Введение к работе
Актуальность темы. Проблема гена, его структурной и функциональной организации является центральной на всем протяжении существования генетики как экспериментальной науки. После фундаментальных открытий, касающихся роли ДНК как материального носителя наследственности, расшифровки ее структуры и генетического кода, принципиальным шагом в решении этой проблемы стало создание технологии клонирования фрагментов ДНК самых разнообразных видов. Это открыло широкие перспективы для перехода исследований гена на молекулярный уровень. Трудно переоценить значимость открытия возможности клонирования отдельных генов. В частности, оно привело к расшифровке нуклеотидных последовательностей геномов целого ряда видов, включая человека. Последнее событие произошло в 2000 году и на его фоне достаточно громко прозвучало другое событие - в этом же году впервые была расшифрована полная нуклеотидная последовательность генома одного из видов высших растений, а именно Arabidopsis thaliana.
Однако функции уже расшифрованных нуклеотидных последовательностей в большинстве случаев остаются невыясненными. В результате основная проблема генетики сегодня связана с выяснением функции генов, нуклеотидный состав которых известен.
Следует отметить, что число локализованных, клонированных и секвенированных генов высших растений на порядок меньше, чем у животных, в первую очередь млекопитающих и в том числе у человека. Эта ситуация была характерна для конца 90-х годов прошлого столетия и она сохраняется до настоящего времени. Вместе с тем, высшие растения позволяют в полной мере реализовать идеи и методы генной инженерии на пути создания методологии направленной модификации геномов для получения видов с заданным набором хозяйственно - полезных признаков.
При реализации этого подхода ключевую роль играет A. thaliana -модельный объект высших растений, для которого определена полная
нуклеотидная последовательность генома. Перспективы использования А. thaliana в качестве основного источника генов для модификации хозяйственно - ценных культур очевидны (Flavell R.B. Crop Improvement -The Role of Discoveries in Model Species. Plant & Animal Genomes XIII Conference. January 15-19, 2005. San Diego, CA).
Цели исследований: 1). Создание методологии идентификации функции генов A thaliana. 2). Проведение генетического и молекулярно-генетического анализа идентифицированных генов A. thaliana.
Задачи исследований: 1). Получение и скрининг клонотек Arabidopsis thaliana и Pisum sativum. 2). Клонирование и изучение структурной организации фрагментов хпДНК P. sativum и A. thaliana, имеющих гомологию с ДНК хромосом растительной клетки.
3). Разработка методологии изучения структурно-функциональной организации генома A. thaliana, включающая создание эффективной системы агробактериальной трансформации, получение новых систем векторов для проведения трансформации, создание представительной коллекции инсерционных мутантов.
4). Идентификация функциональной роли ранее не исследованных генов А. thaliana.
Научная новизна: 1. Впервые показано, что природа последовательностей «смешанной» ДНК, представленных одновременно в ядерном и хлоропластном геномах А. thaliana, связана с наличием нескольких семейств консервативных нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н., которые идентифицированы также в геномах млекопитающих, насекомых и цианобактерий.
-
Впервые показано различие в протекании процесса энзиматического метилирования ДНК в ядерном и хлоропластном геномах P. sativum и А. thaliana.
-
Развита методология получения и отбора инсерционных мутантов А. thaliana, а также локализации инсерции в геноме. С использованием этой методологии созданы коллекции трансгенных растений и инсерционных мутантов A thaliana.
-
Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для спасения инсерционных летальных мутантов и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью у A. thaliana.
-
Идентифицированы возможные функции ряда генов A thaliana.
-
Показана функциональная значимость ретротранспозонов.
Научно - практическая значимость работы:
Создана коллекция инсерционных Т-ДНК мутантов, являющаяся основой для изучения структурно-функциональной организации генома А. thaliana. При создании этой коллекции были использованы разные векторные системы для индукции либо исключительно «ии/»-мутаций», которые позволяют изучать функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов, либо смеси, состоящей из «ии/»-мутаций и мутаций, вызывающих суперэкспрессию «молчащих» генов, которые участвуют в контроле ответа на абиотические и биотические стрессы.
Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для спасения инсерционных летальных мутантов A. thaliana и мутантов со сниженной жизнеспособностью и фертильностью, что позволяет проводить идентификацию фенотипа и генетический анализ этих мутантов.
Показана функциональная значимость ретротранспозонов.
Клонированы, идентифицированы и функционально охарактеризованы не известные ранее гены A. thaliana, которые могут быть использованы для фундаментальных исследований в области генетического контроля процессов развития растений, а также для поиска гомологичных генов у
сельскохозяйственных видов растений и для анализа экспрессии генов устойчивости к стрессовым воздействиям в трансгенных растениях. В международной базе данных «Gen Bank» зарегистрировано 9 векторов для трансформации растений и 26 линий инсерционных мутантов A. thaliana.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на VII Всесоюзн. Симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1990); II Всесоюзн. Съезде физиологов растений (Минск, 1990); I Всесоюзн. Симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино-на-Оке, 1991); Internation. Symposium «Plant Biotechnology and Genetic Engineering» (Киев, 1994); VII Межд. Конференции «Биология клеток in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997); Межд. Симпозиуме «Молекулярные механизмы стрессовых ответов у растений» (Москва, 1998); II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (С.-Петербург, 2000); Internat. Conf. «Genetik collections, isogenic and alloplasmic lines» ( Novosibirsk, 2001); Междунар. Симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (Москва, 2001); ЕМВО conference/FEBS Advanced Course «EuroPhosphatases» (Barselona, Spain, 2003); Physiological Society Spring Workshop Hungarian Academy of Sciences «Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress» (Budapest, Hungary, 2003); NATO/OTAN Advanced Research Workshop «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging: Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights» (Antalya, Turkey, 2003); NATO Advanced Study Institute «Forces, Growth and Form in Soft Condensed Matter: At the Interface between Physicsand Biology» (Geilo, Norway, 2003); Proceedings of international scientific practicalconference «Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops» (Moscow, 2004); «Plant Genomics European Meetings» (Venice, 2006); FEBS Special Meeting «ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases» (Innsbruck, 2006); Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Установлено, что гены Synechocystis РСС 6803 - suhB, кодирующий экстрагенный супрессор SuhB из семейства инозитол монофосфатаз, и petF, продуктом которого является ферредоксин, участвуют в контроле фотосинтеза.
-
Показано, что природа «смешанной» ДНК связана с наличием в ядерном и хлоропластном геномах высших растений нескольких семейств консервативных нуклеотидных последовательностей размером 17-32 п.н.
-
Показано, что хлоропластная ДНК растений либо не метилирована совсем, либо метилирована в очень малой степени.
-
Создана методология получения и отбора инсерционных мутантов А. thaliana, которая включает в себя разработку эффективной системы агробактериальной трансформации, конструирование векторных систем для индукции «nul» мутантов и мутантов, обусловленных суперэкспрессией генов, и использование технологии ПНР-анализа для создания коллекции трансгенных линий и инсерционных мутантов A. thaliana.
-
Разработан метод компенсации гормонального дисбаланса для А. thaliana. Это позволило провести молекулярно-генетический анализ ряда условно летальных мутантов и мутантов со сниженной фертильностью.
6. Установлена функциональная значимость ретротранспозонов на
примере рецессивного летального мутанта гипокотиля у A. thaliana. Ген
At2g09920, инактивация которого инсерцией Т-ДНК приводит к
возникновению мутантного фенотипа, представляет собой ретротранспозон.
7. Идентифицированы функции гена AtIgl2860 у A. thaliana, в структуру
которого входит F-box домен, играющий ключевую роль в убиквитин-
зависимом протеолизе, и транскрипционный активатор типа «спираль-петля-
спираль». Показано, что катаболическая функция связана с контролем
развития семядолей, тогда как его анаболическая функция - с контролем
ответа на холодовой стресс.
-
Показано, что потеря функции гена Atlg78950, кодирующего фермент из семейства оксидоскваленциклаз, приводит к дефектам развития проростков у A. thaliana.
-
Установлено, что суперэкспрессия гена Atlg33390, контролирующего синтез АТФ-зависимой хеликазы из семейства DEAD-box белков, обусловливает образование фасциированного стебля у растений A. thaliana.
-
Показано, что суперэкспрессия гена At5gl0080, кодирующего белок А1 класса аспартил протеаз, приводит к замедлению развития растений А. thaliana, изменению их окраски и снижению фертильности.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 264 страницах, включает 39 таблиц и 55 рисунков. Материал представлен в виде общего введения, двух частей (первая состоит из 4-х глав, вторая - из 3-х глав), каждая из которых включает обзор литературы, результаты и обсуждение, общего заключения, выводов, списка основных опубликованных по теме диссертации работ, списка цитируемой литературы (352 наименования) и приложения, в которое вошел раздел «Материалы и методы». Работа выполнена в лаборатории изменчивости генома Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из лаборатории, с кафедры генетики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследований, схема основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.
