Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Гиббереллин и его роль в регуляции роста стебля у растений 8
1.1. Гиббереллины и пути их биосинтеза 9
1.2. Мутанты с нарушенным биосинтезом гиббереллинов 12
1.3. Мутанты с измененной чувствительностью к гиббереллинам 15
1.4. Гены GRAS семейства и их роль в развитии высших растений 25
1.5. Генетический контроль индукции цветения у A. thaliana: роль генов гиббереллинового пути в инициации цветения у A. thaliana
2. Ауксиновые карликовые мутанты 30
3. Брассиностероидные карликовые мутанты 32
4. Генетический контроль развития AM побега 35 Материалы и методы 42
1. Растительный материал и условия выращивания растений 42
2. Морфологическая характеристика растений 42
3. Физиологические тесты 43
4. Метод сканирующей электронной микроскопии 44
5. Методы генетического анализа 45
5.1. Генетическое картирование с использованием морфологических маркеров
5.2. Генетическое картирование с использованием ДНК-маркеров 46
6. Изучение картирования генов методом ОТ-ПЦР 48
7. Методы статистического анализа 50 Результаты и обсуждение 51 1 .Морфологический анализ мутантов па и spy2 51
1.1. Анализ мутанта па 51
1.2. Анализ мутанта spy2 5 7
2.Генетический анализ 60
2.1. Локализация генов NA и SPY2 на классической генетической карте A. thaliana
2.2. Локализация гена NA на молекулярно-генетической карте А. thaliana
3. Анализ физиологической природы мутации 61
3.1. Влияние гиббереллина на всхожесть недозрелых и покоящихся семян
3.2. Влияние гиббереллина и паклобутразола на длину гипокотилей проростков высоких и карликовых растений
3.3. Влияние гиббереллина на растяжение клеток стебля карликового 69 мутанта па
3.4. Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта па 70
3.5. Влияние паклобутразола на рост мутанта па 71
3.6. Влияние НУК, БАП и брассиностероидов на рост гапокотиля и 72 корня проростков высоких и карликовых растений
4. Анализ физиологической природу мутации spy2 76
4.1. Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта spy2 76
4.2. Влияние паклобутразола на рост цветоноса мутанта spy2 11
4.3. Влияние фотопериода на время зацветания мутантов па и spy2 78
5. Анализ аллелизма и генных взаимодействий 81
5.1. Анализ аллелизма мутации па с мутацией gai и изучение взаимодействия генов NA, GAI и SPY1, контролирующих чувствительность к гиббереллину
5.2. Анализ взаимодействия гена NA с генами CLV1, CLV2, CLV3 и AS1, 84 влияющими на функционирование апикальной меристемы побега
5.3. Анализ аллелизма мутаций spy2 и spyl и изучение взаимодействия 87 renoBSPY2nSPYl
5.4. Анализ взаимодействия гена SPY2 с генами GAI и NA 89
5.5. Анализ взаимодействия гена SPY2 с генами, контролирующими 92
биосинтез гиббереллина GA3 и GA5
6. Анализ экспрессии генов, контролирующих биосинтез гиббереллинов и брассиностероидов, и генов, контролирующих рост побега в карликовом мутанте 94
Заключение 100
Выводы 105
Список литературы 106
- Гиббереллин и его роль в регуляции роста стебля у растений
- Влияние гиббереллина на всхожесть недозрелых и покоящихся семян
- Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта spy2
- Анализ аллелизма мутации па с мутацией gai и изучение взаимодействия генов NA, GAI и SPY1, контролирующих чувствительность к гиббереллину
Введение к работе
Гиббереллины (ГА) - важнейший класс фитогормонов, контролирующих различные процессы онтогенеза у растений. Одной из главных функций ГА является регуляция роста стебля. Исследования механизмов этого процесса не только занимают важное место в современной генетике и биологии развития растений, но и имеют большое практическое значение, поскольку рост стебля является одним из наиболее важных признаков в селекции растений. Получение и анализ мутантов с нарушением роста стебля является эффективным подходом для изучения генетического контроля передачи гормональных сигналов, а также координации их действия. Выявление новых компонентов сигнальных путей и изучение их взаимодействия с ранее идентифицированными генами позволяет искать оптимальные пути для управления процессами роста и создания новых форм, устойчивых к полеганию хозяйственно ценных растений.
Изучение генетической и фитогормональной регуляции процессов развития цветоноса удобно проводить на мутантах растений. Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. благодаря малому размеру генома, короткому жизненному циклу, высокой плодовитости, самоопыляемости является идеальным модельным объектом генетических исследований. В 2000 году было завершено полное секвенирование генома A. thaliana, что существенно облегчило эксперименты по молекулярному картированию генов, а также анализу генной экспрессии.
Исследования мутантов A. thaliana, гороха (Pisum sativum), кукурузы (Zea mays), риса (Oryza sativa) и других видов растений позволили показать важнейшую роль ГА и брассиностероидов в регуляции роста стебля и идентифицировать гены, контролирующие биосинтез и катаболизм этих гормонов, а также гены, участвующие в передаче гормональных сигналов. В настоящее время с помощью мутационного анализа идентифицированны гены A. thaliana, негативно регулирующих передачу брассиностероидного и ГА-сигналов, но до сих пор еще мало известно о генах - позитивных регуляторах и генах, кодирующих белки -рецепторы этих гормонов. Для выявления всех недостающих компонентов генетической регуляции, изучения их взаимодействия с ранее идентифицированными генами, а также понимания механизмов координации гормонов в формировании роста цветоноса необходимы дальнейшие исследования по получению и изучению мутантов с измененным ростом стебля.
Диссертационная работа проводилась на мутантах с нарушением роста стебля из коллекции кафедры генетики МГУ и коллекции ноттингемского университета (NASC): карликовых мутантах па, le, ga3, ga5, gai, и мутантах с удлиненным стеблем spyl и spy2. По данным проведенных ранее исследований гены GA3, GA5 кодируют ферменты биосинтеза ГА и нарушают последние этапы биосинтеза этого гормона (Hedden, Proebstin, 1999). Гены GAI и SPY1 участвуют в негативной регуляции передачи ГА-сигнала (Richards et al., 2001); мутация gai вызывает нечувствительность к ГА, а мутация spyl - конститутивную экспрессию ГА-ответа (Wilson, Somerville, 1995; Jacobsen et al., 1996). Роль остальных генов в регуляции роста стебля исследована далеко не полностью. Целью данной работы являлось генетическое и морфофизиологическое изучение мутантов па, spy2, le-2 из коллекции кафедры генетики МГУ, а также создание схемы генетического контроля передачи гиббереллинового сигнала у A. thaliana на основе анализа генных взаимодействий и изучения экспрессии генов.
Задачи исследования:
Морфофизиологический и генетический анализ мутантов из коллекции кафедры генетики МГУ.
Локализация генов NA и SPY2 на генетической и физической карте А. thaliana с использованием морфологических и ДНК-маркеров.
Изучение взаимодействия генов NA и SPY2 с другими генами, контролирующими рост побега, на основе анализа фенотипа двойных мутантов.
Анализ экспрессии генов биосинтеза ГА и генов, контролирующих рост побега, в растениях мутанта па.
Гиббереллин и его роль в регуляции роста стебля у растений
Существует более 120 различных форм гиббереллинов, и растения разных видов отличаются их спектром (Schomburg et al., 2002). Биосинтез ГА происходит главным образом в активно растущих тканях: в листьях и междоузлиях. Биологически активными формами являются ГАЬ ГА3, ГА4 и ГА7 (Hedden, Phillips, 2000).
У всех растений начальные этапы синтеза одинаковые. Первое вещество ГА биосинтеза, геранилгеранилпирофосфат (ГГПФ), синтезируется в пластидах изопреноидным путем из глицеральдегид 3-фосфата или из мевалоновой кислоты. Энт-каурен синтезируется путем 2-х ступенчатой циклизации ГГПФ через промежуточный продукт, энт-копалил пирофосфат (КПФ). Ферменты, катализирующие эти реакции, обладают соответственно А и В активностью энт-каурен синтазы (КПС и КС). Превращение энт-каурена в биологически активные гиббереллины происходит с помощью серии окислительных реакций и катализируется двумя типами ферментов. Ранние реакции, приводящие к уменьшению в кольце В числа атомов углерода от 6 до 5, происходят на внешней мембране пластид. Эти реакции катализируются цитохром Р450 зависимыми монооксигеназами, и в тканях побегов большинства растений приводят к возрастанию уровня ГА]2 и его 13 гидроксилированного аналога ГА53 (Helliwell et al., 1998, 2001). Метаболизм этих веществ требует присутствия растворимых диоксигеназ, которые используют в качестве косубстрата 2-оксоглутаровую кислоту. Для превращения ГАі2 и ГА53 в ГА4 и ГАї , соответственно, необходимо присутствие двух диоксигеназ: ГА 20-оксидазы и ГА Зр-гидроксилазы (Hedden, Phillips, 2000). Третья 2-оксоглутарат зависимая диоксигеназа гидроксилирует в 2/3 позиции и превращает активные формы гиббереллина в неактивные (Hedden, Proebsting, 1999) (рис.1).
Точно установлено, что внешние факторы, такие как фотопериодизм и температура, могут изменять метаболизм ГА. Перенос растений с короткого дня на длинный день вызывает возрастание уровня ГАї в несколько раз, особенно в субапикальных районах, с соответственным понижением содержания ГА5з и возрастанием ГА5з-метаболита. Это объясняется тем, что активность 20 оксидазы возрастает на свету и уменьшается в темноте. Подтверждено, что на длинном дне существует достаточная 20 оксидазная активность для увеличения концентрации ГАї выше порога, требуемого для восстановления нормального роста побега. Более высокая концентрация ГАї в растениях сопровождается повышением тканевой восприимчивости к ГА, то есть при недостатке света резко увеличивается чувствительность к ГА сигналу.
Вытягивание побега и цветение можно индуцировать радиактивным излучением при низкой температуре с последующим возвращением к высоким температурам. Тот же эффект наблюдается без индукции холодом при применении ГА. Наиболее активным из них является ГА9. Сайтом восприятия температурного сигнала считается верхушка побега, где при низких температурах аккомулируются ГАї и ГАз. При яровизации возрастает скорость биосинтеза ГА. В полной темноте синтез идет всего на 25%, тогда как при полном дне синтез повышен. Механизм термоиндукции биосинтеза гиббереллинов не известен, но предполагается, что обработка холодом стимулирует возрастание экспрессии генов, кодирующих ферменты биосинтеза (Hedden, Kamiya, 1997).
С помощью изучения мутантов показано, что ГА биосинтез модифицируется действием самого ГА по принципу регуляции конечным продуктом (Reid, 1993) (см. ниже).
Понимание генетического контроля биосинтеза ГА стало возможным после получения мутантов с нарушениями синтеза этого гормона. К этому классу мутантов относятся такие мутанты, как dl, d.2, dS, d5 - кукурузы, le, па, sin- гороха. Мутанты к и dl имеют блок в пути ЗР-гидроксилирования ГА53 до ГАЬ а ГА] является главным естественным ГА, контролирующим элонгацию побега и корня у видов, обладающих ранним путем 13 гидроксилирования (рис.1). Мутант sin характеризуется удлинением побега, причиной которого является блок в катаболизме ГАго Д ГА29 в развивающихся семенах, что приводит к сверхпродукции ГАї в молодых побегах (Reid, 1993).
Существует обширная группа мутантов A. thaliana с нарушенным синтезем ГА, полученная с помощью обработки быстрыми нейтронами и этилметансульфонатом (gal, ga2, ga3, ga4, ga5) (Chiang et al., 1995) (табл.1).
Семена мутантов gal, ga2 и ga4 не всходят без обработки ГА. Это рецессивные мутации, приводящие к карликовому фенотипу, снижению апикального доминирования, темно-зеленой окраске листьев. Данные мутанты восстанавливают фенотип дикого типа после обработки ГА. Гены GA1 и GA2 кодируют энт-каурен синтазу, и данные мутанты имеют блок А и В активности этого фермента, соответственно (рис.1). Ген GA3 кодирует энт-каурен оксидазу, GA 4 - ЗР-гидроксилазу, GA5 - 20-оксидазу (рис.1).
Менее строгий полукарликовый фенотип ga4 и ga5 мутантов по сравнению с фенотипом gal, ga2, ga3 мутантов можно объяснить тем, что существует несколько генов, кодирующих Зр-гидроксилазу и ГА20-оксидазу. Поэтому потеря активности одного фермента может быть частично восстановлена за счет активности других ферментов. Гены GA1, GA2, GA3 содержатся в геноме в единственном числе (Hedden, Proebsting,1999).
Известно, что ген GA4 экспрессируется преимущественно в стручках, а ген GA5 (AtGA20oxl) экспрессируется в стебле и имеет два гомолога (AtGA20ox2, AtGA20oxS), которые экспрессируются во флоральной меристеме и стручках и только в стручках, соответственно (Chiang et al.,1995; Phillips et al., 1995; Coles et al., 1999). Это свидетельствует об органоспецифичности действия этих генов (Hedden, Proebsting, 1999).
В 1995 году был выделен ген GA4, и было установлено, что он кодирует ЗР-гидроксилазу (рис.1). Уровень экспрессии гена GA4 в мутантных растениях был в 10 раз выше, чем в растениях дикого типа. При этом в мутантах не находили активного продукта этого гена. Это можно было объяснить либо быстрым разрушением мРНК, либо тем, что кодируется неактивная форма фермента. Нарушение ЗР - гидроксилирования в мутантах приводило к накоплению ГА9 и ГА2о и снижению уровня конечных продуктов биосинтеза ГА: ГА4 и ГАї (рис.2). Таким образом, предположили, что суперэкспрессию гена GA4 в мутантах ga4 можно объяснить тем, что существует механизм регуляции конечным продуктом. То есть продукт гена GA4 в норме должен негативно регулировать экспрессию гена GA4. Для проверки этой гипотезы мутантные растения обработали экзогенными ГА, что приводило к накоплению конечных продуктов биосинтеза. При этом снималась суперэкспрессия гена GA4 и восстанавливался механизм регуляции конечным продуктом (Chiang et al., 1995).
Влияние гиббереллина на всхожесть недозрелых и покоящихся семян
Ранее было показано, что гены NA и SPY2 расположены в верхнем плече 1-й хромосомы и наследуются сцепленно (Маманова, 1999). Для более точной локализации этих генов на генетичекой карте A. thaliana был проведен анализ F2 поколения от скрещивания линии, гомозиготной по мутации spy! и маркерной линии mmlL, а также F3 поколения от скрещивания линии, несущей мутацию па и мутацию spy! в фазе сцепления и маркерной линии mmlL. В данной линии имеются две морфологические мутаций, маркирующие верхнее плечо 1-й хромосомы: мутация an (суженный лист) и disl (аномальные трихомы). Анализ расщеплений в F2 и F3 показал сцепленное наследования генов NA и SPY2 с этими маркерными мутациями (табл. 6). Расщепление в F2 и F3 по признакам па и an и па и disl в потомстве цис-гетерозигот отличалось от расщепления 9:3:3:1 (высокие значения суммарных х2, табл.6), причем эти отклонения были вызваны главным образом сцеплением генов (высокие значения компонентов хг в табл.6). Расстояние между генами NA и AN соответствовало величине 3.4 сМ (по данным F2) и 3.6 сМ (по данным F3) и 3.5 сМ по объединенным данным. Частота рекомбинации между генами NA и DIS1 составила 14.0 + 1.1 %, что соответствует истинному генетическому расстоянию 14.4 сМ. Ген AN находится в 1-й хромосоме в положение 0 сМ (начало верхнего плеча) на классической генетической карте, а ген DIS1 на 19 сМ ниже него (www.arabidopsis.org). Полученные расстояния па-ап и na-disl хорошо согласуются с расстоянием 19 сМ, следовательно ген NA находится на генетической карте между генами ANuDISl (рис. 16).
Нами подтверждено также сцепление генов NA и SPY2, показанное ранее (Маманова, 1999). Расстояние между генами по нашим данным составляет 12.24 сМ, что согласуется с ранее установленным (12 сМ по данным Мамановой, 1999). Выявлено также сцепление SPY2 с маркерными генами an и disl. Величина перекреста AN - SPY2 составляет 14.1+1.1%, что соответствует генетическому расстоянию 14.5 сМ (табл. 6). Эти расчеты показывают, что ген SPY2 локализован на хромосоме 1 выше (левее), чем ген D1S1 (рис.16). Точного расстояния между генами SPY2 и DIS1 нам, к сожалению, экспериментально установить не удалось, поскольку среди растений F2 рекомбинантов spy2 disl не было обнаружено, что указывает на тесное сцепление генов SPY2 и DISL Примерный расчет (при условии наличия 1 рекомбинанта) показывает, что расстояние между NA и DIS1 должно быть меньше, чем 6.03 сМ (табл.6).
Если учесть, что ген DIS1 находится в положении 19сМ от гена AN (по данным (www.arabidopsis.org)), а ген SPY2 - в 14.5сМ от гена AN, то расстояние между мутациями spy2 и disl должно составлять 4.5 сМ. Для обнаружения рекомбинантов между генами, находящимися на таком расстоянии, требуется проанализировать около 1890 растений F2. Наша выборка составила 1860 растений F2, что, по-видимому, может объяснить отсутствие рекомбинантов spy2 disl. По нашим данным между NA и DIS1 - 14.4 сМ, а между NA и SPY2 - 12.2 сМ, то есть гены SPY2 и DIS1 сцеплены еще теснее (2.2 сМ).
Для молекулярного картирования было необходимо подобрать ДНК-маркеры, расположенные в районе локализации мутации па. Для расы Enkheim, из которой по данным основателя коллекции С.ИЛнушкевича была выделена линия, несущая исследуемую мутацию па (Янушкевич, 1984), полиморфизм ДНК по отношению к полностью секвенированному геному расы Columbia и частично секвенированному геному линии Lansberg erecta (Ler) практически не исследован. В базе TAIR (www.arabidopsis.org) содержаться лишь единичные маркеры для работы с расой Enkheim. В районе примерной локализации мутации па нам удалось обнаружить лишь 2 CAPS-маркера: 0846А, РТ14 и SSLP-маркер РТ15, выявляющие полиморфизм между расой Enkheim и лабораторной линией Ler. Информация об этих маркерах приведена в таблице 1 в разделе Материалы и методы. В наших экспериментах, однако, не было выявлено полиморфизма ни по одному из этих 3-х маркеров между расой Enkheim из коллекции кафедры генетики и линией Ler из той же коллекции.
Отсутствие полиморфизма в наших экспериментах, по-видимому, связано с некоторыми различиями между линиями, представляющими расу Enkheim. Линия К-2 (Enkheim) ведется на кафедре с 1972 года. За более чем 30 лет в ней могли накопиться изменения, которые, по-видимому, и обусловили различия наших данных с данными немецких исследователей, представленных в базе TAIR. Вместе с тем, полиморфизм по выбранным маркерам был обнаружен нами между расой Enkheim (К-2) и мутантом па (рис.17а,б,в). При работе с SSLP-маркером РТ15 размер амплифицированного фрагмента в линии К-2 составил 200 п.н., а в гомозиготе по мутации па - 270 п.н. (рис.17в). При работе с CAPS-маркером РТ14 амплифицированный фрагмент в линии К-2 (размером 155 п.н.) не имел сайтов рестрикции; у мутанта па после рестрикции данного фрагмента образовывалось 2 фрагмента размером 128 п.н. и 27 п.н. (не виден на геле) (рис.176). При использовании CAPS-маркера 0846А в линии К-2 после рестрикции образовывалось 2 фрагмента размером 733 п.н. и 510 п.н., у мутанта па - 2 фрагмента размером 490 п.н. и 1 фрагмент размером 263 п.н. (рис.17а).
Этот неожиданный факт полиморфизма ДНК мутанта и исходной линией К-2 ставит под сомнение вопрос о происхождении мутантнои линии, но позволяет использовать все 4 маркера для молекулярного картирования исследуемой мутации па.
Влияние паклобутразола на прорастание семян мутанта spy2
При выращивании карликового мутанта па на длинном дне на 28й день после посадки все мутантные растения находятся на стадии розетки, тогда как 47% растений дикого типа уже цветут (табл.8). К 93 дню после посадки практически все карликовые растения зацветают и дают стручки, как и растения дикого типа (табл.8). Т. е. на длинном дне карликовые растения зацветают, но их развитие замедленно по сравнению с растениями дикого типа. Мутанты spy2 на длинном дне зацветают раньше карликовых мутантов, хотя по сравнению с диким типом у них наблюдается задержка времени зацветания.
При выращивании растений дикого типа, мутантов па и spy2 в условиях короткого дня наблюдается задержка времени зацветания по сравнению с длинным днем у всех трех генотипов. Однако к 93 дню после посадки все растения дикого типа и мутанта spy2 зацветают и дают стручки, тогда как у карликового мутанта па зацветает всего 12 % растений (табл.8).
Таким образом, выращивание растений, гомозиготных по мутациям па и spy2, на коротком дне приводило к увеличению периода вегетативного роста и задержке времени зацветания, как и у растений дикого типа. Однако на коротком дне у мутант па зацветало лишь 12% растений, в отличие от растений дикого типа и мутанта spy2, у которых зацветали все растения. Это свидетельствует о том, что у мутанта па на коротком дне происходит нарушение процесса инициации цветения.
Нарушение времени зацветания у мутанта па были выявлены и при скрещивании растений, гетерозиготных по мутации па, с поздно зацветающими растениями расы Columbia. Различия по времени зацветания рас Columbia и Enkheim выражены ярче на коротком дне (на длинном дне 7 - 10 дней, а на коротком дне - 15 - 20 дней). При выращивании растений в условиях длинного дня гибриды Fj выглядели как кустистые растения, отличавшиеся от карликовых растений, гетерозиготных по мутации па, более мощной многолистной розеткой, и более поздним временем зацветания (не только по сравнению с расой Enkheim, но и по сравнению с Columbia), т.е. признак позднего зацветания наследовался как доминантный. В F2 наряду с типичными мутантами па (гетеро- и гомозиготными) и высокими растениями, которые зацветали одновременно с растениями Enkheim или Columbia, выщеплялись поздно цветущие растения с фенотипом Fi (гетерозигота по мутации па, с генами позднего цветения от расы Columbia), а также еще один новый фенотипический класс - растения с многочисленными волнистыми листьями, не способные к цветению или зацветающие на 20-30 дней позже, чем раса Columbia (гомозиготы па с генами позднего цветения) (рис. 27). В целом в F2 наблюдалось следующее расщепление: 33 гетерозигота и гомозиготы по мутации па с генами позд него цветения, 6 гетерозигота и гомозиготы по мутации па, 21 высокие растения,
Экспериментальные данные соответствуют ожидаемому расщеплению 9:3:4 при комплементарном типе взаимодействия генов (% 9:з.4=2.87; РО.95). Существенно более значимая задержка цветения у гетеро- и гомозигот по мутации па с генами позднего цветения от расы Columbia говорит о комплементарном взаимодействии гена NA с генами позднего цветения, а значит о совместном участии генов в регуляции инициации цветения.
У A. thaliana известно несколько параллельных путей контроля цветения: индукция цветения светом (на длинном дне) и несколько автономных путей, которые играют главную роль при переносе растений на короткий день (см. обзор литературы). Одним из автономных путей является путь, в котором участвуют гиббереллины. Влияние ГА на инициацию цветения связано с их влиянием на экспрессию ключевого гена морфогенеза цветка LFY (Blazquez et al., 1997), которое опосредовано регуляторными белками MYB-класса (Gocal et al., 2001). Кроме того, ГА усиливает транскрипцию гена FPF1, активность которого создает компетентность апикальной меристемы к флоральным сигналам, в том числе, к действию reHaZF7(Melzer et al., 1999). Именно поэтому у мутантов с нарушенным синтезом и измененной чувствительностью к ГА наблюдается изменение времени зацветания, которое наиболее ярко выражено на коротком дне. Ген LFY является также мишенью других путей инициации цветения, в том числе, связанных с продолжительностью фотопериода. При нарушении активности любого из путей, инициация цветения обеспечивается за счет активности других путей.
По-видимому, задержка цветения у мутанта па на коротком дне, а также у мутантов па с генами позднего цветения является результатом одновременного нарушения нескольких путей инициации цветения (гиббереллинового и светового).
Анализ аллелизма мутации па с мутацией gai и изучение взаимодействия генов NA, GAI и SPY1, контролирующих чувствительность к гиббереллину
Гибриды Fi от скрещивания мутанта spy2 с мутантом ga5 имели фенотип дикого типа. В F2 поколении выщеплялись двойные мутанты (рис.35), которые характеризовались увеличением общей высоты растений примерно в 2 раза по сравнению с высотой карликовых растений (spy2 ga5 - 24,7 см; ga5 - 9,6 см) и наличием 3-х розеточних побегов, как и у мутанта ga5 (табл.11). При этом средняя длина первого генеративного междоузлия практически не изменялась у spy2 ga5, тогда как средняя длина первого вегетативного междоузлия у двойного мутанта была увеличена примерно в 4 раза по сравнению с карликами (spy2 ga5 - 5.2 см; ga5 - 1.2 см) (табл. 11).
При скрещивании мутанта spy 2 с мутантом gaS гибриды F имели фенотип дикого типа. В F2 поколении выщеплялись двойные мутанты (рис.35), высота которых достигала 20.1 см, тогда как высота карликовых мутантов составляла 9.7 см (табл.11). При этом у двойного мутанта увеличивалась в 2 раза и средняя длина первого генеративного и вегетативного междоузлий (табл.11). Число розеточных побегов у spy2 gaS совпадало с числом розеточных побегов у gai и составляло 2.9 (табл.11).
Отметим, что мутация spyl также частично восстанавливала фенотип карликового мутанта gctl-2: всхожесть семян двойного мутанта spyl gal-2 достигала 100% (хотя семена мутанта gal-2 не способны всходить без обработки ГА), число розеточных листьев у двойного мутанта уменьшается в 2 раза по сравнению с карликовым мутантом, высота главного побега увеличивалась до 17.7 см по сравнению с высотой мутанта g&-2, составляющей 0.6 см (Jacobsen,
Olszewski, 1993) Таким образом, мутация spy2, также как и мутация spyl, частично восстанавливает карликовый фенотип мутантов ga3 и ga5, что свидетельствует о том, что ген SPY2, также как и ген SPY1, участвует в негативной передаче ГА -сигнала.
Известно, что у мутантов нечувствительных к ГА (GAI) нарушен уровень экспрессии генов биосинтеза ГА (GA4) (Silverstone et al., 2001). Это, по-видимому, связано с тем, что эндогенные гиббереллины, накапливаемые в мутантах, контролируют процесс биосинтеза ГА по принципу регуляции конечным продуктом.
В связи с этим в растениях дикого типа и мутантах па был проведен сравнительный анализ экспрессии гена GA4, кодирующего ключевой фермент биосинтеза ГА - 3/3 гидроксилазу, необходимого для образование активной формы гиббереллина ГА4. В качестве контроля за количеством выделенной мРНК гена GA4 и других генов анализировали транскрипцию гена АРТ1 (аденинфосфорибозил-трансфераза), характеризующегося конститутивной экспрессией в растениях A. thaliana. Количество продукта ОТ-ПЦР контрольного гена (а значит и содержание исходной мРНК) у растений дикого типа и гетерозигот по мутации па одинаково (рис.36). Следовательно, разница кДНК исследуемых генов в растениях дикого типа и мутанта па - является результатом разного уровня их экспрессии. Т.к., уменьшение концентрации исходной матрицы в 2 раза приводит к появлению амплифицированного продукта нужной концентрации на 1,5 цикла позднее (Лебедева, 2004г), то концентрация мРНК гена GA4 в мутантных растениях снижена примерно в 10 раз (рис.36). Это свидетельствует о том, что ген NA, контролирующие передачу ГА-сигнала, участвуют в авторегулировке содержания ГА.
