Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
1. Генетический контроль ранних этапов развития побега 7
2. Влияние транспорта ауксинов на развитие побега 15
3. Влияние гиббереллинов и брассиностероидов на рост стебля и листьев 19
4. Взаимодействие гормонов 22
5. Взаимодействие ауксинов и пероксидаз 24
6. Влияние пероксидаз на рост и развитие растений 26
7. Гены пероксидаз 28
Материалы и методы 30
1. Растительный материал и условия выращивания растений 30
2. Генетическое картирование 32
3. Физиологические тесты и культура ткани in vitro 32
4. Сканирующая электронная микроскопия 33
5. Определение активности и изоферментного состава пероксидаз 34
6. Выделение нуклеиновых кислот 36
7. Полимеразная цепная реакция (ГЩР) 38
8. Клонирование ПЦР-продуктов 42
9. Компьютерные методы анализа 43
10. Методы статистического анализа 44
Результаты и обсуждение 45
1. Морфологические и генетические особенности мутанта taeniata. 45
1.1. Генетический анализ линии К-122 45
1.2. Фенотипическая характеристика мутанта tae 46
1.3. Анализ экспрессии KNOX генов класса І в листьях мутанта tae. 52
Анализ последовательности гена AS2 и анализ экспрессии генов AS1 и AS2 у мутанта tae 55
Схемы возможного участия гена ТАЕ в генетической регуляции перехода меристемы побега к процессу морфогенеза 56
Изучение мутанта abruptus при помощи молекулярно- генетических методов анализа 59
Анализ взаимодействия генов ABRUPTUS'и IEAFY на основе характера экспрессии этих генов
59
Анализ последовательности мутантного гена аЪг 63
Морфологические особенности мутанта curly и локализация гена CURLY на I хромосоме 64
Морфологические особенности мутанта curly 64
Локализация гена CUR на генетической карте A.thaliana 68
Морфологические, физиологические и генетические особенности 70
Генетический анализ линии К-156 70
Морфологические особенности мутанта 1е-2 70
Изменение чувствительности к фитогормонам у мутанта 1е-2 73
Взаимодействие генов LE и CRG 79
Взаимодействие генов LE и NA 80
Анализ изменений спектра изоформ пероксидаз у мутанта pxd и локализация гена PXD на V хромосоме 90
Анализ наследования изменных изоформ пероксидаз 90
Анализ анионных изоформ пероксидаз в различных тканях растений 91
Влияние стрессовых факторов на активность изоформ пероксидаз, контролируемых геном PXD 98
Компьютерный анализ последовательностей генов пероксидаз 100
Локализация гена PXD при помощи молекулярных маркеров 107
5.6. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 115
пероксидаз Р53 и Р54
Заключение 124
Выводы 128
Список публикаций по теме диссертации 129
Благодарности 131
Список литературы 132
- Влияние гиббереллинов и брассиностероидов на рост стебля и листьев
- Определение активности и изоферментного состава пероксидаз
- Схемы возможного участия гена ТАЕ в генетической регуляции перехода меристемы побега к процессу морфогенеза
- Анализ изменений спектра изоформ пероксидаз у мутанта pxd и локализация гена PXD на V хромосоме
Введение к работе
Развитие цветоноса растения - сложный многоэтапный процесс, зависящий от множества факторов внутренней и внешней среды. Среди внешних факторов основными являются продолжительность фотопериода и интенсивность света, температурные условия, питание и влажность, а также стрессовые факторы. При помощи рецепторов растение получает сигналы из внешней среды и реагирует на них изменением активности генов. Активацией и репрессией генов осуществляется полный контроль всех внутренних процессов в растении. Гормональные сигналы являются основным связующим звеном координации развития и ответных реакций различных частей растения. Каждый из этапов развития: формирование вегетативной меристемы, закладка и развитие латеральных органов - листьев и пазушных меристем, а затем переход вегетативной меристемы во флоральную, контролируется множеством генов, которые состоят в сложной иерархии, изученной в настоящее время лишь частично. Выявление новых компонентов, установление их функции и связи с другими факторами этой системы является основной задачей изучения развития растений, в решении которой большую роль играет анализ мутантов. В результате исследования мутантов1 растений сейчас созданы первые генетические модели эмбрионального развития, роста междоузлий, индукции цветения и морфогенеза цветка. Однако эти модели еще далеко не полные, поиск и изучение новых генов способствует их дополнению и коррекции.
Плейотропные эффекты многих генов не позволяют рассматривать основные процессы, которые они контролируют, отвлеченно от других. Так, например, известно, что пероксидазы растений участвуют в защите от окислительного стресса (Smith, Hammerschmidt, 1988). Однако пероксидазы окисляют широкий спектр органических субстратов и продукты их окисления оказываются вовлеченными в другие весьма важные процессы. Показано, что пероксидазы оказывают влияние на процессы роста и морфогенеза растения, участвуя в процессах биосинтеза лигнина и деградации ауксина (Quiroga е/ ah, 2000; Savitsky et al., 1999). Сопряженность процессов развития с адаптивными реакциями растений на окислительный стресс, вызванный как внешними стрессовыми факторами, так и внутренними процессами, является следствием прикрепленного образа жизни и особенностей онтогенеза растений.
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., благодаря малому размеру генома, миниатюрности, самоопыляемости и высокой плодовитости растений в настоящее время стал излюбленным объектом генетических исследований. К 2000 году было завершено полное секвенирование генома Arabidopsis. Содержание в базах данных этой и многочисленной другой информации во многом упрощает задачу исследований. Так, например, после определения функции гена и его картирования можно провести анализ генов, расположенных в области его локализации и определить наиболее вероятных кандидатов на роль исследуемого гена, и дальнейшие исследования, в первую очередь, проводить с этими кандидатами. Однако, несмотря на ценность информации, содержащейся в базах данных, функции большей части генов еще неизвестны, также ограниченную информацию можно получить о взаимодействии генов путем анализа баз данных. Поэтому исследование и локализация мутаций, а также анализ взаимодействия генов с использованием мутантов по-прежнему актуальны.
Цели и задачи исследования:
1. Генетический и морфо-физиологический анализ мутантов с изменениями структуры побега.
2. Локализация генов на генетической карте A. thaliana.
3. Изучение взаимодействия генов на основе анализа двойных мутантов и характера генной экспрессии; построение схем генетической регуляции процессов роста и развития побега.
4. Анализ структурно-функциональных особенностей генов ABR, AS2 и трех генов пероксидаз у растений дикого типа и мутантов.
Влияние гиббереллинов и брассиностероидов на рост стебля и листьев
В основе морфогенеза растений лежат скоординированные во времени и пространстве процессы деления и растяжения клеток. Существует множество доказательств, что в регуляции деления и растяжения клеток участвуют гормоны растений, в первую очередь гиббереллины, брассиностероиды (БС), ауксины и цитокинины. Снижение: эндогенного содержания ГА и БС у мутантов с нарушениями их биосинтеза или чувствительности приводит к; резкому сокращению длины гипокотиля, стебля, размеров листьев и других органов.
ГА мутанты Arabidopsis thaliana подразделяются на две группы: мутанты с нарушенным синтезом ГА (gal, ga2,ga3, ga4, ga5) (Hedden, Proebsting, 1999) и мутанты с нарушением передачи ГА-сигнала (gai и .s/гі) (Koornneef et al., 1985; Fridborg et al., 1999). Обе группы мутантов характеризуются карликовым фенотипом. ГА-дефицитные мутанты, в отличие от мутантов с измененным ответом, способны восстанавливать дикий фенотип после обработки активной формой гиббереллина. Нарушение катаболизма ГА приводит к его накоплению, так, у мутанта гороха slender (sin) накопление ГА происходило в семенах. При прорастании такие мутанты формировали удлиненные междоузлия (Jaranowski, 1976; Reid et al., 1992). К сожалению, рецепторы ГА еще не идентифицированы. Итак, рост стебля у A.thaliana регулируется как генами, контролирующими синтез и катаболизм ГА, так и генами, отвечающими за передачу ГА-сигнала.
Помимо ГА важную роль в регуляции роста стебля играют гены, контролирующие биосинтез БС, а также гены, участвующие в восприятии и передаче БС сигнала. Оба класса мутантов имеют характерный фенотип - это темно-зеленые карлики, которые, в отличие от ГА-мутантов, в условиях этиолированного роста проявляют световой ответ, то есть формируют укороченные гипокотили, открытые семядоли и начинают формировать хлоропласта и хлорофилл, что предполагает потенциальное взаимодействие между БС и световыми сигнальными путями (Krizek, Mandava, 1983). БС дефицитные мутанты - dwfl (dwarf1), det2 (deetiolated), cpd (constitutive photomorphogenesis and dwarfism), dw/4 (dwarf4) (Li et al., 1996; Szekeres et al., 1996; Fujioka et al., 1997; Azpiroz et al., 1998; Choe et al., 1998). Растения с нарушениями биосинтеза БС имеют округлые эпинастичные листья, у них наблюдается задержка цветения и старения, ослабление апикального доминирования (Рис. 6). У мутанта cpd наблюдается редукция дифференциации ксилемы, что предполагает потенциальное ингибирование апоптоза, необходимого для нормального ксилогенеза (Szekeres et al., 1996). В биосинтезе БС ведущая роль отводится цитохромам Р450, их кодируют два гена - CPD и DWF4. Белок CPD катализирует конечный продукт биосинтеза БС - брассинолид (Szekeres et al., 1996).
Нечувствительность мутанта к экзогенному применению БС, как правило, свидетельствует о мутации в гене, принимающем участие в сигнальном пути БС. Мутант bril (brassnosteroid insensitive) был идентифицирован по способности его корней к нормальному росту в присутствии БС (Clouse et al., 1996). Ген BRI1 кодирует LRR-RLK, подобно гену CLVJ (Li, Chory, 1997). Его экспрессия была обнаружена во всех тканях растения. Белок BRI1 был локализован на плазматической мембране, это предполагает, что он может функционировать как рецептор для внеклеточных лигандов (Friedrichsen et al., 2000).
Обратная регуляция конечным продуктом генов биосинтеза обычна для гормонов растений. Например, обработка растений экзогенным этиленом ингибирует дальнейшую продукцию этилена (Yang, Hoffman, 1984). Для ГА и БС также есть доказательства негативной регуляции после применения гормона. Например, обработка БС приводила к понижению уровня мРНК CPD гена (Mathur et al., 1998). Продукт гена BRI1 также необходим для обратной регуляции биосинтеза БС. Возможно, BRI1 фосфорилирует клеточные белки, которые прямо или косвенно регулируют активность или транскрипцию БС биосинтетических белков, таких как CPD. Фосфорилирование может приводить к транскрипции/трансляции репрессора биосинтеза БС (Noguchi et al., 1999).
Интересно, что поиск других нечувствительных к БС мутантов на первых порах приводил только к идентификации новых аллелей BR11. Это указывает на то, что BRI1 является основным компонентом восприятия БС сигнала. Только в 2001г. удалось идентифицировать мутацию с высокой экспрессивностью — Ып2 (brassinosteroid insensitive-2). Протеинкиназа BIN2 осуществляет негативную регуляцию в сигнальных путях БС (Li et al., 2001; Li, Nam, 2002).
Чтобы расширить понимание сигнальных путей БС, был проведен поиск мутации с высокой экспрессивностью, которая способна супрессировать мутацию Ьги В результате удалось идентифицировать доминантную мутацию brsl-lD (bril supressor dominant), которая приводит к суперэкспрессии белка серии карбоксипептидазы. Однако brsl-lD супрессирует только тот аллель bril, который несет мутацию в LRR домене, но не способен взаимодействовать с внутриклеточным киназным доменом. Также не наблюдалось супрессии мутаций по биосинтезу БС. Предполагается, что BRS1 может воздействовать на белок, который необходим для восприятия брассинолида. Например, BRS1 переводит стерол-связывающие белки из неактивной формы в активную или BRS1 может использовать BRI1 как потенциальный субстрат, чтобы произвести активацию рецептора брассинолида (Li et al., 2001).
Брассинолид является негативным регулятором большого количества генов, которые конститутивно экспрессируются у мутантов с нарушениями биосинтеза БС, таких как cpd (Szekeres et al.,. 1996),.но только отдельные БС-индуцибельные гены были идентифицированы. Один из таких генов - CDC2b циклин-зависимая. киназа, индукция экспрессии которой происходит под; воздействием БС в отсутствие света (Yoshizumi et al., 1999). Это предполагает, что БС могут оказывать влияние на регуляцию клеточного цикла (Bishop, Koncz, 2002).
Определение активности и изоферментного состава пероксидаз
Материал фиксировали в 4% глютаральдегиде в 0,025 М фосфатном буфере (рН 7,0) при 4С в течение 18 часов, инкубировали в 2% Os40 (ночь), 3 раза смывали фосфатным буфером, обезвоживали серией спиртов (30%, 50%, 70% и 80% - по 10-15 минут, 96% - 2 раза по 30 минут), переносили в 100% ацетон на 1 час. Образцы сушили в жидком СО2 и напыляли Pt-Pd слоем 150 А. Использовали СЭМ S-450A фирмы "Hitachi" с ускоряющим напряжением 15 кВ. Измерение размера клеток и подсчет количества устьиц на верхней и нижней поверхностях розеточных листьев проводили на изображениях, полученных с помощью сканирующей электронной микроскопии (в каждом варианте измеряли длину 20 клеток с 5 разных растений).
Использовали растения на стадии начала цветения (25 сут после прорастания) и каллусы, полученные после 1 мес. культивирования. Навески тканей растирали в микропробирках Eppendorf в буферном растворе (0,4М Tris/HCl рН 6,8) в соотношении 1:1 при помощи тефлонового пестика и с добавлением кварцевого песка. Гомогенат центрифугировали 15 мин при 13 OOOg. На мембрану «сынпор» (фирма «Семапол» Чехия) наносили по 5 мкл экстракта. Мембрану инкубировали 5мин. в 0,2% растворе амидового черного в: 7% уксусной кислоте, затем дважды отмывали в дистиллированной воде: Окрашенный белок экстрагировали с мембраны 3 мл 0,1% NaOH в 50% спирту. Количество белка определяли спектрофотометрически при 63 0 нм. Расчет проводили по калибровочной кривой, которую строили, используя этот же метод, только вместо экстракта ткани брали различные разведения белка (пероксидазы хрена).
Навески по 0.25 г растирали в фарфоровой ступке в 1 мл 0.15М фосфатного буфера (рН 5.5) и центрифугировали 15 мин при» 13 OOOg. Пероксидазную (КФ 1.11.1.7) активность в экстрактах определяли спектрофотометрически при 470 нм, используя гваякол в качестве субстрата. За единицу пероксидазной активности принимали количество экстракта, катализирующее превращение 1 нМ субстрата в минуту (Chance et al., 1955).
Каждую серию опытов проводили.«. в трех повторностях, по 3-5 растений в каждой; данные обрабатывали статистически.
Белки выделяли из различных органов растений и каллусов. Навески тканей растирали в микропробирках Eppendorf в буферном растворе (0,4М Tris/HCl (рН 6,8), сахароза 10%). Соотношение количество ткани: буферный раствор составляло: для корней -1:4, для каллусов - 1:10, для остальных тканей - 1:1. Гомогенат центрифугировали в течение 15 мин. при 13 000g.
Для сравнения активности изучаемых изоформ между диким типом и мутантом по интенсивности окрашивания полос на геле перед проведением электрофореза определяли общее количество белка и проводили выравнивание концентраций белка в экстракте.
Растения выращивали на среде Квитко (Квитко, 1960) при 22-24 С и 16 ч освещении до стадии зацветания. При изучении влияния гипер- или гипотермии, растения выдерживали при температуре 42вС в течение 5 ч, либо при температуре 3С в течение 4-х сут. Растворами ИУК (10 мкМ) или параквата (50 мкМ) опрыскивали однократно. На четвертые сутки после обработки навески стеблей растений гомогенизировали в Tris буфере в соотношении 1:1 и центрифугировали (как описано выше), выравнивали концентрацию общего белка в экстракте и использовали для проведения электрофореза в ПААГ. проводили по методике Davis (Davis, 1964) с модификациями.
Использовалась вертикальная электрофоретическая камера производства фирмы «Хеликон» (Россия). Состав растворов для ПААГ приведен в Табл.3.
Электрофорез проводили при 4С, напряжении 170 В и силе тока 60 мА в течение 5 часов. После электрофореза гели помещали в буферный раствор для окрашивания и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Окрашенные гели фиксировали в 70% спирте в течение 15 мин.
Гели сканировали с помощью сканера Scan Magic (9636S). Профили получали при помощи компьютерной программы Scion Image, работающей по= принципу денситометра. Калибровка производилась по максимально затемненному участку на геле. Процент активности вычислялся по высоте пиков соответствующих полос на геле.
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ). Работа проводилась совместно с Всероссийским институтом картофельного хозяйства.
Навески тканей гомогенезировали в буфере: 0,05М Tris/HCl (рН 8,3); 0,1% аскорбат; в соотношении 1:1. Использовалось оборудование фирмы «LKB» (Швеция). ИЭФ пероксидаз проводили в диапазоне амфолинов (фирма «Amersham farmacie») рН 3.5-10 в пластинах ПААГ (акриламид 5%), в диапазоне напряжения 125-1800 В, при силе тока 25 мА. Окрашивание гелей проводили, как описано выше для вертикального гель-электрофореза (Бургутин и др, 1994). (по Dellaporta et al., 1983, с модификациями).
Навески ткани 50-150 мг растирали в жидком азоте в фарфоровой ступке, переносили в микропробирку Eppendorf. Добавляли 500 мкл TES-буфера (ЮОмМ Tris/HCl (рН 8,0); 10мМ; ЭДТА; 2% додецилсульфат Na). Инкубировали 45 мин. при 60С. Добавляли 0,2 объема 5М NaCl и ОД объема 10% ЦТАБ. Инкубировали 10 мин. при 65С. Добавляли 0,75 объема смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1), перемешивали. Центрифугировали 10 мин. при 14 000 g. Верхнюю фракцию переносили в новую пробирку, добавляли 1 объем 5М ІЛСТ в 80% этаноле. Осаждали не мене 2-х часов при -20С. Центрифугировали 30 мин при 14000g, жидкость сливали и промывали осадок 70% этанолом. Осадок высушивали и растворяли в деионизованной воде.
Схемы возможного участия гена ТАЕ в генетической регуляции перехода меристемы побега к процессу морфогенеза
У мутанта tae наблюдается повышение экспрессии гена AS2, это может происходить тремя путями: во-первых, сам ген ТАЕ является непосредственным негативным регулятором AS2; во-вторых, существует обратная позитивная регуляция AS2 геном/генами KNAT (KNAT1, KNAT2 и KNAT6), и увеличение экспрессии KNAT у мутанта приводит к повышению экспрессии AS2; в-третьих, какие-либо другие неизвестные гены регулируются геном ТАЕ, и, в свою очередь, регулируют AS2.
На основании анализа литературных данных и данных, полученных нами, можно построить две схемы взаимодействия гена ТАЕ с другими генами (Рис.14).
Согласно первой схеме ТАЕ подавляет действие STM, позволяя, таким образом, экспрессироваться генам AS1 и AS2 (AS), которые, в свою очередь, подавляют экспрессию KNAT. Этот механизм включается при развитии органа, когда происходит дифференцировка клеток. Гены STM и KNAT поддерживают меристематическую функцию клеток AM. Отсутствие активности гена ТАЕ у мутанта приводит к экспрессии STM в листьях, который негативно регулирует гены AS, снимая репрессию с генов KNAT. Наличие экспрессии генов AS в листьях мутанта tae не противоречит этой схеме, так как характер экспрессии ТАЕ неизвестен, а исследования экспрессии других генов проводились на целых листьях. Возможно, что репрессия генов AS происходит только в зонах формирования эктопических меристем, а в остальных областях листа AS продолжают экспрессироваться. Кроме того, возможно, STM является не единственным регулятором активности AS, и у этих генов существуют другие позитивные или негативные регуляторы.
Вторая схема предполагает, что ТАЕ является негативным регулятором STM и одновременно KNAT, действуя независимо от AS1 и AS2.
Гены KNATI, KNAT2 и KNAT6 имеют несколько генов - негативных регуляторов, одним их которых является ТАЕ. Анализ одиночных мутантов показывает, что нарушение функции любого из этих генов приводит к экспрессии KNAT. Таким образом, для подавления экспрессии KNAT необходимо одновременное действие всех этих негативных регуляторов. Как осуществляется их действие пока неясно, известно только, что белки AS 1 и AS2 образуют комплекс, который и является репрессором KNATI (Xu et al., 2003).
Итак, у мутанта tae была обнаружена эктопическая экспрессия всех KNOX генов класса I, что отличает его от других подобных мутантов, кроме того, мутант tae имеет иной и гораздо более яркий фенотип, чем одиночные мутанты asl, as2, bopl,fil иуаЬЗ. Эти данные позволяют сделать вывод, что нами идентифицирован новый ген — регулятор гомеобоксных генов более высокого порядка.
Ранее Полянской и др. (1997) было показано, что содержание ИУК в растениях мутанта tae в 2 раза ниже (25.9 нг/г сырого веса), чем в растениях дикого типа (51.9 нг). Каллусные культуры мутанта tae отличались от каллусов из растений дикого типа не только очень слабым каллусогенезом и медленным ростом каллусов, но и полной утратой способности формировать побеги на средах с различным содержанием гормонов. Так, например, на среде содержащей 0,2 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК мутанты не формировали побеги, в то время как на каллусах дикого типа на тех же средах образовывалось до 4 побегов, что может быть связано со снижением эндогенного содержания ИУК. Вместе с тем, по-видимому, это не является единственной причиной изменений роста и морфогенеза in vitro, о чем свидетельствует неспособность экзогенного ауксина восстанавливать эти изменения.
Как упоминалось в обзоре литературы, предполагается существование связи между действием ауксина и репрессией STM (Barton, 2001). Это предположение и наши данные об эктопической экспрессии STM и пониженном содержании ИУК у tae хорошо согласуются друг с другом. Последние данные указывают на решающую роль ауксина в установлении филлотаксиса (Reinhardt et al., 2003), поэтому нарушение филлотаксиса у мутанта toe также может быть связано с понижением эндогенного содержания ауксина.
Изучение мутанта abruptus (abr) происходило в лаборатории генетики растений кафедры генетики МГУ в течение нескольких лет. Ранее была проведена подробная морфологическая и физиологическая характеристика мутанта, а также анализ взаимодействий гена ABR с другими; генами на основе фенотипов двойных мутантов (Ежова и др., 2000). В связи с этим в задачи исследования входило дальнейшее изучение мутанта с применением молекулярно-генетических методов анализа.
Двойные мутанты abr Ify, в отличие от одиночного мутанта abr, не были способны к формированию флоральной меристемы. У них также не наблюдалось образования дополнительных стеблевых листьев и побегов, которые должны были бы сформироваться в результате замены части цветков на побеги в отсутствии функции - гена LFY. На дистальных участках булавковидных стеблей одиночного мутанта abr обнаруживаются следы от намеченных, но остановившихся в развитии фл оральных меристем. На стеблях двойных мутантов таких следов никогда не обнаруживалось. Был сделан вывод, что продукт гена ABR важен на самых ранних этапах формирования примордиев, когда сами морфогенетические события еще не начались, а уже дальнейшее развитие зависит от гена LFY. Следовательно, основная функция гена ABR в растениях дикого типа - разметка органов цветоноса на 2-ой стадии его развития, которые под действием гена LFY превращаются во флоральную меристему (Ежова и др., 2000).
Эпистаз гена ABR над геном LFY свидетельствует о том, что продукт гена ABR необходим на более ранних этапах формирования г фл оральной меристемы, чем продукт гена LFY (Ежова и др., 2000). Это может означать, что отсутствие цветков у мутанта abr - следствие снижения транскрипции гена LFY. Для проверки этого предположения анализировали транскрипцию LFY в верхушках цветоносов растений дикого типа и мутанта abr методом количественной ОТ-ПЦР (Рис.15).
Анализ изменений спектра изоформ пероксидаз у мутанта pxd и локализация гена PXD на V хромосоме
Пероксидазы классифицируются как кислые (анионные) и основные (катионные) в соответствии с их рГ числом. Моноклональные антитела кислых форм пероксидаз не реагируют с основными формами, и наоборот, антитела основных форм не реагируют с кислыми (Sadvakasova etal., 1993; Alba, 1997). Это указывает на структурную разницу кислых И; основных молекулярных форм пероксидаз.
Анализ пероксидаз методом изоэлектрофокусирования показал отсутствие изменений у мутанта pxd среди изоформ катионных пероксидаз (с pi от 6.8 до 9.6), всего выявлено 10 изоформ (Рис. 33). А также подтвердил наличие изменений спектра анионных пероксидаз в области рГ 3.8 - 4.2: Максимальное количество катионных изоформ, так же как и анионных, обнаружено в цветках и бутонах (корни и каллусы не исследовались). Измененные изоформы пероксидаз мутанта отличались от соответствующих изоформ растений дикого типа по своему заряду: изоэлектрическая точка (pi) пероксидаз дикого типа составляет 3.8, а мутанта pxd — 4.2. Следует отметить, что при нативном электрофорезе, разделяющем молекулы одновременно по заряду, массе и конформации, у мутанта наблюдается увеличение подвижности измененных изоформ, в то время как изоэлектрическое фокусирование свидетельствует об уменьшении отрицательного заряда.. Следовательно, молекулы измененных изоформ стали более компактными и/или уменьшилась их масса (Лебедева и др., 2003).
Приведенные выше результаты не отвечают на вопрос о том, произошла ли мутация pxd в гене, кодирующем саму пероксидазу, или в гене, продукт которого влияет на посттранскрипционную или посттрансляционную модификацию пероксидазы. Если изоформы 8; 9; 10 кодируются одним геном, то различия между ними обусловлены разной модификацией мРНК или белка. Нельзя исключить, что продукт гена PXD не является пероксидазой, но способен влиять на посттранскрипционные или посттрансляционные процессы модификации пероксидаз, кодируемых одним геном или разными генами. Так, например, можно предположить, что ген PXD кодирует гликозилтрансферазу, которая присоединяет гликаны к продуктам трех разных генов. В этом случае мутация pxd, влияющая на активность этого фермента, может приводить к сходному изменению электрофоретической подвижности трех изоформ. Это предположение, однако, плохо согласуется с данными о кодоминантном наследовании измененных форм пероксидаз: у гибридных растений, несущих нормальный и мутантный аллель гена-модификатора PXD, следовало бы ожидать появление изоформ, свойственных дикому типу (мутации, нарушающие активность ферментов, как правило, рецессивны).
Известно, что гены, кодирующие пероксидазы растений, различаются по реакции на стрессовые воздействия (Hiraga et al., 2000). Мы провели изучение влияния стрессовых воздействий на активность анионных пероксидаз в стебле растений, где выявляется лишь одна из изоформ, регулируемых геном PXD (Рис. 34). Воздействие повышенной температурой (42С) увеличивало активность изоформы 9 на 17% у растений дикого типа и на 32% у мутанта, а холодовой стресс (3С) снижал ее активность на 10% у дикого типа и 7% у мутанта. Паракват: индуцирует окислительный стресс, обработка растений мутанта раствором параквата (50 мкМ) повышала активность изоформы 9 на 21%.
При действии высокой концентрации ИУК (10 мкМ) также наблюдается увеличение активности изоформы 9 на 11% у дикого типа и на 17% у мутанта. Из приведенных данных следует, что ИУК может усиливать экспрессию гена, кодирующего изоформу 9. Кроме того, проявляется слабая активность изоформы 7, характерной для каллусов и корней. Изоформа 5, которая в обычных условиях в стебле и других органах растений не обнаруживается и присутствует только в каллусах, проявляется при воздействии ИУК, гипертермии и обработке паракватом.
Увеличение активности изоформы 9 при воздействии на растения ИУК, гипертермии и параквата, позволяет сделать вывод, что пероксидазы, контролируемые геном PXD, играют определенную роль в стрессовом ответе.
Повышение пероксидазной активности, контролируемой геном PXD, наблюдалось как у растений дикого типа, так и у мутантной линии: по-видимому, мутация pxd не нарушает способность воспринимать стрессовый и гормональный сигналы и отвечать на них изменением пероксидазной активности (Лебедева и др., 2003). Изменение уровня экспрессии некоторых пероксидазных генов в ответ на стрессовые воздействия обнаружено и у других объектов. Так, среди 21 исследованных генов пероксидаз риса у 7 отмечено повышение, а у 2 - снижение уровней экспрессии; при УФ облучении, действии параквата, этилена, метилжасмоната (Hiraga et al., 2000). Подавление экспрессии гена пероксидазы табака ТОР А отмечалось под воздействием ИУК (Lagrimini, 1996).
В 5 нетранслируемой области мРНК многих пероксидаз A. thaliana обнаружено высокое содержание аденина (40-70%), что указывает на возможное наличие последовательностей, вовлеченных в регуляцию экспрессии на уровне трансляции. Такие последовательности характерны для генов многих стрессовых и гормон-регулируемых белков (0stergaard et al:, 1998).
Среди всех анионных изоформ пероксидаз ген PXD контролирует самые активные, которые присутствуют во всех исследованных органах растений и в каллусных культурах. Недавно с помощью методов молекулярной: гибридизации (Tognolli et al, 2000, Tognolli et al., 2002) среди 23-x генов пероксидаз A. thaliana было выявлено несколько генов, транскрибирующихся в большинстве органов и тканей. Учитывая сложность анализа транскрипции гомологичных генов методами гибридизации кДНК-РНК и тот факт, что в геноме A: thaliana имеется 73 гена предполагаемых пероксидаз (Tognolli et al, 2002), мы;провели оценку уровней экспрессии всех генов пероксидаз по частоте. встречаемости в базах данных EST последовательностей (expressed sequence tags - последовательности- кДНК, гомологичные мРНК). Очевидно, что активно транскрибирующиеся гены должны быть наиболее широко представлены в базах данных EST. Поскольку для большинства EST имеются сведения о типе органов и тканей, из которых выделялась исходная мРНК, анализ EST позволяет получить информацию о специфичности экспрессии конкретных генов.
