Введение к работе
Актуальность проблемы. Трансляция - центральный процесс в жизнедеятельности всех организмов, в ходе которого информация, закодированная в нуклеотидах мРНК, переводится в аминокислотную последовательность белка при помощи рибосомы. Согласно центральной догме молекулярной биологии мРНК отводится роль посредника между ДНК, несущей всю наследственную информацию, и рибосомой, превращающей эту информацию в белки. Роль мРНК не сводится лишь к передаче информации с ДНК на рибосому, мРНК принимает непосредственное участие в регуляции и определении уровня экспрессии гена. Отличительные черты бактериальной мРНК, такие как последовательность Шайна-Дальгарно (SD), различные стартовые кодоны, A/U-богатые участки, элементы вторичной структуры мРНК, набор используемых кодонов, организация генов в опероны заметно влияют на трансляцию. Сочетание регуляции на уровне транскрипции, в общем определяющей будет или не будет экспрессироваться данный ген, и регуляции на уровне трансляции, точно и тонко модулирующей уровень синтеза белка, позволяет для данного гена достичь оптимальной экспрессии.
Факторы, влияющие на трансляцию, начали изучаться очень давно, но по отдельности и в совершенно разных системах, что не позволяет сравнивать результаты между собой и оценивать относительный вклад различных элементов мРНК.
Изучение бактериальной трансляции особенно важно еще и потому, что около половины применяемых в настоящее время антибиотиков действуют на рибосому. Механизмы действия могут быть различными: некоторые антибиотики вызывают ошибки в ходе синтеза, другие замедляют скорость трансляции или нарушают структуру рибосомы. Определение механизма действия необходимо для создания лекарственного препарата, а также важно для понимания фундаментальных основ взаимодействия антибиотиков с рибосомой. Стандартный способ проверки антибактериальной активности заключается в измерении уровня ингибирования клеточного роста, но данный подход имеет несколько недостатков: во-первых, необходимы большие концентрации антибиотика, чтобы увидеть заметное снижение роста, а, во-вторых, при таком способе скрининга нельзя ничего сказать о механизме действия антибиотика. Методы для определения механизма существуют, но большинство из них требует in vitro экспериментов и выделения потенциальных мишеней антибиотиков из клетки, что делает их плохо применимыми для широкомасштабного поиска. Поэтому создание высокопроизводительно метода скрининга механизма действия антибиотиков, позволяющего проводить поиск in vivo, представляется крайне актуальным.
Цели работы:
-
Разработать систему для многофакторного анализа влияния элементов мРНК на эффективность трансляции Escherichia coli (E. coli), изучить с ее помощью роль основных элементов бактериальной мРНК в трансляции.
-
Разработать метод высокопроизводительного анализа механизма действия антибиотиков и использовать его для нахождения новых потенциальных антибиотиков с заданным механизмом действия.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы была разработана двойная репортёрная конструкция, основанная на генах двух флуоресцентных белков, позволяющая проводить многофакторный анализ влияния различных элементов мРНК на эффективность трансляции. При помощи данной конструкции впервые показано, что in vivo наибольшую относительную эффективность трансляции обеспечивает SD наибольшего размера (8 нуклеотидов), расположенная на максимально близком к стартовому кодону расстоянии, а для среднего расстояния от старта трансляции продемонстрировано существование оптимального значения длины SD, равное 6 нуклеотидам. Изучено влияние элементов вторичной структуры мРНК в области начала трансляции и обнаружено, что в некоторых положениях элементы вторичной структуры различной прочности оказывают противоположное влияние на эффективность трансляции. В отличие от трансляции моноцистронных мРНК, подробно исследованной во многих работах, регуляция трансляции полицистронных матриц мало изучена. Наша репортёрная конструкция позволила подробно изучить трансляцию бицистронной мРНК: оценить влияние SD, вторичных структур между генами и экспрессии первого гена в опероне на эффективность реинициации трансляции и инициации de novo. При перекрывании или близком расположении стартового и стоп-кодонов SD не настолько необходима для эффективной трансляции, как в случаях большего расстояния между генами одной матрицы или моноцистронных матриц. В ходе работы впервые детально изучено влияние A/U-богатых участков на трансляцию второго гена в опероне, а также обнаружена зависимость эффективности влияния A/U-богатых участков на трансляцию от нуклеотидного контекста участка, следующего за стартовым кодоном. Полученные результаты позволяют лучше понять и количественно оценить эффекты, оказываемые различными элементами мРНК на трансляцию.
Кроме фундаментальных исследований, разработанная система может быть применена и при поиске новых антибиотиков. Нами разработан метод, позволяющий детектировать in vivo присутствие веществ, вызывающих торможение трансляции, и проведен успешный поиск нового антибиотика, тормозящего трансляцию.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: «Chemistry in Molecular Biology», 16-20 декабря, г. Москва, Россия, 2011; «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины», 29-30 сентября, г. Москва, Россия, 2011; 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", 25-30 июня, г. Турин, Италия, 2011;
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 55 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 88 цитированных работ.
