Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Микроорганизмы в многолетнемерзлых отложениях 8
1.2. Устойчивость микроорганизмов к ртути 11
1.2.1. Содержание устойчивых к ртути бактерий в природных популяциях 11
1.2.2. Механизмы устойчивости к ртути 13
1.2.3. Строение тег-оперонов и их распространение в природных популяциях бактерий ... 14
1.2.4. Участие плазмид в переносе детерминант устойчивости к ртути 22
1.2.5. Транспозоны устойчивости к ртути 24
2. Материалы и методы 44
2.1. Отбор и доставка образцов 44
2.2. Характеристика образцов почв и пород 45
2.3. Определение валового содержания ртути в образцах 47
2.4. Питательные среды и антибиотики 47
2.5. Методы определения численности и качественного состава микроорганизмов, устойчивых к ртути 49
2.6. Выделение и идентификация чистых культур 50
2.7. Лабораторные штаммы бактерий 52
2.8. Плазмиды 53
2.9. Опыты по конъюгативному переносу плазмид 54
2.10. Метод электрофоретического разделения днк грубых лизатов 55
2.11. опыты по транспозиции 55
2.12. генно-инженерные методы 58
2.12.1. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамотрщательных бактерий 58
2.12.2. Выделение суммарной ДНК из штаммов грамположительных бактерий 58
2.12.3. Рестрикция ДНК 59
2.12.4. Клонирование фрагментов ДНК 60
2.12.5. Трансформация Е. сої і 60
2.12.6. Электрофорез ДНК. 62
2.12.7. Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы 62
2.12.8. Радиоактивное мечение зондов для гибридизации 63
2.12.9. Блоттинг-гибридизация ДНК-ДНК 63
2.12.10. Секвенирование ДНК. 64
2.12.11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 64
3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Выделение устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений 65
3.1.1. Гарантии древности бактерий, выделяемых из мерзлоты 65
3.1.2. Создание коллекции устойчивых к ртути бактерий 69
3.2. Первичный анализ детерминант устойчивости к ртути в штаммах
мерзлотной коллекции 74
3.2.1. Определение наличия mer-оперона в мезофильных штаммах древних бактерий 74
3.2.2. Сравнительный анализ структуры тег-оперонов древних и современных штаммов термофильных бацилл 78
3.2.3. Анализ структуры тег-оперонов ацинетобактеров с помощью специфического зонда 82
3.3. Локализация детерминант устойчивости к ртути 83
3.3.1. Детерминанты устойчивости к ртути, локализованные на плазмидах 84
3.3.2. Детерминанты устойчивости к ртути, входящие в состав транспозонов 86
3.4. Исследование молекулярно-генетической структуры новых транспозонов устойчивости к ртути 94
3.4.1. «Древний» транспозон Тп5060 — безинтегронный предшественник Тп21 95
3.4.2. Ранее неизвестный транспозон Тп5042: его структура и распространение среди современных и «древних» бактерий 99
4. Заключение 107
Выводы 109
- Строение тег-оперонов и их распространение в природных популяциях бактерий
- Методы определения численности и качественного состава микроорганизмов, устойчивых к ртути
- Выделение суммарной ДНК из штаммов грамположительных бактерий
- Выделение устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений
Введение к работе
* Актуальность проблемы
В настоящее время горизонтальный перенос генов считается одним из основных механизмов эволюции, обеспечивающих быстрые изменения генома микроорганизмов, позволяющие им адаптироваться к неблагоприятным условиям внешней среды. Это было показано при исследовании в основном клинических бактерий. Горизонтальный перенос генов является причиной вспышек эпидемий, возникновения патогенных штаммов у ранее непатогенных видов бактерий, быстрого появления и стремительного распространения множественной лекарственной устойчивости у разных видов клинических бактерий. После открытия островов патогенности у бактерий у исследователей еще больше возрос интерес к изучению горизонтального переноса генов. Однако, совершенно очевидно, что все эти данные имеют ограниченное J значение в связи с тем, что были получены при изучении клинических бактерий, ] которые живут в условиях сильного искусственного давления отбора, ' вызванного применением лекарственных препаратов. ! Вопрос о масштабах и механизмах горизонтального переноса генов в природных популяциях до сих пор мало изучен, хотя, несомненно, он
, представляет большой научный интерес, с точки зрения исследования і механизмов эволюции геномов бактерий, и имеет прикладное значение в связи і с оценкой риска интродукции в природные экосистемы бактерий, созданных методами генной инженерии. >« В лаборатории молекулярных основ генетики (ЛМГМ) ИМГ РАН на \ протяжении почти 20 лет ведется изучение горизонтального переноса генов на примере детерминант устойчивости к соединениям ртути из природных экосистем (почв, водоемов, ртутных месторождений и т.п.). Полученные данные позволили сделать вывод о том, что в природе разнообразие плазмид и транспозонов, несущих систему генов, обеспечивающих устойчивость к соединениям ртути (тег-оперон), значительно больше, чем в клинике. Тем не менее, в разных частях земного шара обнаружено относительно небольшое число одних и тех же детерминант устойчивости или их гомологов, присутствующих у большинства выделяемых устойчивых к ртути бактерий. В связи с этими данными возникает вопрос: является ли такое доминирование небольшого числа детерминант устойчивости в природных микробоценозах естественным, или оно явилось следствием антропогенного загрязнения биосферы на протяжении последнего столетия. Чтобы ответить на этот вопрос, надо исследовать экосистемы, никогда не подвергавшиеся антропогенному воздействию. Таким, пожалуй единственным в мире, природным хранилищем микробных сообществ, никогда не испытывавших влияния хозяйственной деятельности человека, являются многолетнемерзлые отложения («вечная» мерзлота). К настоящему времени не только достоверно установлен факт длительного (до 5 млн лет) сохранения жизнеспособных микроорганизмов в мерзлоте, но и показано, что их содержание в многолетнемерзлых грунтах, как правило, не намного уступает таковому в современных тундровых почвах. Учитывая, что устойчивые к ртути бактерии, хотя бы в небольших количествах, встречаются даже в незагрязненных экосистемах, можно предположить, что их можно выделить и из многолетнемерзлых отложений. Однако до сих пор никто специально не выделял из «вечной» мерзлоты микроорганизмы, устойчивые к соединениям ртути, антибиотикам и т.п. с целью сравнительного изучения их детерминант устойчивости с современными.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы, являющейся частью обширного исследования, ведущегося в ЛМГМ ИМГ РАН, было создание коллекции бактерий, устойчивых к соединениям ртути, из многолетнемерзлых отложений и сравнительное изучение детерминант устойчивости к ртути у древних и современных бактерий. В задачи данного исследования входило:
Выделение устойчивых к ртути бактерий из образцов многолетнемерзлых отложений Колымской низменности и определение их систематического положения.
Мобилизация детерминант устойчивости к ртути и выделение активных транспозонов Hg-r штаммов древних бактерий.
3. Идентификация с использованием специфических зондов известных транспозонов устойчивости к ртути, распространенных среди современных почвенных бактерий, у штаммов из мерзлотной коллекции.
4. Молекулярно-генетическое исследование ранее неизвестных транспозонов устойчивости к ртути у древних бактерий.
Научная новизна и практическая ценность работы
Впервые была создана и охарактеризована коллекция устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений. Показано значительное разнообразие содержащихся у штаммов этой коллекции детерминант устойчивости к ртути. У древних бактерий были обнаружены транспозоны, высокогомологичные широко распространённым современным природным транспозонам. Впервые был обнаружен и исследован простой транспозон, названный Тп5060, близкородственный предку сложного траспозона множественной лекарственной устойчивости Тп21, широко распространенного среди клинических штаммов бактерий. Также обнаружен и охарактеризован ранее неизвестный транспозон Тп5042 и показано его широкое распространение как в мерзлоте, так и среди штаммов современных природных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о том, что широко распространенные среди современных природных штаммов бактерий детерминанты устойчивости к ртути возникли и начали перемещаться задолго до начала антропогенного загрязнения биосферы.
Строение тег-оперонов и их распространение в природных популяциях бактерий
Гены, ответственные за обеспечение устойчивости к ртути, объединены в составе /иег-оперона. В функции /ner-оперона входит связывание ионов двухвалентной ртути, активный транспорт их внутрь клетки и детоксикация путем восстановления до химически инертной и летучей металлической ртути (рис. 1). Среди генов, входящих в состав mer-оперона, различают гены, строго необходимые для его функционирования {тег R, Т, Р и А) (рис. 2) и гены дополнительные (тег С, F, В, D, G, Е и urfl). Первые обязательно присутствуют во всех оперонах; вторые встречаются в них в различных сочетаниях (Osborn et al., 1993,1995, 1996,1997; Reniero et al., 1998; Silver & Phung, 1996; Hobman & Brown, 1997; Liebert et al., 1997; Gupta et al., 1999; Huang Ch.-Ch. et al., 1999b; Kiyono et al., 1999; Миндлин и др., 2002). Большинство /wer-оперонов содержит хотя бы один из дополнительных генов. Afer-опероны, состоящие только из четырех необходимых генов, недавно были описаны у Thiobacillus Т3.2 (Velasco et al., 1999) и Shewanellaputrefaciens BW13 (Миндлин и др., 2002) (рис. 3). Ген merR является регуляторным. Он кодирует белок, который в отсутствии ионов ртути связывается с операторно-промоторной областью {ОР), препятствуя транскрипции структурных генов wer-оперона. В присутствии ионов ртути MerR связывается с той же областью ДНК и действует как активатор. Гены тегТ, merP, и merC кодируют транспортные белки, действующие на мембране, в периплазматическом пространстве и в цитоплазме соответственно. Ген тег А кодирует ртуть-редуктазу, восстанавливающую ионы Hg2+ до металлической ртути, которая затем сама улетучивается из клетки. Белок МегА является NAD(P)H-3aBHCHMoft флавинсодержащей оксид оредуктазой, высокоспецифичной к ионам ртути (Miller et al., 1991; Misra, 1992). Ген merD кодирует дополнительный регуляторный ген, а тегВ -органомеркуриат-лиазу, гидролизующую органические соединения ртути (Summers, 1986; Silver & Phung, 1996; Hobman & Brown, 1997). Бактерии, содержащие /иег-оперон без гена тегВ (опероны узкого спектра), устойчивы только к неорганическим соединениям ртути. Ген тегВ обеспечивает устойчивость бактерий и к органомеркуриатам (опероны широкого спектра) (Kiyono et al., 1995, 1997; Silver & Phung, 1996; Hobman & Brown, 1997).
В /иег-оперонах большинства грамотрицательньгх бактерий регуляторный ген merR отделен от остальных генов операторно-промоторной областью и транскрибируется в другом направлении, чем остальные гены оперона (рис. 3). Однако в недавно описанном транспозоне Тп5070 из Shewanella putrefaciens BW13 ген merR транскрибируется в том же направлении, что и остальные гены (Миндлин идр., 2002), что характерно для известных на сегодняшний день тег-оперонов грамположительных бактерий, (рис. 3). К настоящему времени тег Неправильные прямоугольники соответствуют генам, заостренные концы указывают направление транскрипции. R-регуляторный ген merR; Т, Р, С - гены транспорта ионов ртути merT, merP, и merC; А- ген, кодирующий ртуть-редуктазу тег А; D-дополнительный регуляторный ген merD; Bl В2 ВЗ-различные гены органомеркуриат-лиазы тегВ; G, F, Е, 2- гены merG, merF, merE, urf2 с неизвестными функциями (предположительно merE может участвовать в транспорте Hg +). оперонов из грамположительных бактерий описано намного меньше, чем из грамотрицательных. Тем не менее, полученные данные свидетельствуют о том, что /иег-опероны из грамположительных бактерий по своей структуре гораздо более разнообразны, чем опероны из грамотрицательных бактерий (рис. 3).
В настоящее время полностью секвенированы более 20 /иег-оперонов, изолированных из различных бактерий, и проведен сравнительный анализ их структуры. Был обнаружен высокий уровень дивергенции генов отег-оперонов и выявлено не менее 10 различных типов этих оперонов (Liebert et al., 1997, 2000). Тем не менее нуклеотидные последовательности большинства wer-оперонов грамотрицательных бактерий отличаются друг от друга не более, чем на 30% (Barkay et al., 1985).
В работах ряда лабораторий исследовали распространение /иег-оперонов среди бактерий окружающей среды. Оказалось, что wer-опероны разных типов распространены неравномерно: одни встречаются повсеместно и с высокой частотой, другие - значительно реже и, в некоторых случаях, имеют локальное распространение (Khesin & Karasyova, 1984; Kholodii et al., 2000; Liebert et al., 2000). В исследованиях трех групп (лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов, групп Ричи и Саммерс), использующих в работе различные методы и подходы, были получены результаты, свидетельствующие о том, что в природе наиболее часто встречается лишь ограниченное число типов тег-оперонов (Никифоров и др., 1999; Osborn et al., 1997; Liebert et al., 2000). В этих работах было показано, что широкому распространению идентичных или почти идентичных последовательностей сопутствует их горизонтальный перенос между штаммами, принадлежащими к различным систематическим группам.
Методы определения численности и качественного состава микроорганизмов, устойчивых к ртути
Для определения численности и качественного состава микроорганизмов в образцах современной почвы и многолетнемерзлых осадочных пород применяли метод посева на плотные питательные среды: МПА и LA. Для определения количества бактерий, устойчивых к соединениям ртути, использовали те же среды с добавлением раствора сулемы (HgCb) в концентрации 4 мг/л.
Для посева готовили водную суспензию грунта из центральной части мерзлого керна: стерильным скальпелем вырезали навеску массой около 1 г и помещали её в стерильную пробирку известной массы. После взвешивания в пробирки добавляли стерильную воду и готовили разведения 1:10, 1:100 и 1:1000. Полученные суспензии после пятиминутного взбалтывания высевали на плотные питательные среды: из исходного и 10 разведения на среду со ртутью, а из 10 2 и 10 3 на среду без неё. Рассев каждого образца делали в трехкратной повторности. Подсчет числа выросших колоний производился на четвертые-пятые сутки инкубации при комнатной температуре.
Кроме того, для выделения штаммов термофильных бацилл и штаммов рода Acinetobacter использовали метод накопительных культур. Для выделения штаммов Acinetobacter по 1г. образца засевали в колбы с жидкой средой АС и инкубировали на качалке при +30С, а для выделения термофильных бацилл использовали среду М9 с аминопептидом и температуру +65С.
Для выделения в чистую культуру устойчивых к ртути бактерий использовали метод рассева до отдельных колоний на МПА и LA, содержащих 5-10 мкг/мл HgCb. Посевы мезофилов инкубировали при комнатной температуре и при +30С, а термофилов при +65 С. При выделении в чистую культуру устойчивыми к ртути считали только те штаммы грамотридательных бактерий, которые росли при рассеве до отдельных колоний на МПА или LA с концентрацией ртути 10мг/л и те штаммы грамположительных бактерий, которые росли на этих же средах при концентрации сулемы 5мг/л. Морфологию чистых культур и цикл развития изучали микроскопированием чистых культур разного возраста (сутки, 3 суток, неделя, 2 недели). Для определения родовой принадлежности штаммов применяли следующие биохимические тесты:
1. Предварительную диагностику грамположительных и грамотрицательных бактерий проводили по КОН-тесту, основанному на том, что грамотрицательные бактерии лизируются 0,2N КОН, освобождая высокой вязкости ДНК, а большинство грамположительных бактерий устойчивы к КОН (Manafi and Kneifel, 1990). Тест Хью-Лайфсона (Hugh, Leifson, 1953) для идентификации бактерий на основе ферментативного или окислительного метаболизма углеводов. Тест основан на том, что степень кислотности при окислительном метаболизме значительно ниже, чем при бродильном («Методы почвенной микробиологии», 1980) 3. Оксидазный тест для разделения родов грамотрицательных бактерий ( ). 4. Каталазный тест ( ). 5. Тест на среде Гетченсона для выявления целлюлозоразрушающих бактерий (Бабьева, Зенова, 1983). 6. Для выявления штаммов псевдомонад, образующих флуоресцирующий пигмент, использовали среду Кинг Б (King et al., 1954). 7. Определение нуклеотидной последовательности генов 16S РНК. Этот метод использовали в особо сложных случаях, например при определении штамма 5138, отнесенного к роду Exiguobacterium. Идентификацию штаммов Acinetobacter проводили в соответствии с описанием морфологических и физиологических признаков этого рода в «Кратком определителе бактерий Берджи» (1997). Окончательное заключение о принадлежности выделенных штаммов к роду Acinetobacter делали на основе опытов по генетической трансформации (Миндлин и др., 1990). В качестве реципиента при трансформации использовали штамм Acinetobacter BD413ilv; отбор трансформантов вели по маркеру ilv+.
Выделение суммарной ДНК из штаммов грамположительных бактерий
По 20мл среды М9 с аминопептидом и глюкозой, содержащей 1мг/л HgCb, засевали необходимыми культурами и инкубировали в течение 15 ч. (термофильные бациллы при 65С, а остальные при 30С). После центрифугирования, осадок клеток промывали физиологическим раствором на 0,01М буфере Трис/HCl (рН8,0), суспендировали в 1,4 мл буфера для лизиса (50мМглюкоза; ЮмМ Трис/HCl, рН8,0; 50мМ ЭДТА 0,25; 1,5 мг/мл лизоцима) и инкубировали 30 мин во льду. После этого к суспензии добавляли 3 мл щелочного раствора (0,1М ЭДТА; 5% SDS), быстро перемешивали и приливали 5 мл свежеприготовленного фенола, содержащего 0,1% оксихинолина и насыщенного 0,1М ЭДТА, 2% SDS и 0,5М NaClC 4 (5М раствор добавляли до конечной концентрации 0,5М), встряхивали 30 мин на качалке (200 об./мин), добавляли 1/10 объёма хлороформа и центрифугировали (5-10 мин при 6 тыс. об./мин ). Отбирали водную (верхнюю) фазу. Обработку фенолом повторяли до полной очистки от белка. Обычно проводили 3-4 раунда депротеинизации. После этого осаждали ДНК равным объёмом этанола и получившийся осадок растворяли в буфере ТЕ при 50С и проводили обработку РНК-азой и протеиназой К по стандартной методике, описанной в руководстве Sambrook et al., 1989.
Гидролиз ДНК рестриктазами проводили согласно методикам, приведенным в справочном пособии Sambrook et al., 1989. Рестрикцию плазмидной ДНК проводили в соответствующем для каждой рестриктазы буфере в объёме 8-40 мкл, содержащем 0,1-3 мкг ДНК, в течение 1-4 часов при 37С. Рестрикцию суммарных ДНК проводили в объёме 30-40 мкл при концентрации ДНК 100-200 мкг/мл. Использовали 2-5 единиц фермента на 1 мкг ДНК. Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение 2-10 часов и останавливали нагреванием до 65 С в течение 15 мин. или переосаждением ДНК из рестрикционной смеси этанолом. Перед электрофорезом в пробы добавляли 1/5 объёма раствора бромфенолового синего, содержащего 70% глицерина с 0,05М ЭДТА.
Использованные векторные плазмиды описаны выше в разделе «Плазмиды использованные в работе» (см. таблицу 2). Для лигирования использовали рестрицированные ДНК 0,01-0,05 мкг вектора и 2-3 мкг исходной плазмиды, 1-2 мкг выдел енного фрагмента или 5-10 мкг препаратов суммарной ДНК. Лигирование проводили в 10-20 мкл среднесолевого буфера для рестриктаз с добавлением 5 мМ ДТТ, 1мМ АТФ и 0,5-2 ед. ДНК-лигазы фага Т4, инкубировали 16 часов при 10С (Sambrook et al., 1989).
Использовали два способа трансформации E.coli: (1)электропорацию (электротрансформацию) и (2)введение ДНК в компетентные клетки, полученные при обработке раствором СаСЬ.
1) Метод электротрансформации (Dower et al., 1988; Sambrook et al., 1989; Цымбалюк, 1992) использовали при клонировании фрагментов из суммарной ДНК бактерий. Клетки для этого готовили следующим образом: 400 мкл из ночной культуры JM83 вносили в 100 мл LB и подращивали 2-3 часа с сильной аэрацией до ОЕ)боо 0)2_0)35. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4 тыс. об./мин в течение 8 минут. Осадок аккуратно суспендировали в 50мл стерильного 10% раствора глицерина в воде, снова осаждали центрифугированием и ещё два раза промывали тем же раствором: 1/3 и 1/20 от исходного объёма. После промывки осадок суспендировали в 1/150-1/500 объёма стерильного 10% глицерина. Клетки расфасовывали по 40 мкл и хранили в кельвинаторе. К 5-10 мкл переосаждённой и растворённой в деионизированной воде пробе ДНК добавляли 40 мкл полученных клеток. Все операции проводили при 0-5 С. При проведении электротрансформации пользовались прибором Сут-3 (Цымбалюк, 1992), используя следующие параметры: напряжённость поля — 12кВ/см, время импульса 5 мсек. После электрошока клетки суспендировали в тёплом LB, подращивали 1,5-2 часа на качалке при 37С и высевали на селективные среды. При отборе на среде со ртутью за 45 мин до рассева на плотную питательную среду в LB добавляли следовые количества HgCh (0,01-0,1 мг /мл) для индукции экспрессии генов mer-оперона.
2) Компетентные клетки, полученные обработкой раствором ЮОмМ СаСЬ, использовали для субклонирования фрагментов ДНК, а также введения неконъюгативных плазмид в нужные штаммы. Все манипуляции проводили, как описано в руководстве Sambrook et al., 1989. Для трансформации к 0,1 мл компетентных клеток добавляли 0,01-0,05 мкг ДНК, инкубировали 30 мин в ледяной бане и прогревали 1 мин при 42С. К трансформированным клеткам добавляли 1 мл среды LB, подращивали 1 час при 37С и рассевали на чашках с селективной средой. При клонировании в векторах pUC19, pTZ19, pGEM5 в штамме JM83 для отбора рекомбинантных плазмид после трансформации клетки высевали на чашки со средой MacConkey с лактозой и ампициллином.
Выделение устойчивых к ртути бактерий из многолетнемерзлых отложений
Перед началом опытов по вьщелению устойчивых к ртути бактерий из мерзлоты и даже, когда уже были выделены первые штаммы, нас постоянно волновал вопрос: действительно ли выделяемые из образцов многолетнемёрзлых отложений микроорганизмы являются реликтовой микрофлорой, а не были занесены туда позднее с водой по микротрещинам из современной почвы или в процессе отбора образцов? Без строгого доказательства того, что выделяемые из мерзлоты бактерии действительно являются древними, сравнение их детерминант устойчивости к ртути с современными теряло бы всякий смысл. На сегодняшний день результаты многочисленных микробиологических исследований многолетнемёрзлых грунтов дают нам основания полагать, что штаммы, выделяемые из мерзлоты, являются действительно современниками мамонтов, пережившими тысячи и миллионы лет в состоянии анабиоза или близком к нему. В пользу этого факта говорят следующие микробиологические и геологические данные:
1) Миграция почвенной микрофлоры в более глубокие подпочвенные слои не может происходить из-за наличия мерзлоты, которая полностью препятствует просачиванию воды с поверхности, т.к. даже если в подпочвенном слое и образуются микротрещины, попавшая в них вода тут же замерзает, ведь температура мерзлоты и зимой, и летом составляет -10-12 С. Сезонное оттаивание происходит лишь до глубины 0,5-0,6 м, т.е. в пределах самого почвенного профиля (Vorobyova et al., 1997). 2) Обнаружение в пробах многолетнемёрзлых пород анаэробных микроорганизмов (Rivkina et al., 1998), которые не могли попасть туда из воздуха в процессе отбора образцов. 3) Выделение из мерзлоты редких видов микроорганизмов, не характерных для современных тундровых почв (Vorobyova et al., 1997). 4) Обнаружение образцов, в которых отсутствуют жизнеспособные микроорганизмы (Vorobyova et al., 1997 и наши данные, см. ниже). 5) Отсутствие существенных различий по численности и качественному составу микроорганизмов, выделяемых из одних и тех же образцов, проанализированных в экспедиции, сразу же после извлечения их из скважины, и затем после хранения и доставки их в лабораторию в Москве (Звягинцев и др., 1985). 6) Хлебниковой с соавторами был поставлен опыт для изучения возможности проникновения микроорганизмов с бурового инструмента внутрь керна. С этой целью пробоотборник буровой установки обливали чистой культурой Serratia marcescens. Посев производили как из центральной части керна, так и с поверхности. Наличие характерных колоний S. marcescens было отмечено в чашках, засеянных материалом только с наружной стороны керна, во внутреннюю часть керна микроорганизмы не проникали. (Хлебникова и др., 1990). Как упоминалось выше, для микробиологических исследований отбирали только внутреннюю часть образцов. Нами также был поставлен опыт по искусственному заражению образцов. В качестве тест-культуры применялась смешанная суспензия следующих штаммов: ED94-62rif (устойчивый к рифампицину мутант выделенного из мерзлоты Hg-r штамма Pseudomonas fluorescens ED94-62), Е. coli (RPl::Tn5053) (Hg-r, Ар-г, Tc-r), Е. coli (pUC19::Tn5053) (Hg-г, Ар-г). Данная тест-культура была использована при отборе двух образцов летом 1990 г. При отборе первого образца суспензией бьш облит керн перед стандартной процедурой вырезания из него образца, тогда как второй образец был облит суспензией перед закладкой на хранение в стерильный бюкс (центральная часть образца при этом оставалась в замерзшем состоянии).
После транспортировки этих образцов в Москву, из них с использованием стандартной методики произвели посев на плотные питательные среды : NA и NA+Hg (5мкг/мл). Приготовленные стандартным методом суспензии из центральной части обоих образцов высевались из 10"1 и 10"2 разведении на среду со ртутью и из 10 и 10" разведения на среду без ртути. Из первого образца на среде со ртутью, несмотря на достаточно высокий общий титр бактерий - 3,0x105, не выросло ни одной колонии. Из второго же образца и на среде со ртутью, и на среде без ртути выросли только единичные колонии. Ни одна из них не росла ни на одном из антибиотиков, к которым были устойчивы исходные штаммы тест-культуры.
7) В пользу того, что выделяемые бактерии действительно являются представителями древних микробиоценозов свидетельствуют и факты полученные при сравнении данных по изучению состава древних микробных сообществ с помощью двух разных подходов: а) выращивание колоний жизнеспособных бактерий путем посева на плотные питательные среды и б)
