Содержание к диссертации
Введение
1. Структурно-генетические исследования рнк-полимеразы 8
1. Структурно-генетический подход.Краткие сведения 8
2. Структурно-генетические исследования гроБС оперона Escherichia coli 10
A. Локализация и исследование организации гроВС оперона 10
B. Исследование взаимодействия РНК-полимеразнЕ.соїі с антибиотиками и вирусными белками, инактивирующими фермент 15
1. Взаимодействие с рифампицином 15
2. Взаимодействие со стрептолидигином 20
3. Взаимодействие с липиармицином и тиолутином 22
4. Взаимодействие с белком гена 2 бактериофага Т7 24
C. Структурно-генетические исследования взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с компонентами реакции транскрипции на разных этапах процесса in vitro 25
1. Основные этапы процесса транскрипции. Краткие сведения 25
2. Исследование взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами 27
3. Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции 29
4. Структурно-генетические исследования процесса терминации транскрипции 31
5. Структурно-генетические исследования механизмов регуляции транскрипции 31
A. Взаимодействие РНК-полимеразы с белкамирегуляторами 31
B. Координация процессов транскрипции и трансляции 35
C. Координация процессов транскрипции и репликации 39
2. Структура некоторых мутантних генов rpob, escherichia coli, кодйрущих я -субъвдинщу рнк-полимеразы 41
A. Получение и селекция мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам рифампицину и стрептолидигину в составе гена rpoB 43
B. Препаративное выделение фрагментов гена rpoB мутантного типа 46
C. Установление первичной структуры фрагментов гена rpoB мутантного типа 48
1) Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена rpoB, несущих мутации гроВ1001 , гроВ1016 и гроБ1017 49
2) Установление первичной структуры EcoRI-G фрагмента, несущего мутацию гроВ1019 53
3) Определение первичной структуры .EooRI-C фрагмента гена rpoB, несущего stl-r мутацию гроВЮ18 57
Д. Локализация мутаций. Анализ характера локализованных замен 60
1) Локализация и анализ расположения и характера мутаций рифампицин-устойчивости 60
2) Локализация мутации устойчивости РНК-по-лимеразы к антибиотику стрептолидигину 70
Е. Локализация функционально важных участков в составе в -субъединицы РНК-полимеразы Е. coli 71
3. Экспериментальная часть 79
1. Материалы 79
A. Реактивы 79
B. Ферменты 79
C. Генетические материалы 80
Д. Растворы 80
1. Буферные растворы 80
2. Среды и сопутствующие растворы 81
3. Растворы для выделения плазмид 82
4. Растворы с красителями 82
5. Растворы для проведения химической модификации 83
6. Растворы для метода терминирующих аналогов трифосфатов 83
7. Смеси для приготовления ПААГ 84
8. Фотографические растворы и материалы 85
9. Оборудование 86
10. Методы 86
1) Приготовление гелей. Электрофорез 86
A. Заливка ПААГ. Условия электрофореза в ПААГ 86
B. Приготовление агарозных гелей. Условия электрофореза 87
2) Выращивание клеток рекомбинантных штаммов 88
3) Выделение плазмидной ДТЖ 88
4) Выделение фрагментов ДНК из рекомбинантных плазмид 90
5) Обработка ДНК по методу Максама-Гилберта 91
A. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 91
B. Введение концевой радиоактивной метки 92
C. Выделение меченых фрагментов ДНК 93
Д. Получение полинуклеотидов, меченных по одному концу 94
Е. Специфическая химическая деградация ДНК 95
Р. Электрофорез в структурных ПААГ 96
6) Определение первичной структуры ДНК методом терминирующих аналогов трифосфатов 97
A. Приготовление вектора 97
B. Приготовление гидролизата ДНК 97
C. Лигирование 98
Д. Трансфекция компетентных клеток 99
Е. Идентификация рекомбинантных клонов 100
Р. Наращивание фага и выделение фаговой ДНК 100
G. Идентификация клонированных фрагментов ДНК 101
Н. Проведение реакций 101
Выводы 103
- Структурно-генетические исследования гроБС оперона Escherichia coli
- Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции
- Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена rpoB, несущих мутации гроВ1001 , гроВ1016 и гроБ1017
- Локализация мутации устойчивости РНК-по-лимеразы к антибиотику стрептолидигину
Введение к работе
Глубокое понимание молекулярных основ жизнедеятельности клетки невозможно без всестороннего структурно-функционального исследования процесса транскрипции, осуществляемого ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Настоящая работа является частью структурно-функциональных исследований ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. ooli, проводимых на протяжении ряда лет в лабораториях химии белка и биотехнологии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина совместно с лабораторией молекулярных основ генетики Института молекулярной генетики АН СССР. Эти исследования привели к определению полной первичной структуры кор-фер-мента /1,2,3/, идентификации субъединиц, контактирующих с РНК-продуктом в активном транскрипционном комплексе /4/, и локализации ряда мутаций рифампицин-устоичивости в гене гров, кодирующем б -субъединицу фермента /5,6/.
Локализация мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам (а в общем случае и другим ингибиторам активности фермента) является одним из редких подходов, позволяющим изучать механизмы, приводящие к нарушению работы активного центра.Целью данной работы являлось установление первичной структуры гена гроВ, кодирующего в-субъединицу пяти мутантных полимераз, устойчивых к действию антибиотиков рифампицина или стрептолидиги-на. Метод локализации мутаций включал определение первичной структуры EcoRl-c или EcoRi-G фрагментов гена гроВ мутантного типа (по методике Максама-Гилберта) и выявление аминокислотных замен путем сравнения со структурами фрагментов гена дикого типа.
Работа осуществлялась совместно с лабораторией молекулярных основ генетики ИМГ АН СССР, где были получены штаммы бактерий, несущих указанные мутации. Полученные результаты позволяют еде- лать предположения, касающиеся третичной структуры а -субъединицы РВК-полимеразы и взаимного расположения в ней функционально важных участков фермента.
Автор выражает сердечную благодарность ст.н.сотр. Г.С. Монастырской и к.х.н. СО. Гурьеву за помощь, оказанную в процессе работы.
Структурно-генетические исследования гроБС оперона Escherichia coli
Особую роль в структурно-генетических исследованиях прока-риотических РНК-полимераз получили мутации устойчивости к антибиотикам, главным образом рифампицину, а также, в меньшей степени, к стрептолидигину и стрептоварицину. Указанные антибиотики Подробно /13,15/. одробное изложение данного вопроса можно найти в обзорах непосредственно связываются с РНК-полимеразами всех эубактерий. Легкость получения бактериальных штаммов, резистентных к этим антибиотикам, позволила довольно быстро идентифицировать единственный участок на хромосоме E.coli, в котором локализовались все упомянутые мутации РНК-полимеразы /13/. Опыты по реконструкции /8/ полного фермента из субъединиц РНК-полимераз дикого и мутантного типов привели к идентификации субъединицы, связывающейся с антибиотиками - А -субъединицы. Было показано /14/, что участок хромосомы, содержащий ген А -субъединицы РНК-полимера-зы E.coli (гроБ), устойчивой к действию рифампицина, располагается между генами argE,c,B,H и геном thiA на 88,5 минуте генетической карты E.coli (см.рис. I). Тонкое картирование мутаций устойчивости к рифампицину в хромосоме клеток E.coli /16/ с помощью трансдуцирующего фага PI позволило сделать заключение о сильной сцепленности мутаций и оценить величину района их локализации приблизительно в 300 п.о. /16/. Исследования, проведенные с другими микроорганизмами, главным образом Bacillus subtilis, привели к аналогичным заключениям в случае мутации устойчивости к рифампицину, однако в отличие ат Е.соїі-мутации устойчивости к антибиотику стрептолидигину у этой бактерии затрагивали в -субъединицу /17,18/. Получение трансдуцирующих фагов, несущих rif-район и рядом-лежащие области, было следующим крупным шагом в исследовании генетики гроБС оперона. Киршбауму и Конраду удалось в 1973 году получить ряд лямбдоидных фагов, в частности 7\ v±f 18, содержащих вставку бактериальной ДНК, несущей мутацию устойчивости РНК-полимеразы к антибиотику рифампицину /19/. Исследование экспрессии генов из rif района в бесклеточной системе привело к заключению о близкой локализации гена гров, кодирующего А -субъединицу и несущего rif-r мутации, и гена гроС, кодирующего д -субъ- единицу РНК-полимеразы Е.соїі.
В дальнейшем с помощью этого метода удалось /20/ получить генетическую карту бактериальных генов фага 7\ rif 18, приведенную на рис. 2. Тесная сцепленноеть генов гроБ и гроС, а также открытие полярного эффекта некоторых ашЪег-мутаций в меродиплоидных штаммах привело к заключению,что гены гроВ и гроС объединены в единый гроБС оперон /13/. Действительно, полярные amber-мутации, нарушающие выражение сразу обоих генов - гроБ и гроС - были локализованы только в пределах гроВ гена. Это позволило сделать вывод, что гены А И А -субъединиц транскрибируются в единую мРНК, а остановка рибосомы при трансляции под влиянием агаЪег-кодона в первом гене приводит к невозможности трансляции второго гена. В составе гроБС оперона были также идентифицированы гены rpiL и гри, кодирующие два рибо-сомных белка - L7/L12 и ъю /21/. Поиск промотора, с которого начинается транскрипция оперона, проведенный Номурой с соавторами /21/, привел к заключению, что гены рибосомных белков и гены в и в -субъединиц РНК-полимеразы транскрибируются совместно преимущественно с промотора РЬ10, расположенного перед геном гри (см. рис. 2). В то же время, однако, было показано, что последовательность в 40 нуклеотидов, разделяющая L11 оперон и стартовую точку промотора Ъ10 (см. рис. 2), не содержит известных сигналов терминации. Возможно поэтому, что транскрипция с промотора PL1Q начинается лишь при аттенюации транскрипции с предыдущего промотора РЪ11, так же как транскрипция с промотора РВ , по-видимому, осуществляется лишь в случае терминации транскрипции на аттенюаторе t1 под действием неидентифицированных белков-регуляторов /22/. В таком случае следует считать, что гроБО оперон и Ы1 оперон (включающий гены rplA и rplK, кодирующие рибосомные белки L1 и L11) представляют собой единый rplKAJLrpoBC оперон /120/, а различия в эффективности транскрипции отдельных генови трансляции участков мРНК связаны с действием регуляторних факторов клетки. Это заключение подтверждается тем, что как и в Е. coli, гены двух больших субъединиц РНК-полимеразы у представителей всех других родов энтеробактерий, а также у бактерий рода Bacillus, были картированы рядом с генами рибосомных белков и других компонентов системы трансляции /23/. По-видимому, такое объединение является общим для генотипа всех бактерий и отражает регуляторные связи, координирующие процессы транскрипции и трансляции /13,21/ (см. ниже). Крупным достижением последних лет стало установление полной первичной структуры гроВС оперона, осуществленное группой авторов ИЕХ им. М.М. Шемякина /2,3,24/. В. Исследование взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с антибиотиками и вирусными белками, инактивирую-щими фермент I. Взаимодействие с рифампицином Мутации устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам обнаружены только в составе в -субъединицы фермента; в настоящее время наиболее изучены мутации устойчивости РНК-полимеразы к рифамицину В (см. рис. 3) и его аналогам (rif-r мутации), а также к близкородственным антибиотикам стрептоварицину и толипомици-ну, которые образуют с рифамишнами. группу анса-мицинов.
Подробно исследован и механизм действия рифамицина В и его более распространенного синтетического аналога рифампицина на РНК-полиме-разу E.coli in vitro и in vivo. Эти исследования показали, что антибиотик в основном подавляет начальный этап процесса транскрипции, приводя к выбросу в среду коротких олигонуклеотидов (абортивный синтез), и не влияет на взаимодействие фермента с матрицей, а также на синтез первой фосфодиэфирной связи. Полученные данные привели МакКлура и Сеча /25/ к заключению, что рифампицин ингибирует образование прочного тройного комплекса РНК-полимераза-ДНК-РНК, нарушая транслокацию РНК после синтеза первой фосфодиэфирной (ФДЭ) связи. Авторы также высказали предположение, что антибиотик блокирует про-дукт-связывающий центр фермента. Однако не исключена возможность, что молекула антибиотика нарушает конформационную перестройку, приводящую к превращению центра связывания инициирующего НТФ в центр связывания 3 -конца синтезируемого продукта /26,27/. Анализ структуры рифампицина (см. рис. 3) показывает, что антибиотик, по-видимому, образует прочный комплекс с РНК-полиме-разой при помощи водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Действительно, в диметилсульфоксиде константа взаимодействия рифампицина с ферментом уменьшается на два порядка, тогда как при повышении ионной силы стабильность комплекса РНК-полимераза-риф-ампицин, наоборот, увеличивается, что говорит о том, что электростатические взаимодействия не являются определяющими в формировании комплекса /28/. Систематическое исследование аналогов рифаминина В приводит к заключению, что во взаимодействии антибиотика с ферментом главную роль играет анса-цепь рифаміицина , глубоко погруженная в фермент /29/, поскольку в большинстве случаев модификация или изменение длины анса-цепи приводят к потере активности антибиотика. При этом строго необходимым является сохранение интактных гидро-ксильных групп при C2j и С2з» возможно имитирующих гидроксильные группы РНК-продукта /30/, двойных связей анса-цепи, по-видимому, придающих ей конформационную жесткость, а также кислородных атомов при Сj и Сд в ароматическом ядре молекулы /29/ (см. рис. 3). В то же время активные группы фермента, участвующие в свя- зывании антибиотика, оставались вплоть до последнего времени неизвестными. Исследования локализации центра связывания рифампицина в составе РНК-полимеразы E.coli, осуществленные несколькими группами /16,31/ с использованием трансдуцирующего фага PI, показали, что этот центр располагается в узком районе центральной части е -субъединицы. Точная локализация аминокислотных остатков, измененных в результате мутации рифампицин-устойчивости и, возможно, принимающих участие во взаимодействии фермента с антибиотиком, стала возможной лишь после определения и сравнения первичной структуры А -субъединицы мутантного и дикого типов, осуществленного Овчинниковым с соавт. /2,5,6/.
Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции
Вплоть до настоящего времени не удалось выявить ни одной мутации РНК-полимеразы, нарушающей ход инициации, за исключением ts-мутации гроС32 в клетках Salmonella typhirourium, приводящей к уменьшению скорости инициации при повышении температуры /64/, по-видимому, вследствие косвенных эффектов. Очевидно, что мутации такого рода в большинстве случаев детальны для клетки и, следовательно, структурно-генетический анализ в этом случае является мало эффективным. Однако локализация мутации устойчивости РНК-полимеразы E.coli к подавляющему инициацию антибиотику липиар-мицину в составе гроВС оперона /43,46/, а также идентификация субъединиц фермента, контактирующих с 5 -концом нетранслоциро-ванного динуклеотида, позволяют предположить, что в связывании инициирующего субстрата непосредственно участвуют как минимум АИ б -субъединицы РНК-полимеразы /130/. Не намного более успешными были структурно-генетические исследования фермента на этапе элонгации, поскольку в этом случае удалось получить лишь несколько условно-летальных мутаций в составе гена гроО, влияющих на скорость синтеза РНК, что говорит о возможном участии А -субъединицы в реакции элонгации /60,64/. В соответствии с этим заключением находятся данные, полученные методом аффинной модификации фермента ДНК-матрицей, указывающие на то, что при переходе реакции со стадии инициации к стадии элонгации появляются контакты матрицы с А -субъединицей /59,63/. На этой же стадии зафиксировано появление контактов а -субъединицы с 5 -концом растущей цепи РНК продукта /4/. Таким образом, не исключено, что А -субъединица фермента E.coli непосредствен- В то же время, несмотря на многочисленные данные, указывающие на участие А -субъединицы в процессе элонгации цепи РНК /4,7/, до сих пор не найдено ни одной мутации в составе гена гроВ, изменяющей нормальное протекание этого процесса, что вероятно связано с летальным эффектом большинства таких мутаций.
Однако в пользу участия А -субъединицы в элонгации говорит факт локализации мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам стрептолидигину (по-видимому, конкурирующему за место связывания с элонгирующим НТФ) и рифампипину (конкурирующему с РЖ-продуктом) исключительно в составе гена гроВ; кроме того, данные аффинной модификации фермента 5 -концом растущей цепи РНК /4/ и аффинными аналогами субстратов /7/ четко указывают на непосредственное участие А -субъединицы в формировании продукт-связывающего и субстрат-связывающего центров фермента. Интересно, что при изучении РНК-полимеразы B.subtilis Хал-лингу с соавт. неожиданно удалось показать, что?в отличие от Е. coli,мутации стрептолидигин-устойчивости располагаются в составе гроС гена, кодирующего А -субъединицу фермента /18/. Эта же субъединица связывала ионы цинка, по-видимому, необходимые для катализа /42,65/, что возможно указывает на непосредственное участие А -субъединицы в синтезе ФДЭ связи. В то же время все мутации устойчивости РНК-полимеразы к рифампицину локализовались в составе в -субъединицы. Авторы выдвигают предположение, что усложнение цикла развития у спорулирующих бактерий потребовало более тонкой регуляции процесса транскрипции, что привело к эволюционной дивергенции аппарата транскрипции у различных видов бактерий. Вплоть до настоящего времени не удавалось получить условно-летальных мутаций в составе гроВС оперона, непосредственно влияющих на ход терминации. С одной стороны, это связано с трудностями селекции, а с другой, - с нарушениями более ранних этапов транскрипции у таких мутантов, маскирующими указанный эффект.Однако недавно было обнаружено ингибирующее влияние рифампицина на ход как р -зависимой, так и р -независимой терминации транскрипции /66,101,102/, приводящее к сквозной транскрипции терми-наторных участков при наличии этого антибиотика в среде; затем удалось выявить и несколько rif-r мутаций в гене гроВ, влияющих на ход этих процессов (см. следующий раздел) /67/. 5. Структурно-генетические исследования механизмов регуляции транскрипции А. Взаимодействие РНК-полимеразы с белками-регуляторами Как известно, функционально связанные гены прокариот объединены в опероны, т.е. транскрибируются в единую мРНК, синтез которой в типичном случае регулируется белком-репрессором и белком--активатором, связывающимися с промоторно-операторной зоной ДНК--матрицы /37,122/. Кроме того, существует целый ряд белков, связывающихся непосредственно с РНК-полимеразой и вызывающих изменение спектра узнаваемых промоторов или изменение хода тесно связанных процессов терминации, аттенюации и задержки (pausing) транскрипции при наличии специфических консервативных последовательностей в составе ДНК-матрицы. К группе белков, изменяющих спектр узнаваемых промоторов,в основном относятся аналоги основного б -фактора, поскольку в бактериальной клетке, по-видимому, синтезируется несколько видов б -субъединицы. Так, в клетках E.coli найдено два минорных б -фактора, один из которых направляет транскрипцию генов белков теплового шока /71,134/ (роль второго до конца не ясна).В клетках B.subtilis найдено четыре б -фактора, регулирующих транскрипцию на различных стадиях споруляции /70/, однако структурно-генетические исследования этих факторов только начинаются.
К более изученной группе белков, влияющих на ход процесса терминации, в основном относятся р -фактор и nusA белок(см.рис. р -Фактор, обладающий РЖ-зависимой АТФ-азной активностью, участвует в терминации транскрипции некоторых генов E.coli при наличии в их составе специфической последовательности - р -зависимого терминатора. Как предполагается в работе /80/, гексамер р -фактора связывается с этой последовательностью в составе растущей цепи РНК во время некоторого замедления синтеза и транслоцирует РНК от 5 - к 3 -концу, дестабилизируя тройной комплекс ДНК-РЖ-фермент. При этом синтезируемая РЖ не должна обладать стабильной вторичной структурой (по-видимому, необходимой в случае р -независимой терминации), ингибирующей активность о -фактора. В настоящее время удалось выделить несколько мутаций в составе гроБС оперона, супрессирующих мутации в составе р -фактора (Rho фенотип) /81,82/. Оказалось, что и некоторые rif-r мутации обладают супрессирующим действием, что указывает на возможное участие А -субъединицы РЖ-полимеразы в процессе р -зависимой терминации транскрипции /13/. Некоторые клетки E.coli обладают Rho фенотипом при полностью активном р -факторе, благодаря мутациям в составе другого фактора герминации - nusA белка /83/. В настоящее время ген этого белка проклонирован в клетках E.coli, что позволило подробно изучить его действие на процесс транскрипции /84/. Оказа- лось, что аналогично р -фактору, одна, а по некоторым данным, две молекулы nusA белка (молекулярная масса 69 кД) связываются с РНК-полимеразой в случае наличия в составе ДНК-матрицы определенной последовательности - бокса А /87/. Возможно, что одна молекула nusA белка блокирует центр связывания элонгирующего НТФ, являясь конкурентным ингибитором связывания субстратов, а другая неконкурентно связывается с неидентифицированным центром,вызывая терминацию транскрипции /84/, Так же как и фактор р , nusA и.родственный ему nusB,белки, инициирующие терминацию (а также соответствующие последовательности, узнаваемые этими факторами), были первоначально выявлены при исследовании продуктивного раз-, вития фага 7\ , как факторы клетки-хозяина, необходимые для инициации литическои реакции, осуществляемой N и Q белками фага. Однако последовательности, узнаваемые этими факторами, были затем выявлены и в составе бактериальной хромосомы /87/. Интересно, что ( бокс А ) консервативные последовательности в составе ДНК фагаХ" по достижении которых РНК-полимераза должна связываться с nusA белком клетки-хозяина и терминировать синтез, находятся в составе последовательности, необходимой для проявления активности N белка фага.
Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена rpoB, несущих мутации гроВ1001 , гроВ1016 и гроБ1017
Генетическими методами было показано, что мутации рифампи-цин-устойчивости весьма тесно сцеплены /16/ и приводят к заменам в центре гена в -субъединицы на отрезке длиной в 50 аминокислотных остатков /5,6/. Однако вновь полученные мутации гроВЮіб и гроВЮ17 были индуцированы нитрозогуанидином - ранее не применявшимся мутагеном широкого спектра действия - и обладали пониженной степенью устойчивости к рифампицину в составе соответствующих мутантних клонов. Поэтому нельзя было полностью исключить возможности, что вновь полученные замены не попадали в круг более ранних исследований и располагались вне указанного района. В связи с этим для EcoRl-C фрагмента, несущего мутацию гроВЮ17, которую было решено локализовать в первую очередь, определяли последовательность не только центральной части гроБ гена (надежности определения структуры этого участка уделяли особое внимание), но и прилегающих к ней районов (см. рис. 7). При определении структуры EcoRi-C фрагмент гидролизовали рестрикта-зами, указанными на рис. 7. Введение радиоактивной метки осуществляли в основном фосфорилированием липких концов субфрагментов, образующихся в результате гидролиза рестриктазой, при помощи по-линуклеотидкиназы фага Т4 в присутствии [у - р] -АТР после предварительной обработки гидролизата щелочной фосфатазой и удаления ее фенолом. После разделения полученных субфрагментов в полиакриламид-ном геле полученные радиоактивные зоны не отличались по подвижности от соответствующих субфрагментов дикого типа, что говорит о том, что мутации, по-видимому, не изменяли заметным образом длину субфрагментов и не затрагивали сайтов расщепления рест-риктаз. Для разделения цепей полученных после элюции из геля индивидуальных субфрагментов впервые была применена модификация метода разделения цепей, предложенная СО. Гурьевым, заметно сокращающая затраты времени на этом этапе. Модификация заключалась в том, что электрофоретическое разделение цепей проводили с использованием ПААГ со ступенчатым градиентом концентрации и сшивки акриламида, что устраняло необходимость в переполимеризации образцов из геля для разделения цепей, дающего большое количество примесей при элюции вследствие низкой "сшивки"(30:0,4), в гель с нормальной сшивкой (30:1).
Для этого в верхней половине стекол полимеризовали гель,оптимальный для разделения цепей, а в нижней - 8% гель с нормальной сшивкой. При этом условия электрофореза подбирали таким образом, чтобы все образцы ДЖ оказались в нижней части геля. В случае особенно плохо разделяющихся цепей электрофорез проводили при пониженной температуре (+7С), стабилизирующей пространственную структуру полинуклеотидов и уменьшающей вероятность.ренатурации. Первичную структуру полученных таким образом цепей субфрагментов определяли по модифицированному методу Максама-Гилберта, включавшего, в отличие от описанной стандартной методики /НО/, частичную апуринизацию полинуклеотидов муравьиной кислотой в условиях, предложенных Свердловым с соавт. /III/. При проведении специфической химической деградации были получены и сопоставлены радиоавтограммы гелей, на которых разделяли продукты, полученные классическим методом деградации и твердофазным методом деградации по Чувпило /112/. В этом методе терминально меченый фрагмент ДНК адсорбируют на ДЕАЕ-бумаге и в иммобилизованном состоянии подвергают специфическим химическим модификациям с последующим расщеплением. Как утверждают авторы работы /112/, по результативности этот метод практически не уступает общепринятому способу Максама-Гилберта, но требует значительно меньших затрат труда и времени. Однако в наших руках твердофазный метод приводил к значительным потерям радиоактивно меченного материала на стадии гидролиза пиперидином и элюции с ДЕАЕ-бумаги, что заставило нас в большинстве случаев отказаться в от его применения. После выполнения описанных процедур удалось надежно определить структуру областей, приведенных на рис. 7, и таким образом локализовать мутацию гроВЮ17. При этом было показано, что локализованная мутация располагалась, в соответствии с результатами более ранних исследований, в центральной части гена гроВ. С учетом локализации мутации гроВЮ17 в традиционном районе две остальные мутационные замены гровюоі и гроВЮіб идентифицировали, определяя первичную структуру только пяти субфрагментов,образующихся при гидролизе EcoRi-c фрагмента рестрикционными эндо-нуклеазами Hinfi и Bsp RI (см. рис. 7). 2) Установление первичной структуры EcoRl-G фрагмента, несущего мутацию гроВЮ19 Начальный этап определения первичной структуры EcoRl-G фрагмента проводили, используя стратегию, описанную выше. Субфрагменты для структурного анализа получали гидролизом большого фрагмента рестриктазами Мері, Hinfi и Sail. После введения концевой радиоактивной метки и электрофоретического разделения субфрагментов проводили деление цепей, а затем анализировали их первичную структуру по модифицированному методу Максама-Гилбер-та (см. рис. 8). Полученные последовательности, перекрываясь,охватывали большую часть EcoRl-G фрагмента. Первичную структуру неисследованных областей было решено определять с использованием другой стратегии, включавшей вместо стадии разделения цепей дополнительный гидролиз полученных субфрагментов еще одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами. Этим методом удалось определить первичную структуру субфрагментов, образующихся после повторного гидролиза суммарного набора радиоактивно меченных Sau3A l-субфрагментов рестрикционной эндонуклеазой Mspl, а также набора Sal I-субфрагментов рестриктазой Sau3A I (см. рис. 8) (при этом особое внимание уделяли надежности определения той части структуры EcoRl-G фрагмента, которая кодирует Н-концевой пептид А -субъединицы).
В результате определения последовательности субфрагментов, образующихся при гидролизе EcoRl-G фрагмента шестью различными способами (см. рис. 8), удалось надежно определить первичную структуру участка гроБ гена, кодирующего N-концевой полипептид 6 -субъединицы РНК-полимеразы E.ooli. Особых усилий, однако, потребовало определение последовательности, локализующейся на стыке Mspi субфрагментов Рис, содержащей восьмичленный GC-6O-гатый повтор, приводящий к возникновению устойчивой шпильки.Появление шпильки, образующейся на конце фрагмента при разделении продуктов химической деградации в структурном ПААГ и не разрушающейся в условиях частичной денатурации, приводило к явлению компрессии, выражавшейся в уравнивании подвижности полинуклеоти-да, несущего на своем конце шпильку и подвижности соседнего по-линуклеотида, укороченного на одно звено, а иногда даже к изменению соотношения подвижностей до обратного (см. рис. 9). При повторной попытке определения первичной структуры этого участка использовали расщепление Sau3A і-в субфрагмента рестриктазой Kpni (см. рис. 9). Метку вводили в 3 -концы субфрагмента с использованием фрагмента Кленова, в надежде на то, что цепь, комплементарная прочитанной ранее цепи Msp 1-е субфрагмента (меченного по 5 -концу с помощью Т4 полинуклеотидкиназы), будет обладать менее стабильной вторичной структурой. В целях экономии метки достройку концов проводили лишь у выделенного из геля единичного субфрагмента, выявляемого после электрофореза прокраской геля бромистым этидием. Эффект компрессии в этом случае несколько уменьшился, однако не устранился полностью (см. рис. 9). Для окончательного определения структуры этого участка проводили гидролиз EcoRl-G фрагмента рестриктазой Bsp RI, сайт расщепления которой должен возникать в данном месте в случае, если указанный эффект не связан с явлением компрессии, а отражает действительное изменение первичной структуры фрагмента (мутацию) (см, рис. 9). Поскольку указанная рестриктаза не расщепляла фрагмент ДНК в районе аномального расположения полос, можно заключить, что первичная структура района тождественна с последовательностью дикого типа. 3) Определение первичной структуры EcoRi-c фрагмента гена гроВ, несущего sti-r мутацию гроВЮ18 В отличие от вышеописанных мутаций рифампицин-устойчивости, локализация мутации устойчивости РНК-полимеразы к антибиотику стрептолидигину осуществлялась впервые и потому потребовала определения нуклеотидной последовательности всего EcoRl-G фрагмента мутантного гроВ гена (около 3 тыс. и.о.), где, как было показано генетическими методами, располагается указанная замена.
Локализация мутации устойчивости РНК-по-лимеразы к антибиотику стрептолидигину
Сравнение первичной структуры EcoRi-c фрагмента, несущего мутацию стрептолидигин-устойчивости, со структурой гроБ гена дикого типа впервые позволило локализовать stl-r мутацию гроВЮ18, оказавшуюся двойной транзицией G — -А,а? — -с, приводя- . щей к замене двух соседних аминокислотных остатков Gly. —»- Asp, Phe — -Ser в центральной части в-полипептида, т.е. непос- . редственно в районе расположения.большинства мутаций рифампицин--устойчивости (см. рис. 12, I3B). Этот результат согласуется с генетическими данными, выявившими тесную сцепленность этих мутаций и перекрестную устойчивость некоторых мутантных ферментов сразу к обоим антибиотикам /16/, а также указывает на возможное перекрывание центров связывания рифампицина и стрептолидигина. Однако в таком случае молекулы этих антибиотиков должны,вероятно, обладать сходными элементами структуры, участвующими во взаимодействии с центральным районом А -субъединицы. Действительно, участок молекулы рифампицина, включающий атомы С2о-Сі5» имеет аналогию с системой сопряженных двойных связей стрептолидигина (см. обведенные пунктирной линией участки молекул этих антибиотиков, изображенные на рис. 3 и 4 "Литературного обзора"); при этом карбонильная группа при атоме Cjg молекулы рифампицина соответствует претерпевающей кето-енольные таутомерные превраще- ния С -ОН группировке стрептолидигина. В соответствии с заключением о наличии гомологичных участков в молекулах рифампицина и. стрептолидигина находится тот факт, что главную роль во взаимодействии стрептолидигина с ферментом, по-видимому, играет именно диеновая система сопряженных двойных связей, а также остаток тетраминовой кислоты, интактность которых является непременным условием для проявления ингибиторной активности антибиотиков этого ряда /41/. Кроме того, енолизация остатка тетраминовой кислоты, приводящая к сдвигу кето-енольного равновесия в сторону формы, изображенной на рис. 4, приводит к полной потере активности стрептолидигина /41/. Локализованная мутация стрептолидигин-устойчивости затрагивает не один, а сразу два аминокислотных остатка, тогда как все идентифированные в настоящее время rif-r мутации, за исключением делеции гроВ25б, являются одиночными точечными заменами. Известно, что мутации, ведущие к устойчивости РНК-полимеразы к высоким концентрациям стрептолидигина, возникают гораздо реже, чем rif-r замены, хотя и локализуются в том же районе.
В связи с этим можно предположить, что пути возникновения устойчивости РНК-полимеразы к антибиотикам рифампицину и стрептолидигину заметно различаются. Е. Локализация функционально важных участков в составе А -субъединицы РНК-полимеразы в.ооїі Очевидно, что поскольку мутации устойчивости РНК-полимеразы к антибиотикам рифампицину и стрептолидигину не влияют заметным образом на жизнеспособность мутантных клеток, эти замены в большинстве случаев не затрагивают функционально важных аминокислотных остатков фермента. Однако разумно предположить, что эти замены располагаются в непосредственной близости от участков активного центра, блокируемых рифампицином и стрептолидигином.Детальные исследования механизма действия этих антибиотиков /7/ привели к заключению, что рифампицин в основном блокирует продуктивную инициацию РНК, приводя к абортивному синтезу коротких олиго-рибонуклеотидов, вследствие конкуренции с РНК-продуктом /25,115, 116/, тогда как стрептолидигин ингибирует как инициацию, так и элонгацию оинтеза РЖ, по-видимому, конкурируя с.элонгирующими нуклеозидтрифосфатами за место связывания на РНК-полимеразе /40/. В связи.с этим можно думать, что зона расположения rif-r и stl-r мутаций, включающая аминокислотные остатки № 516-564 д -субъединицы РНК-полимеразы E.coli, принимает участие в связывании.обоих антибиотиков, а следовательно, и в образовании, а возможно, и функционировании как центра связывания элонгирующего НТФ, так и центра связывания и транслокации синтезируемой РНК в той его части, которая контактирует с 3 -концом растущей цепи продукта. В соответствии с этим заключением находится тот факт, что рифампицин, по-видимому, влияет на участок связывания терминальной дифосфатной группировки того субстрата, который необходим для удлинения синтезированного динуклеотида на одно звено /116/, откуда можно сделать вывод, что после транслокации динуклеотида антибиотик прямо или аллостерически влияет на центр связывания и гидролиза молекулы элонгирующего НТФ.
Интересно, что анализ первичной структуры района расположения rif-r и stl-r замен в составе А-субъединицы фермента, позволяет выделить в непосредственной близости от stl-r мутации гроВЮі8 не затрагиваемый мутациями нонапептид, содержащий кислотно-основную пару тиол-ими-дазола, характерную для активного центра различных киназ, катализирующих с помощью этой пары реакцию гидролиза макроэргической связи ATP в ходе процесса фосфорилирования /117/ (см. рис. 14). Не исключено, что именно этот участок катализирует отщепление пирофосфата от молекулы элонгирующего субстрата. В этой связи можно отметить довольно высокую степень гомологии указанного но-напептида с центральным участком молекулы РНК-полимеразы бактериофага Т7: 554 РНК-ПОЛИмераза E.coli: His Туг Gly Arg Val Cys Pro lie Glu 211 РНК-полимераза фага T7: His Val Gly Val Arg Cys - He Glu Так же как и стрептолидигин, рифампицин, вероятно, связывается с РНК-полимеразой на всех этапах синтеза РНК /118/, однако прочность образуемого комплекса, по-видимому, зависит от силы связывания РНК-продукта, конкурирующего с антибиотиком за РНК--связывающий центр фермента /116/. В то же время, как свидетельствуют экспериментальные данные, рифампицин не только конкурирует с РНК-продуктом, но и нарушает взаимодействие РНК-полимеразы с различными регуляторными факторами (в частности, б -фактором, jo-фактором, nusA белком и ppGpp); нарушения взаимодействия фермента с регуляторными факторами отмечены также для некоторых-rif-r замен /66,77,82,122,123/. Можно думать, таким образом,что центр связывания антибиотиков рифампицина и стрептолидигина, локализующийся в центральной части б -полипептида, частично перекрывается не только с продукт-связывающим и субстрат-связываю-щим центрами РНК-полимеразы, но и с центром связывания различных регуляторних факторов (в частности, tf -фактора).
