Содержание к диссертации
Введение
I. Введение 6
II. Обзор литературы 9
2.1. Актин 9
2.2. Тредмиллинг 12
2.3. Динамика актина в клетке 15
2.4. ADF/кофилины 18
2.5. ПрофилиниТр4 20
2.6. Кэпирующие белки и гельзолин 22
2.7. Комплекс Агр2/3 24
2.8. Белки семейства WASP 27
2.9. Listeria monocytogenes и белок ActA 31
2.10. Белки семейства Ena/VASP 35
III. Материалы и методы исследования 41
3.1. Белки 41
3.2. Исследование взаимодействия комплекса Агр2/3 и VASP in vitro 41
3.3 Полимеризационные тесты 42
3.4. Видеомикроскопия 42
3.5. Listeria monocytogenes 43
3.6. ActA-полистиреновые бусины 43
3.7. Статистическая обработка данных 45
IV. Результаты и обсуждение 46
4.1. Для создания новых филаментов комплексом Агр2/3 необходимы плюс-концы существующих актиновых филаментов 46
4.2. Актиновые филаменты, растущие из одного узла разветвления, имеют равные длины 47
4.3. Новые актиновые филаменты растут с плюс-концов филаментов-затравок 48
4.4. Комплекс Агр2/3 не взаимодействует с VASP 51
4.5. VASP не оказывает эффекта на кинетики полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, активированного растворимым ActA 51
4.6. VASP увеличивает плотность ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3, но не меняет кинетики их деветвления 53
4.7. ActA-микросферы 53
4.8. VASP необходим для движения ActA-микросфер 54
4.9. VASP усиливает нуклеаторный эффект комплекса Агр2/3, активированного ActA на поверхности полистиреновых микросфер и Listeria monocytogenes 57
4.10. VASP связывает актиновые филаменты с ActA на поверхности полистиреновых микросфер независимо от комплекса Агр2/3 58
4.11. VASP не связывается с плюс-концами актиновых филаментов и не препятствует кэпированию плюс-концов филаментов кэпирующими белками 59
4.12. VASP не участвует в регуляции процесса кэпирования плюс-концов филаментов кэпирующими белками при движении ActA-микросфер 60
4.13. VASP уменьшает плотность ветвления актиновых филаментов ActA-активированным комплексом Агр2/3, увеличивая расстояние между соседними точками ветвления 62
V. Заключение 65
VI. Основные выводы 69
Благодарности 70
Список литературы
- Динамика актина в клетке
- Видеомикроскопия
- Актиновые филаменты, растущие из одного узла разветвления, имеют равные длины
- VASP усиливает нуклеаторный эффект комплекса Агр2/3, активированного ActA на поверхности полистиреновых микросфер и Listeria monocytogenes
Введение к работе
Актиновый цитоскелет — основа клеточной морфологии и подвижности. Актин обнаружен практически во всех типах эукариотических клеток и может составлять более 20 % от всего клеточного белка. Из актиновых филаментов построен жёсткий, но в то же время подвижный и динамически изменяющийся каркас клетки - клеточный кортекс, -который придаёт механическую прочность поверхностному слою клетки и играет ведущую роль в таких важнейших для жизни клетки процессах, как локомоция, изменение формы и различные типы внутриклеточной реорганизации. Полимеризация актина также является движущей силой для внутриклеточного перемещения некоторых патогенных организмов, таких как Listeria и Shigella.
В настоящий момент одним из важнейших вопросов клеточной биологии является вопрос о том, каким образом клетка интегрирует сигналы, приходящие с различных рецепторов, и осуществляет направленную и строго регулируемую полимеризацию актина в ответ на внешнее раздражение. Открытый в 1994 году белковый комплекс Агр2/3 (Machesky et al., 1994) считается на сегодняшний день основным эффектором, инициирующим локальную полимеризацию актина в ответ на активацию сигнальными белками. Состоящий из 7 субъединиц, две из которых (Агр2 и АгрЗ) имеют структурную гомологию с актином, комплекс Агр2/3 локализован в примембранном пространстве переднего края движущейся клетки (ламеллоподии) и в актиновых бляшках, где под действием белков-активаторов он создаёт актиновые филаменты de novo. При этом комплекс Агр2/3 организует филаменты в дихотомически ветвящиеся структуры, придавая дополнительную жёсткость актиновой сетке в области выпячивания плазматической мембраны.
В клетках эукариотов активаторами комплекса Агр2/3 являются белки из семейства Scar-WASP. WASP выполняет функцию белка-адаптора, передающего сигналы с тирозинкиназных рецепторов и ГТФаз, таких как Cdc42, на Агр2/3 комплекс (Miki et al., 1998, *Miki et al., 1998). Таким образом, WASP работает как устройство, интегрирующее различные сигналы и инициирующее направленную полимеризацию актина за счет локальной активации комплекса Агр2/3.
Бактериальный мембранный белок ActA (Kocks et al., 1992) из Listeria monocytogenes имеет функциональную гомологию с WASP. Этот белок - единственный бактериальный белок, необходимый для движения Listeria внутри инфицированной клетки. ActA активирует Агр2/3 комплекс клетки-хозяина, позволяя, таким образом, использовать полимеризацию актина на поверхности бактерии для кометоподобного движения Listeria в
цитоплазме инфицированной клетки. Благодаря тому, что Listeria обходит сигнальные пути клетки, а также из-за того, что ActA активирует комплекс Агр2/3 подобно WASP, Listeria используется многими исследователями как удобная модельная система для изучения процессов клеточной подвижности.
Не так давно в литературе появились данные о вовлеченности белков семейства Ena/VASP (Gertler et al., 1990) в регуляцию процессов клеточной подвижности. При этом показано, что во время движения Listeria VASP взаимодействует с ActA и остаётся на поверхности бактерии. Скорость движения Listeria в отсутствие VASP очень мала и возрастает в 10 раз, если в среде присутствует VASP (Loisel et al., 1999). Однако до настоящего времени остаётся непонятным ни механизм активации Агр2/3 комплекса белком ActA, ни роль VASP в этом процессе.
Цель и задачи работы.
Исходя из вышесказанного, целью данной работы было исследование механизма образования актиновых филаментов ActA-активированным комплексом Агр2/3 и роли VASP в этом процессе.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: >
Изучить процесс ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3, активированным ActA.
Изучить роль VASP в регуляции полимеризации актина ActA-активированным комплексом Агр2/3 в растворе.
Создать модельную систему для изучения процессов, происходящих на поверхности Listeria, и использовать её для определения функции VASP в регуляции движения бактерии.
Научная новизна.
В настоящей работе было доказано взаимодействие активированного комплекса Агр2/3 с плюс концом существующих актиновых филаментов для создания новых филаментов. Это разрешило давнюю полемику между сторонниками гипотезы о ветвлении актиновых филаментов комплексом Агр2/3 с плюс конца существующего филамента (Pantaloni et al., 2000) и гипотезы о ветвлении новых филаментов из произвольной точки на стороне
актинового филамента (Amann, Pollard, 2001) в пользу первых. Впервые показано, что VASP способен изменять морфологию ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3 в актиновых хвостах Listeria monocytogenes, увеличивая расстояния между соседними точками ветвления филаментов, подобно тому, как это происходит в ламеллоподии эукариотической клетки (Bear et al., 2002). При этом VASP не регулирует процесс блокирования плюс-концов актиновых филаментов кэпирующими белками, как считалось ранее (Bear et al., 2002).
Практическое значение работы.
Результаты проведённых исследований расширяют представления о молекулярных механизмах актин-обусловленной подвижности как бактериальных клеток, так и клеток эукариотов. Разработана удобная модельная система для изучения подвижности Listeria monocytogenes, не обладающая патогенностью для исследователя. Разработан метод, позволяющий измерять активность белков, адсорбированных на твёрдой поверхности, с помощью стандартного флуориметра. Полученные в работе результаты могут быть использованы в клинической бактериологии при разработке способов защиты и лечения от Listeria monocytogenes, а также при чтении лекций и в лабораторной практике на кафедрах биохимии и биофизики биологических факультетов и медицинских институтов.
Динамика актина в клетке
ADF/кофилины относятся к семейству небольших (15-18 кДа) актин-связывающих белков. Они встречаются у всех эукариотов, при этом многие организмы имеют более одного варианта этих белков, за исключением дрожжей и амёб, у которых обнаружен только один кофилин. ADF/кофилины из разных организмов показывают высокую степень гомологии, особенно в N- и С-концевых участках белка (Carlier et al., 1999). По третичной структуре ADF позвоночных сходен с сегментом 1 гельзолина, сегментом 2 северина и профилином (Hatanaka et al., 1996), тем не менее, между ADF и гельзолинами не обнаружено ни структурной, ни функциональной гомологии.
Методом мутагенеза было показано, что ADF/кофилины играют важную роль в клеточной подвижности и морфогенезе. Так, температурно-чувствительные мутанты по кофилину пекарских дрожжей дефектны по эндоцитозу (Lappalainen, Drubin, 1997). А следствиями мутаций у Drosophila twinstar, ведущих к понижению уровня экспрессии ADF, являются нарушения в митозе и цитокинезе (Gunsalus et al., 1995). В то же время суперэкспрессия кофилина в Dictyostelium discoideum вызывает раффлинг и увеличивает подвижность амёбы (Aizawa et al., 1996). ADF также увеличивает скорость движения Listeria monocytogenes (см. гл. 2.9) в экстрактах тромбоцитов, делая при этом актиновые хвосты бактерии короче (Carlier et al., 1997).
Известно, что функциональная активность ADF регулируется обратимым фосфорилированием серина на N-конце белка (Ohta et al., 1989; Agnew et al., 1995; Nebl et. al., 1996), при этом активной формой ADF является дефосфорилированная форма. Показано, что дефосфорилирование белка осуществляется в ответ на действие различных факторов, вызывающих реорганизацию цитоскелета, таких как факторы роста (нейрональный ростовой фактор, инсулин), хемотактические пептиды или агентов, увеличивающих уровень внутриклеточного Са2+ и цАМФ (Moon, Drubin, 1995). При этом активирующая фосфатаза на сегодняшний день не известна, в то время как Rac-регулируемая LIM-киназа идентифицирована как инактиватор ADF (Bamburg, 1999). Таким образом, фосфорилированная и дефосфорилированная формы ADF сосуществуют в клетке, но соотношение между ними постоянно варьирует в зависимости от внешних сигналов (Meberg et al., 1998; Carlier et al., 1999).
Интересно, что хотя ADF/кофилины диффузно распределены в цитоплазме покоящихся клеток, активированный (дефосфорилированный) белок локализуется в местах активной динамики актина, таких как ламеллоподии и зоны раффлинга (Bamburg, Bray, 1987; Obinata et al., 1997; Nagaoka et al., 1996). При этом ADF отсутствует в узкой
зоне переднего края ламеллоподии, непосредственно граничащей с клеточной мембраной, где имеет место нуклеация новых филаментов (Svitkina, Borisy, 1999).
ADF/кофилины способны взаимодействовать как с G-, так и с F-актином, но только в том случае, если в качестве связанного нуклеотида выступает АДФ, так как сродство ADF к АТФ- или АДФ-Рі-формам актина на два порядка ниже, чем к АДФ-актину (Carlier et al., 1997; Ressad et al., 1998). При этом фосфорилирование не изменяет активность ADF per se, но уменьшает афинность как к G-, так и к F-актину в 20 раз (Ressad et al., 1998).
Структурная реконструкция, выполненная на основе электронных микрографий ADF-декорированных актиновых филаментов, показала, что ADF взаимодействует с двумя актиновыми субъединицами на поверхности левосторонней спирали, связывая субдомен 1 одной актиновой субъединицы с субдоменом 2 субъединицы, следующей за ней. При этом связывание ADF вызывает изменения в структуре филамента, ведущие к возрастанию закрутки спирали на 5 градусов на субъединицу без изменения длины осевого повтора актиновых мономеров (2,7 нм) или радиальной позиции субдоменов актина. Как результат, две правосторонние спирали пересекают одна другую каждые 27 нм вместо 36 нм для актина в отсутствие ADF (McGough et al., 1997).
Если взаимодействие ADF с G-актином носит характер простой обратимой бимолекулярной реакции, то кинетики связывания F-актина демонстрируют высокую степень кооперативности (Ressad et al., 1998; Blanchoin, Pollard, 1999) с последующей медленной диссоциацией. Отсюда при концентрациях актина больших, чем концентрация ADF, последний не будет статистически взаимодействовать с F-актином, равномерно распределившись по поверхности всех филаментов, но полностью стехиометрически насытит лишь небольшую их часть, формируя две структурно различные популяции филаментов.
Таким образом, механизм действия ADF сводится к взаимодействию с минус-концом актиновых филаментов и изменению степени закрутки актиновой спирали, что ведёт к дестабилизации филамента и его разборке. Как следствие, скорость диссоциации мономеров актина с минус-конца ADF-филамента в 30 раз выше, чем в нативном актине (Carlier et al., 1997), а так как лимитирующая стадия тредмиллинга - диссоциация актиновых мономеров с минус-конца (Carlier, Pantaloni, 1997), то ускорение этого процесса будет вести к увеличению скорости тредмиллинга в целом. Прямые измерения показывают, что в присутствии ADF критическая концентрация актина возрастает с 0,1 до 0,3 мкМ (Didry et al., 1998). А так как скорость полимеризации на плюс-конце актинового филамента равна +kB (Css - Ссв) и Ссв немногим меньше 0,1 мкМ (см. гл. 2.2), то в отсутствие ADF скорость роста филамента на плюс-конце невелика и возрастает в 30 раз, если в среде присутствует ADF, приближая скорость тредмиллинга к значениям, наблюдаемым in vivo в ламеллоподии (рис. 2а).
Дестабилизация филаментов (увеличение Css) сопровождается уменьшением стационарной средней длины актинового филамента. Для чистого актина достижение стационарного распределения по длине - довольно медленный процесс, однако в присутствии ADF он идёт намного быстрее. В физиологических условиях, когда ADF:aKTHH =1:10, изменения в длине филаментов незначительны (Carlier et al., 1999).
Другим важным свойством ADF является замедление диссоциации АДФ с актиновой глобулы. Измерения показывают, что диссоциация АДФ с деполимеризованного ADF-G-актина в 10-20 раз медленнее, чем с G-актина в отсутствие ADF (Carlier et al., 1997, Blanchoin, Pollard, 1999). Отсюда основной формой мономерного актина при его полимеризации в присутствии ADF является не АТФ-О-актин, а АБР-АДФ-С-актин.
Профилины — это сходные по свойствам, но различные по первичной структуре актин-связывающие белки небольшого молекулярного веса (12,5-16 кДа), широко распространенные в эукариотических клетках (Pollard, Cooper, 1986).
Генетические эксперименты показывают, что профилин играет значительную роль в процессах роста и развития у дрожжей (Haarer et al., 1990), в СНО-клетках (Finkel et al., 1994), у дрозофилы (Cooley et al., 1992) и Dictyostelium (Haugwitz et al., 1994). Тем не менее, полученные экспериментальные результаты о роли профилина в регуляции динамики актиновых филаментов in vivo подчас противоречивы. Так, например, суперэкспрессия профилина в СНО-клетках увеличивает относительное количество F-актина при неизменном общем содержании актина в клетке (Finkel et al., 1994), в то время как инъекция профилина в фибробласты ведёт к разборке филаментов (Cao et al, 1992).
В клетке профилин локализуется в местах активной динамики актина (Buss et al., 1992; Hartwig et al., 1989). Клеточная концентрация профилина (Tseng et al., 1984), как и концентрация неполимеризованного актина (Gordon et al., 1976; Gordon et al., 1976; Pollard, Cooper, 1986), составляет порядка 100 мкМ, однако только 70-80% профилина в клетке связано с актином (Perelroizen et al., 1994).
Видеомикроскопия
20 мкл Ni-агарозы с 1 наномолем иммобилизованного his-VASP или 20 мкл глутатион-сефарозы с 1 наномолем иммобилизованного GST-WA уравновешивались в буфере S (20 мМ Tris-СГ, рН 7,8; 0,1 М КС1, 1 мМ MgCl2, 0,2 мМ АТФ и 1% БСА). Затем микросферы смешивались с различными концентрациями комплекса Агр2/3 в буфере В (20 мМ Tris-Cl", рН 7,8; 0,1 М КС1, 1 мМ MgCl2, 0,2 мМ АТФ, 1 % Tween 20 и 0,2 % БСА) в конечном объеме 200 мкл и инкубировались при 4 С в течение 1 часа при постоянном помешивании. После инкубации бусины были осаждены центрифугированием, супернатанты отобраны, а бусины промыты дважды в буфере В. Присутствие комплекса Агр2/3 в супернатантах и в отмывках определялось методом Western Blot с использованием поликлональных анти-АгрЗ-антител из кролика.
Полимеризация актина контролировалась по увеличению интенсивности флуоресценции пирен-актина (5-10 % от общей концентрации актина, составлявшей от 2 до 5 мкМ в разных экспериментах). При этом интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству полимеризованного актина (F-форма) (Kouyama, Mihashi, 1981). Исследования проводились в буфере G (5 мМ Tris-Cl", рН 7,5; 1 мМ DTT, 0,2 мМ АТФ, ОД мМ СаСЬ, 0,01 % NaN3) при комнатной температуре на спектрофлуориметре «Safas fix» (Safas, Монако). Возбуждение флуоресценции осуществлялось при длине волны 366 нм, эмиссия регистрировалась на 407 нм. Полимеризация актина инициировалась добавлением 0,1 М КС1 и 1 мМ MgCb. Чтобы избежать осаждения полистиреновых бусин в процессе измерения кинетики полимеризации актина, полимеризационная среда содержала 16 % сахарозы.
В работе использовались два микроскопа: люминесцентный микроскоп Reichert-Jung с объективом Polyvar 100х/1,32 с масляной иммерсией и Olympus АХ 70 с оригинальными объективами 100х/1,35 и 40х с масляной иммерсией. Полученные изображения записывались на аналоговые камеры Lhesa LH4046, Sony SPT-M108CE, Panasonic ВР330 или аналоговую камеру с интенсификатором Lhesa LHL4036, и обрабатывались с помощью программ NIH Image или Metamorph Tools.
Для визуализации актиновых филаментов использовался циклический олигопептид фаллоидин из Ammonita phalloides. Фаллоидин обладает высоким сродством к актину и значительно понижает критическую концентрацию полимеризации актина, стабилизируя филаменты (Cooper, 1987). В экспериментах применялся либо родамин- или А1еха488-актин, либо родамин- или А1еха488-фаллоидин. Филаменты разводились в буфере G, содержащем 0,5% метилцеллюлозы, 0,1 М КО, 1 мМ MgCh, 20 мкг/мл каталазы, 3 мг/мл глюкозы и 100 мкг/мл глюкозооксидазы до конечной концентрации актина 8нМ. Для наблюдения флуоресценции филаментов использовался стандартный набор фильтров с максимумом возбуждения флуоресценции 550 нм и эмиссии 580 нм для родамина и 488 нм и 520 нм для А1еха488 соответственно. В каждом эксперименте анализировалось по крайней мере 200 случайно выбранных филаментов.
Бактериальный штамм Lut 12 (pactA3) культивировался и хранился, как описано ранее (Marchand et al., 1995). Для подсчёта количества клеток в суспензии использовалась камера Горяева. Для определения плотности ActA на поверхности Listeria monocytogenes суспензия бактериальных клеток с плотностью 5,1 10 клеток/мл дважды отмывалась в PBS и подвергалась разрушению ультразвуком в течение 10 минут с помощью ультрасонификатора (Kimble/Kontes, Германия). После этого разрушенные клеточные мембраны, содержащие ActA, отделялись от внутриклеточного содержимого центрифугированием. Полное отсутствие ActA в супернатанте было подтверждено методом Western Blot с использованием поликлональных анти-АсіА-антител из кролика. Затем осадок растворялся в денатурирующем буфере для гель-электрофореза (125 мМ Tris-СГ, рН 6,8; 2 % SDS, 10 % глицерина, 50 мМ DTT, 0,01 % бромфенолового синего) и вновь подвергался 5-ти минутной обработке ультразвуком с последующим кипячением на водяной бане в течение 5 минут для экстракции ActA из липидной фазы. Далее, нерастворимый осадок отделяли центрифугированием, и количество ActA в супернатанте определяли методом Western Blot. Полнота экстракции ActA была подтверждена отсутствием детектируемых следов белка в отобранном осадке после его растворения в 6 М растворе мочевины.
АстА-полистиреновые бусины были получены; путём преинкубации карбоксилированных полистиреновых микросфер требуемого диаметра с различными концентрациями ActA в буфере X (10 мМ HEPES, рН 7,5; 0,1 М КС1, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ СаСЬ и 1 мМ АТФ), содержащем БСА в конечной концентрации 0,1 %, в течение одного часа на льду. Затем бусины дважды отмывались в буфере X и хранились при 4 С. Поверхностная плотность ActA, адсорбированного на бусинах, определялась методом Western Blot с применением поликлональных анти-АсіА-антител из кролика. Стабильность белка на поверхности микросфер контролировалась по способности активировать комплекс Агр2/3 в полимеризационных тестах после серии отмывок бусин в буфере X.
Искусственные среды для тестирования подвижности бусин (Loisel et al, 1999) состояли из 7мкМ F-актина, 100 нМ комплекса Агр2/3, 3,5 мкМ ADF, 2,4 мкМ профилина, 80 нМ гельзолина и 0.5 % БСА в буфере X, содержащем 1,5 мМ Mg-АТФ, 5 мМ DTT и 0,2 % метилцеллюлозы. Во всех экспериментах концентрация добавленного VASP составляла 150-250 нМ. Для наблюдения за ActA-бусинами использовался метод фазового контраста. Скорости движения бусин измерялись с помощью программы NIH Image с использованием разработанного нами оригинального алгоритма (см. приложение 2), а также стандартными средствами программы MetaMorph Tools. В каждом эксперименте измерялись скорости по крайней мере 10 случайно выбранных бусин.
Актиновые филаменты, растущие из одного узла разветвления, имеют равные длины
Визуализация филаментов, полученных полимеризацией актина в присутствии комплекса Агр2/3, ActA и VASP показывает, что за одинаковое время полимеризации в среде с VASP плотность ветвления филаментов была несколько больше, чем в его отсутствие, при этом чаще наблюдались разветвления филаментов второго и более высоких порядков (рис. 15а).
В качестве контроля в эксперименте использовался N-фрагмент ActA дикого типа, который не обладает участком для связывания VASP - в этом случае эффект VASP на ветвление филаментов никак не проявлялся, что свидетельствует о необходимости взаимодействия VASP с ActA в процессе активации комплекса Агр2/3. В то же время скорости диссоциации актиновых филаментов из точки разветвления, которая начинается сразу же за процессом ветвления филаментов активированным комплексом Агр2/3 (Blanchoin et al., 2000), были одинаковы как с VASP, так и без него (рис. 156). Таким образом, хотя VASP несколько увеличивает плотность ветвления актиновых филаментов, он не стабилизирует уже разветвлённые актиновые филаменты.
Так как эффект VASP на нуклеаторную функцию комплекса Агр2/3, активированного ActA в растворе, может отличаться от такового в случае иммобилизации ActA на твёрдой поверхности, имитирующей поверхность Listeria monocytogenes, был разработан метод, позволяющий адсорбировать ActA на поверхности полистиреновых микросфер. Был создан протокол для определения количества адсорбированного ActA методом Western Blot, и построена изотерма адсорбции белка (рис. 16а), что дало возможность приготовления бусин с требуемой поверхностной плотностью ActA.
Сравнение поверхностной плотности ActA на бусинах с плотностью ActA на поверхности Listeria, измеренной с помощью сходного протокола, показало, что используемый метод иммобилизации позволяет получать бусины с поверхностной плотностью белка, аналогичной таковой у бактерии. Так, на поверхности бактерии, которая может быть представлена как эллипсоид с линейными размерами 1 мкм х 0,5 мкм, бьшо детектировано 22000 молекул ActA, что соответствует средней поверхностной плотности белка 0,016 молекул/нм2. При этом на поверхности бусины, представляющей собой сферу с диаметром 2 мкм, при полном насыщеннии ActA (изотерма адсорбции белка на поверхности бусин выходит на плато), было детектировано 260000 молекул ActA, что соответствует средней поверхностной плотности белка 0,02 молекул/нм2 и среднему расстоянию между соседними молекулами ActA на поверхности бусины в 5-7 нм (рис. 166). полистиреновых микросфер (Polysciences) диаметром 2 мкм (нижняя панель).
Определение активности ActA на поверхности Listeria, ActA, иммобилизованного на поверхности бусин, и ActA в растворе в полимеризационных тестах показало, что способность ActA к активации комплекса Агр2/3 на поверхности бактерии сопоставима с активностью выделенного белка в растворе и лишь незначительно уменьшается при адсорбции белка на полистиреновых микросферах (для сравнения см. рис. 19, кривые с открытыми символами). Таким образом, полистиреновые бусины с адсорбированным на них ActA могут считаться достаточно удачной модельной системой для изучения процессов, происходящих на поверхности Listeria monocytogenes.
Описанные полистиреновые микросферы с различной поверхностной плотностью адсорбированного ActA были протестированы в искусственных средах, состоящих из очищенных белков, необходимых для воссоздания подвижности Listeria in vitro (см. гл. 2.9 и Loisel et al., 1999). Исследование проводилось как в средах, содержащих VASP, так и без него. Было показано, что поверхностная плотность ActA имеет некое пороговое значение, ниже которого бусины не движутся ни в средах с VASP, ни в его отсутствие (таблица 1).
В случае относительно высоких плотностей ActA на поверхности микросфер в средах, не содержащих VASP, имеет место формирование симметричного актинового облака вокруг бусины с последующим нарушением симметрии и образованием полноценного актинового хвоста, однако, вскоре после начала движения бусины останавливаются, зачастую теряя при этом связь с актиновым хвостом (рис. 17а-б, таблица 1). При этом в присутствии VASP те же самые бусины способны к нормальному листериоподобному движению на протяжении часов (рис. 17в, таблица 1). Интересно, что скорость движения ActA-бусин в искусственных средах как с VASP, так и без него в исследованном диапазоне плотностей ActA от 1,42 10"20 молей/мкм2 до 3,54 10"20 молей/мкм2 не зависит от плотности ActA на поверхности бусин и составляет в среднем 1,5 мкм/мин без VASP и порядка 5 мкм/мин с VASP соответственно. В отличие от скорости, время движения бусин в средах, не содержащих VASP, сильно зависит от плотности ActA на их поверхности и может меняться от 10 минут до полутора часов, при этом чем выше плотность ActA на поверхности бусин, тем дольше и стабильнее они движутся (таблица 1).
Интересно, что если ActA-микросферы, прекратившие движение, отмыть в буфере X и поместить обратно в ту же самую среду, в которой произошла остановка, или в свежую искусственную среду без VASP, они снова начинают двигаться и затем останавливаются аналогично тому, как это имело место в первый раз. При этом если те же самые бусины поместить в среду, содержащую VASP, или просто добавить VASP в искусственную среду с остановившимися бусинами, то бусины движутся так же, как если бы VASP присутствовал в среде с самого начала (рис.18).
Таким образом, VASP необходим для стабильного движения ActA-бусин в искусственных средах. В то же время, поведение бусин несколько отличается от такового Listeria monocytogenes: в отсутствие VASP скорость движения Listeria уменьшается приблизительно в 10 раз, при этом остановки и потери бактерией актинового хвоста не происходит (Loisel et al., 1999).
Нами был разработан метод, позволяющий исследовать как ActA-полистиреновые бусины, так и Listeria monocytogenes в полимеризационных тестах, основанный на использовании в полимеризационнои смеси раствора сахарозы, препятствующего осаждению бусин и бактериальных клеток. При этом, в отличие от ситуации, когда ActA присутствовал в растворе (см. гл. 4.5 и рис. 14), как микросферы с иммобилизованным на них ActA (рис. 19а), так и клетки Listeria monocytogenes (рис. 196) показали большую способность активировать Агр2/3-обусловленную полимеризацию актина в присутствии VASP по сравнению с контролем без VASP. На врезке рис. 19а представлены типичные фотографии ActA-бусин в процессе полимеризации актина в среде без VASP (слева) и с VASP (справа). Подобное различие в способности активировать полимеризацию актина на поверхности бусин наблюдается на протяжении всего времени полимеризации с момента начала полимеризации до выхода кривой полимеризации на стационарный уровень.
VASP усиливает нуклеаторный эффект комплекса Агр2/3, активированного ActA на поверхности полистиреновых микросфер и Listeria monocytogenes
Для выяснения механизма функциональной активности VASP при движении Listeria monocytogenes были проверены все потенциальные возможности участия этого белка в регуляции динамики актиновых филаментов на поверхности бактерии. Так, методом соосаждения комплекса Агр2/3 VASPOM, иммобилизованным на Ni-агарозных микросферах, нами было показано отсутствие непосредсвенного взаимодействия между VASP и комплексом Агр2/3. Далее в полимеризационных тестах нами было продемонстрировано отсутствие эффекта VASP при концентрациях, не превышающих 0,2 мкМ, на процесс полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, активированного ActA в растворе. При этом визуализация филаментов, полученных полимеризацией актина в присутствии ActA-актиированного комплекса Агр2/3, показывает, что за одинаковое время полимеризации присутствие VASP несколько увеличивает плотность ветвления актиновых филаментов, создавая при этом разветвления второго и более высоких порядков, в отличие от ситуации, когда VASP отсутствует в растворе. Однако скорости спонтанной разборки актиновых ветвлений были одинаковы как в присутствии, так и в отсутствие VASP.
Далее, была создана модельная система для исследования механизмов актин-обусловленной подвижности Listeria monocytogenes, представляющая собой полистиреновые бусины с иммобилизованным на, них ActA. Преимуществами такой модельной системы перед Listeria является возможность создания микросфер с требуемой поверхностной плотностью ActA, а также то, что в отличие от бактерии, ActA-микросферы не обладают патогенностью для исследователя. Разработанный протокол адсорбции ActA позволяет получать микросферы с поверхностной плотностью и удельной активностью белка близкими к таковым на поверхности Listeria monocytogenes, что свидетельствует об адекватности используемой модели для изучения процессов, происходящих на поверхности бактерии. Исследование подвижности ActA-микросфер в искусственных средах, состоящих из актина, комплекса Arp2/3, ADF, профилина и гельзолина, показало, что присутствие VASP является необходимым условием для нормального листериоподобного движения ActA-микросфер: в отсутсвие VASP микросферы либо не движутся вообще, либо прекращают своё движение после определённого промежутка времени, зависящего от плотности ActA на поверхности микросфер, в то время как в присутствии VASP ActA-микросферы способны стабильно двигаться на протяжении часов. При этом процесс остановки ActA-микросфер является обратимым: добавка VASP восстанавливает нормальное движение микросфер.
Нами был разработан метод измерения функциональной активности ActA, как иммобилизованного на твёрдой поверхности, так и на поверхности Listeria monocytogenes. При этом, в отличие от ситуации с растворимым ActA, как в случае ActA-бусин, так и клеток Listeria VASP увеличивал эффективность полимеризации актина в присутствии комплекса Агр2/3, при этом связывая актиновые филаменты с ActA на поверхности бусин. Для вьиснения роли комплекса Агр2/3 в связывании актиновых филаментов с ActA посредством VASP было исследовано взаимодействие актиновых филаментов с ActA-бусинами в присутствии и в отсутствие комплекса Агр2/3 и показано, что VASP способен связывать актиновые филаменты и ActA независимо от комплекса Агр2/3, скорее всего за счёт связывания F-актина с С-концевым EVH2-flOMeHOM VASP (Reinhard et al., 1992; Bachmann et al., 1999; Laurent et al., 1999), который, в свою очередь, взаимодействует с богатым пролином участком ActA своим EVH1-доменом (Niebuhr et al., 1997; Machner et al., 2001). Так как возможная роль VASP в подвижности Listeria monocytogenes может заключаться в связывании VASP с плюс-концами актиновых филаментов и, таким образом, в контроле их взаимодействия с кэпирующими белками (Bear et al., 2002), то для выснения такой возможности нами был проведён эксперимент по конкурентному связыванию CapG и VASP с плюс-концами актиновых филаментов в полимеризационных тестах, который показал, что in vitro VASP не конкурирует с CapG за связывание с плюс-концами актиновых филаментов. Полученные данные были подтверждены в экспериментах по иммобилизации филаментов со свободными плюс-концами и плюс-концами, блокированными гельзолином, на ActA-бусинах в присутствии VASP, в ходе которых оба типа филаментов связывались с ActA на поверхности микросфер посредством VASP абсолютно одинаково, что свидетельствует о том, что VASP связывается не с плюс-концом (Bear et al., 2002), а со стороной актинового филамента (Laurent et al., 1999; Huttelmaier et al., 1999; Bachmann et al., 1999; Walders-Harbeck et al., 2002). И, наконец, нами было показано, что VASP не участвует в регуляции процесса кэпирования плюс-концов филаментов при движении ActA-микросфер в искусственных средах.
Количественная интенситометрия актиновых хвостов ActA-бусин, движущихся в искусственных средах, показала, что, во-первых, полимеризация актина на поверхности ActA-бусин идёт с большей эффективностью в присутствии VASP, что хорошо согласуется с данными, полученными в полимеризационных тестах, а во-вторых, VASP вызывает изменение морфологии ветвления актиновых филаментов комплексом Агр2/3 в актиновых хвостах ActA-микросфер, увеличивая расстояние между соседними точками ветвления филаментов, подобно тому, как это происходит в ламеллоподии эукариотической клетки (Bear et al., 2002) и выравнивая плотность ветвления филаментов по всей длине актинового хвоста. Увеличение эффективной длины актиновых филаментов ведёт, в свою очередь, к повышению их гибкости и, как следствие, увеличению эффективности выталкивания ActA-микросфер, в; результате чего движение ActA-микросфер характеризуется более высокой скоростью и стабильностью.
Таким образом, нами было показано, что механизм работы комплекса Агр2/3, активированного ActA, сводится к взаимодействию с плюс-концами уже существующих актиновых филаментов и созданию новых филаментов путём ветвления исходных. При этом функция VASP при движении Listeria monocytogenes заключается в увеличении расстояния между соседними точками ветвления филаментов и, таким образом, изменении морфологии ветвления актиновой сети в хвостах Listeria.
