанавливающий пул PQ, и цитохромоксидаза, которая восстанавливает кислород до воды. В восстановлении пула пластохинона также принимают участие дегидрогеназный комплекс NDH-2, окисляющий NADH (Howitt et al., 1999), и сукцинатдегидрогеназа (SDH), окисляющая сукцинат и функционирующая главным образом в темноте (Cooley, Vermaas, 2000). Фотосинтетическая ЭТЦ содержит два типа реакционных центров: фотосистему І (ФСІ) и фотосистему II (ФСП). Нециклический фотосинтетический транспорт
электронов от воды через ФСИ, пул PQ, комплекс цитохромов b
В основе противодействия клеток окислительному стрессу лежит активация защитных систем, к которым относится ряд ферментов, таких как супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы. Кроме того, важную роль в защите клеток как прокариотических, так и эукариотических организмов от ингибирующего действия хинонов играют дегидрогеназы, способные осуществлять двухэлектронное восстановление этих агентов с образованием нетоксичных гидрохинонов (Lind et al., 1982). В клетках млекопитающих обнаружен эффективный механизм защиты от токсического действия хинонов. Цитозольный фермент КАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза (DT-диафораза) восстанавливает хиноны по двухэлектронному механизму, препятствуя их одноэлектронному восстановлению другими ферментами (Prochaska et al., 1985; Tedeschi et al., 1995). Функциональный гомолог DT-диафоразы ЧЧАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктаза, кодируемая геном drgA, - был обнаружен у цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 (Чеснавичене и др., 1994; Elanskaya et al., 1998; Matsuo et al., 1998). У нефотосинтезирующих организмов менадион взаимодействует, главным образом, с дыхательной ЭТЦ. У фотосинтезирующих организмов менадион может акцептировать электроны из фотосинтетической ЭТЦ на уровне ферредоксин:КАЭР+-оксидоредуктазы, ФСІ, ФСИ и комплекса цитохромов b
Целью данной работы было выяснение роли генов, кодирующих дегидрогеназы и оксидазы, в контроле устойчивости клеток цианобактерии Synechocystis 6803 к индуктору окислительного стресса менадиону.
В задачи работы входило:
- идентификация генов, ответственных за устойчивость к менадиону, с
помощью мутантов Synechocystis 6803, лишенных функционально активных
дегидрогеназ NDH-1, NDH-2, SDH, DrgA, а также цитохром- и
хинолоксидаз;
выяснение механизмов устойчивости к менадиону;
выяснение роли гена drgA, кодирующего растворимую NAD(P)H:xhhoh-оксидоредуктазу, в регуляции электронного транспорта в тилакоиднои мембране Synechocystis 6803.
Ингибирование электронного транспорта
В клетках прокариотических и эукариотических организмов хиноны служат субстратами для флавиновых ферментов, с участием которых они восстанавливаются до двухатомных фенолов. Восстановление хинонов осуществляется в две стадии. На первой стадии в результате одноэлектронного восстановления образуются анион-радикалы (семихиноны). Эти частицы могут быть зарегистрированы с помощью ЭПР-спектроскопии. На второй стадии анион-радикал присоединяет еще один электрон с образованием дианиона двухатомного фенола (Рис. 2).
В присутствии кислорода большинство семихинонов быстро окисляется с образованием супероксид-анион радикала (Of")» который индуцирует окислительный стресс. При этом регенерируется исходный хинон. Таким образом, токсическое действие хинонов в основном связано с их одноэлектронным восстановлением (Рис. 3). Гидрохиноны, образующиеся при двухэлектронном восстановлении хинонов, напротив, являются более стабильными и могут образовывать нетоксичные соединения с глюкуроновой кислотой, теряя, таким образом, способность вступать в циклические окислительно-восстановительные реакции (Lind et al, 1982).
Гидрохиноны, несмотря на их нетоксичность и стабильность по сравнению с семихинонами, могут индуцировать в клетках млекопитающих мутации, приводящие к удалению одного цитозинового остатка со сдвигом рамки считывания (Joseph et al., 2000).
Хиноны проникают в мембраны и могут восстанавливаться до семихинонов различными флавиновыми ферментами, такими как NADPH: цитохром Р-450-редуктаза (ЕС 1.6.2.4) (Cenas et al., 1994), ксантин-оксидаза (ЕС 1.1.3.22) (Pristos, Gustafson, 1994), L-аспартат-оксидаза (ЕС 1.4.3.16) (Tedeschi et al., 1995). В тилакоидных мембранах цианобактерий и хлоропластов растений хиноны могут быть восстановлены по одноэлектронному механизму ферредоксин: NADP+ - оксидоредуктазой (ЕС 1.18.1.2). Кроме того, в одноэлектронном восстановлении хинонов могут участвовать PS I и PS II, а также комплекс цитохромов b f (Samuilov et al., 1997).
В присутствии кислорода большинство семихинонов окисляются с образованием супероксид-радикала и восстановлением исходного хинона. Эта циклическая окислительно-восстановительная реакция приводит к оксилительному стрессу и вызывает гибель клеток, что позволяет использовать хиноны в качестве ядов при удалении опухолей. В опытах, проведенных с использованием тесторного штамма Salmonella typhimurium ТА104 (Chesis et al., 1984), было показано, что двуэлектронное восстановление ингибиторов хинонного типа бензопирена и дахрона НАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазой из клеток млекопитающих (DT-диафоразой) вызывало мутагенный эффект. В то же время, двухэлектронное восстановление менадиона DT-диафоразой не вызывало мутагенного эффекта. Одноэлектронное восстановление всех трех хинонов, катализируемое NADPH-цитохром Р-450 редуктазой, приводило к образованию кислородных радикалов и вызывало мутагенный эффект.
Липофильные хиноны, с низкими окислительно-восстановительными потенциалами к которым относится менадион (2-метил-1,4-нафтохинон, витамин Кз) (Рис. 4), легко проникают в тилакоидные мембраны цианобактерий и хлоропластов растений и влияют на транспорт электронов, как в фотосинтетической, так и в дыхательной ЭТЦ, принимая электроны на уровне разных компонентов. Менадион является аналогом пластохинонового акцептора электронов, и передает электроны непосредственно на кислород с образованием супероксидрадикала. При этом менадион эффективно конкурирует с природным акцептором электронов - пулом пластохинонов (Thor et al., 1982). Данный механизм токсического действия менадиона на клетку подтверждается также тем, что при обработке клеток E.coli менадионом индуцируется синтез ферментов, ответственных за защиту клеток от окислительного стресса (Greenberg, Demple, 1989).
Фотосинтетическая ЭТЦ
Подобно хлоропластам растений, светозависимая окислительно-восстановительная цепь цианобактерий содержит два типа реакционных центров: ФСІ и ФСП (Рис. 5). Нециклический фотосинтетический транспорт электронов от воды через ФСИ, пул PQ, комплекс цитохромов Ь/ , пластоцианин, ФСІ и ферредоксин приводит к восстановлению NADPH (Скулачев, 1989; Vermaas, 1996). Восстановленный NADPH окисляется водорастворимой системой ферментов, восстанавливающих СО2 до Сахаров в цикле Кальвина, сходном у цианобактерий, протеобактерий (пурпурные бактерии Rhodobacter capsulatus) и растений (Zhang et al., 2004).
Нециклический транспорт электронов сопровождается выделением кислорода и сопряжен с синтезом АТФ, который осуществляется в процессе нециклического фосфорилирования.
Альтернативный способ функционирования фотосинтетической ЭТЦ -циклический транспорт электронов с участием ФСІ, в котором участвуют дегидрогеназный комплекс NDH-1, пул PQ и комплекс цитохромов b f. Его называют бескислородным фотосинтезом. В этом случае электроны транспортируются от ферредоксина не к NADP+, а к окисленному пулу PQ, восстанавливая его. Пул PQ в свою очередь восстанавливает окисленный реакционный центр ФСІ. Предполагается, что перенос электронов к PQ от восстановленного ферредоксина осуществляется с помощью гипотетического фермента ферредоксин-пластохинон редуктазы (FQR) (Bendall, 1995). Электроны могут быть также перенесены на пул PQ от NADPH, образующегося в ходе нециклического транспорта электронов, с участием дегидрогеназного комплекса NDH-1 (Mi et al., 1995).
Для Synechocystis 6803 физиологически важен циклический поток электронов с участием ФСІ. Функцией циклического транспорта является генерирование АТФ. У Synechocystis 6803 это достигается путем циклического использования NAD(P)H. ФСІ восстанавливает NADP+, NADPH окисляется NAD(P)H- en poreHa3oft NDH-1, которая возвращает электроны на ФСІ через комплекс цитохромов b$f. В отсутствие функционально активной ФСІ электроны от ФСИ поступают на цитохромоксидазу тилакоидной мембраны. Таким образом, возможны два пути электронов от ФСП: к цитохромоксидазе или к ФСІ (оба включают цитохром b f) (Vermaas, 1996). Общими компонентами фотосинтетической и дыхательной цепей являются пластохинон, цитохром br/и цитохром С553, на уровне которых регулируется направление потока электронов на ФСІ или цитохромоксидазу дыхательной цепи.
Таким образом, в клетках цианобактерии Synechocystis 6803 осуществляется два типа циклического транспорта электронов с участием ФСІ (Mi et al., 1995): 1) ферредоксин-зависимый транспорт электронов; 2) NADPH-зависимый транспорт электронов.
Циклический транспорт электронов выполняет три основные функции (Bendall, Manasse, 1995): 1) накапливает АТФ в ходе нециклического транспорта электронов, для того, чтобы в условиях непрерывного фотосинтеза сохранять соотношение АТФ/NADPH, что необходимо для работы цикла Кальвина; 2) запасает АТФ для различных клеточных процессов в нормальных и стрессовых условиях; 3) при высокой интенсивности света защищает фотосинтетический аппарат от фотоингибирования путем понижения активности ФСИ посредством создания низкого рН в межтилакоидном пространстве.
Выделение плазмидной ДНК методом кипячения (Holmes, Quigley, 1981)
3 мл ночной культуры E.coli осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 2 минут на центрифуге «Beckman» (Германия). К подсушенному осадку добавляли раствор STET (8% сахароза, 50 мМ EDTA, 5% тритон Х-100, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0) с лизоцимом (10 мг/мл), ресуспендировали и инкубировали при комнатной температуре в течение одной минуты, затем помещали в кипящую водяную баню на 40 секунд. После этого пробы центрифугировали 25 минут при 11000 об/мин. Супернатант переносили в новый эппендорф и добавляли 1/2 объема 7,5 М ацетата аммония, 0,6 объема изопропанола, перемешивали и сразу центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут. Осадок два раза промывали 70% этанолом. Подсушивали осадок при 37С в течение 30 минут, после этого к высушенному осадку добавляли 30-50 мкл буфера ТЕ (ЮмМ Tris (трис(гидроксиметил)аминометан)-НС1, рН 8,0; 1 мМ EDTA, рН 8,0) или дистиллированной воды.
Выделение хромосомной ДНК из клеток цианобактерий
50 мл двухнедельной культуры центрифугировали 20 минут при 4500 об/мин. Клетки, собранные центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл раствора (50 мМ Tris, 50 мМ EDTA), затем в 1 мл хлороформа. Перемешивали круговыми движениями в течение 5 минут. Затем инкубировали при комнатной температуре до образования верхней водной фазы, которую переносили в пробирки "эппендорф" и центрифугировали 20 минут (4500 об/мин). К осадку добавляли 1,4 мл STET и 100 мкл лизоцима (20 мг/мл). Растворенный осадок инкубировали при 37С а течение 20-40 минут. Добавляли SDS (додецилсульфат натрия) до конечной концентрации 2% и NaCl - до 0,5 М. Инкубировали смесь при 65С в течение 15 минут, добавляли равный объем хлороформа и центрифугировали 20 минут (4500 об/мин). К отобранному супернатанту добавляли 2,5 объема 96% этанола. Если на этой стадии образовывалась "медуза", ее 3 раза промывали в 500 мкл 70% этанола (3 минуты, 13000 об/мин). Сушили осадок при 37С в течение 30 минут, после этого к высушенному осадку добавляли 30-50 мкл буфера ТЕ или воды. Если "медуза" не образовывалась смесь инкубировали 20 минут на льду при 4С, после этого центрифугировали 20 минут (4500 об/мин). Осадок 3 раза промывали 500 мкл 70% этанола (3 минуты, 13000 об/мин), сушили при 37С (30 минут), после чего к высушенному осадку добавляли 30-50 мкл буфера ТЕ или воды.
Ферментативная обработка ДНК
В работе использовали ферменты производства фирм «MBI Fermentas» (Литва), «Amersham» (Великобритания), «New England Biolabs» (Великобритания), «Gibco BRL» (Великобритания). Реакционную смесь готовили согласно протоколу фирмы-изготовителя фермента. В смесь входили 10х буфер для рестрикции, соответствующие эндонуклеазы рестрикции, 1-2 мкг ДНК и Н20. Обработку препаратов плазмидных ДНК проводили в течение двух часов при оптимальных температурах рестрикции в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей. Разделение фрагментов, полученных в результате рестрикции, проводили стандартным электрофорезом в агарозном геле (Маниатис и др., 1984).
Для уменьшения количества нежелательных продуктов лигирования, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывали щелочной фосфатазой CIAP (из кишечника теленка). Для дефосфорилирования тупых концов количество фосфатазы использовали 10-кратный избыток фермента. Для удаления концевых фосфатов из 1 пмоль 5 -концов ДНК (1 пмоль 5 -концов линейной ДНК размером 4 т.п.н. равен 1,6 мкг) брали 0,01 ед. CIAP. Инкубировали смесь при 37С в течение часа (Маниатис и др., 1984).
Для образования кольцевой ковалентно замкнутой молекулы, состоящей из вектора и фрагмента, использовали ДНК-лигазу бактериофага Т4. Лигазная смесь содержала 1-2 мкг ДНК, 1 ед. Т4 ДНК-лигазы («Gibco BRL», Великобритания), буфер для лигирования, предлагаемый фирмой-изготовителем. Если производили лигирование по тупым концам, то вектор и фрагмент брали в молярном соотношении 1:5, если по липким концам, то 1:3 (Маниатис и др., 1984). Общий объем смеси составлял 10 мкл. Пробы инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
Электрофорез в агарозном геле
Для разделения фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР амплификации или рестрикции, а также для определения длин разделенных фрагментов, использовали электрофорез в агарозном геле. Электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 0,8% агарозном геле, приготовленном на ТВЕ буфере (0,089 М трис-борат, 0,008 М EDTA; концентрированный основной раствор (10х), на 1 л: трис 110 г, борная кислота 55г, 0,5 М EDTA, рН 8,0 40 мл (Маниатис и др., 1984), содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Пробы смешивали с 1/5 объема буфера для наслаивания (0,25% бромфеноловый синий, 40% сахароза). Электрофорез проводили при напряжении 3-5 В/см. В качестве маркера молекулярного веса использовали Hindlll/EcoRI фрагменты ДНК фага X или 100 bp DNA Ladder. После электрофореза анализ гелей проводился в УФ свете (360 нм).
Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов
Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов С целью выяснения, какие из компонентов ЭТЦ взаимодействуют с менадионом, была проанализирована устойчивость к данному хинону у мутантов лишенных отдельных дегидрогеназ, а также у мутанта с инактивированными оксидазами. Сравнение устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов показало, что мутант по гену drgA (лишенный МАО(Р)Н:хинон-оксидоредуктазы) и мутант по гену ndhB (лишенный NDH-1) характеризуются повышенной чувствительностью к менадиону как в фотоавтотрофных, так и в фотогетеротрофных условиях роста (в присутствии 10 мМ глюкозы и 20 мкМ DCMU). Мутанты с инактивированными сукцинатдегидрогеназой или НАО(Р)Н-дегидрогеназой NDH-2, а также мутант Ох, лишенный хинолоксидаз и цитохромоксидаз, по устойчивости к менадиону не отличались от клеток дикого типа. В фотогетеротрофных условиях роста все штаммы были более чувствительны к менадиону, чем в фотоавтотрофных условиях роста (Табл. 3).
Мутант, лишенный NDH-1, характеризуется отсутствием роста в фотогетеротрофных условиях (Ogawa, 1991). Поскольку NDH-1 участвует как в дыхательном, так и в циклическом транспорте электронов через ФСІ, чувствительность мутанта NDH-1 к менадиону может быть связана с нарушением электронного транспорта в тилакоидной мембране. Функция DrgA-белка оставалась не ясной.
Конструирование двойных мутантов.
Для того, чтобы выяснить функцию гена drgA, а также чтобы подтвердить, что продукт гена drgA действительно отвечает за устойчивость клеток к менадиону, мы ввели мутацию по гену drgA в клетки мутантов по другим дегидрогеназам и оксидазам и проанализировали характеристики двойных мутантов Synechocystis 6803. Поскольку указанные мутанты уже несли один или более генов антибиотикоустойчивости, необходимо было сконструировать рекомбинантные плазмиды, в которых ген drgA был бы инактивирован встраиванием гена устойчивости к дополнительному антибиотику.
Для инсерционной инактивации drgA использовали плазмиду pBHS (p\JC\9::drgA, Чеснавичене и др., 1994), несущую фрагмент хромосомной ДНК Synechocystis 6803 с геном drgA.
Мутант NDH-2 не устойчив к канамицину, поэтому для инактивации гена drgA использовали полученную ранее конструкцию drgA ::KmR (Чеснавичене и др., 1994). Для инактивации гена drgA у мутанта NDH-1 (ndhB::jxF) необходимо было сконструировать рекомбинантную плазмиду pBHS::CmR, несущую drgA с инсерцией Стк-кассеты. Для введения мутации в ген drgA мутантов SDH (slll625::KmR/sll0823::CmK) и Ох (ctaI::iirP/ctaII::SpK/cyd::EmR) была сконструирована рекомбинантная плазмида pBHS::GmR, несущая drgA с инсерцией GmR-KacceTbi (Рис. 13). Конструирование рекомбинантной плазмиды pUC19:: /r 4::CmR (pBHS::CmR).
Анализ нуклеотидной последовательности drgA с помощью программы Clone Manager выявил два уникальных сайта рестрикции для рестриктазы Smal. ДНК pBHS (pUCl 9:\drgA) обработали рестриктазой Smal, в результате чего в последовательности гена drgA образовалась делеция размером 252 п.н., на место которой была встроена Сшк-кассета из плазмиды pSL762 Е. coli (Рис. 9).
Стк-кассета в плазмиде pSL762::CmR фланкирована полилинкерными последовательностями, содержащими сайт для рестриктазы Smal. ДНК плазмиды pSL762::CmR обрабатывали рестриктазой Smal и после разделения фрагментов в агарозном геле элюировали фрагмент размером 1,3 т.п.н., несущий Стк-кассету. Лигированной смесью трансформировали компетентные клетки штамма E.coli TG-1 и отобрали CmR- клоны. Из отобранных клонов выделяли D плазмидную ДНК и анализировали рестрикцией на наличие вставки Cm -кассеты.
Рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды, с использованием ферментов рестрикции Smal и ЕсоШ (уникальный сайт для ЕсоШ находится внутри Стк-кассеты), подтвердил наличие вставки, соответствующих размеро: 1,3 и 3,7 т.п.н. и 5 т.п.н., соответственно (Рис. 10).
Конструирование рекомбинантной плазмиды pUCWiidrgAr.Gm (pBHS::GmR)
Анализ нуклеотидной последовательности drgA выявил уникальный сайт рестрикции для рестриктазы ВатШ (Рис. 11). Gmr-KacceTa в плазмиде рНР45 E.coli фланкирована полилинкерными последовательностями, содержащими сайт для рестриктазы ВатШ. ДНК плазмиды pHP45::GmR обрабатывали рестриктазой ВатШ и после разделения фрагментов в агарозном геле элюировали фрагмент размером 1,9 т.п.н., несущий GmR-кассету.
Расщепляли pUC\9::drgA по уникальному сайту рестриктазой ВатШ, затем элюировали ДНК p\JC\9::drgA/BamHl из агарозного геля. Очищенный вектор p\JC\9::drgA/Bam}{l дефосфорилировали и использовали для реакции лигирования с GmR-KacceToft. Лигированной смесью трансформировали компетентные клетки штамма E.coli TG-1 и отобрали GmR клоны. Из отобранных клонов выделяли D плазмидную ДНК и анализировали рестрикцией на наличие вставки Gm -кассеты.
Рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды с использованием рестриктаз ВатШ и Hindlll подтвердил наличие вставки соответствующих размеров: 4,0 т.п.н, 1,9 т.п.н. и 5,9 т.п.н. (Рис. 12).
Похожие диссертации на Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803
