Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 2
2. Роль петель в функционировании белков 5
2.1. Конформационные изменения в белковых структурах 5
2.2. Строение петель 8
2.3. Конформационные изменения петель и их участие в функционировании белков 13
2.4. Роль остатков глицина в формировании структуры и обеспечении- конформационной подвижности активного центра. 36
3 Конформационные изменения в структуре неорганической пирофосфатазы 37
3.1..Связывание ионов металла. 41
3.2. Связывание субстрата. 42
3.3. Гидролиз субстрата. 43
3.4. Уход продуктов 44
4. Роль конформационных изменений в функционировании неорганической. пирофосфатазы Escherichia coli 46
4.1. Исследование мутантных вариантов Е-РРазы GlylOOAla и Glyl47Val. 46
4.2. Количественная оценка стабильности структуры РРазы 67
4.3. Роль остатка Asp67 в функционировании РРазы Е. coli 88
5. Экспериментальная часть 96
Выводы 105
- Строение петель
- Роль остатков глицина в формировании структуры и обеспечении- конформационной подвижности активного центра.
- Гидролиз субстрата.
- Количественная оценка стабильности структуры РРазы
Введение к работе
Актуальность проблемы.
В настоящее время существование глобулярного белка в растворе принято рассматривать как набор конформационных состоянии, между которыми существует равновесие. Из многочисленных переходов между конформациями лишь малая часть необходима для проявления биологической активности белков, в том числе ферментов. Выявление структурных перестроек, участвующих в ферментативном катализе, и выяснение их роли в функционировании ферментов является одной из проблем современной биохимии.
Объектом исследования в настоящей работе является неорганическая пирофосфатаза из Escherichia coli. Растворимые неорганические пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1.; РРазы) катализируют гидролиз неорганического пирофосфата до двух молекул ортофосфата. Структура РРаз семейства I, к которым относится изучаемый фермент, очень лабильна и в ходе функционирования, несомненно, проходит через большое количество конформационных состояний. Анализ пространственных структур РРаз позволяет выявить некоторые из специфических перестроек, которые, в частности, включают подвижные участки 97-101 и 141-149, обрамляющие вход в активный центр. Консервативность данных неупорядоченных участков в структурах РРаз из разных источников, а также схожесть наблюдаемых перестроек для РРаз Е. coli и S.cerevisiae позволяют предположить, что подвижность данных структурных элементов, а также лабильность структуры в целом могут играть важную роль в катализе. Поскольку РРазы являются одними из наиболее эффективных катализаторов, то исследование вклада конформационной подвижности их структуры в ферментативную активность представляется актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена выяснению роли структурной лабильности в функционировании РРазы Е coli. Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи:
-
изучение свойств мутантных РРаз Е. coli с заменами остатков глицина в неупорядоченных участках 97-101 (далее петля П) и 141-149 (далее петля III);
-
определение параметров термической и химической денатурации нативвой РРазы Е. coli и ряда мутантных вариантов. Оценка вклада введенных мутаций и связывания лигандов в стабильность глобулярной структуры РРазы;
-
выяснение возможной роли остатка Asp67 в катализе РРазы Е. coli.
I., srsgytoi
" '.« у»
Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе охарактеризованы две не описанные ранее мутантные формы пирофосфатазы E.coli с заменами GlylOOAIa и Glyl47Val, в которых конформациовная гибкость участков 97-101 и 141-149 искусственно снижена. Установлено, что замены остатков глицина в подвижных петлях снижают скорости информационных перестроек, необходимых дяя принятия активной конформадии фермента при связывании субстрата. Введение замен привело к значительному снижению каталитической константы гидролиза субстрата. Причиной снижения *см является замедленный уход продуктов реакции. Установлено, что максимальное равновесное количество связанного с ферментом пирофосфата при его синтезе из фосфата магния для варианта GlylOOAIa в 2 раза и для варианта Glyl47Val в 5 раз превышает уровень, характерный для нативной РРазы.
Определена энтальпия термической денатурации нативной РРазы Е. coli и мутантних вариантов GlylOOAIa и Glyl47Val, а также ряда вариантов с единичными заменами в различных областях молекулы. Количественно охарактеризовано стабилизирующее влияние Mg2* на РРазу Е. coli.
Изучена денатурация WT и ряда мутантних РРаз под действием гуанидннгидрохлорида. Рассмотрены две модели денатурации РРазы, рассчитаны соответствующие изменения свободной энергии. Установлено, что введение мутаций снижает стабильность глобулярной структуры РРазы. Показано, что добавление свободного пирофосфата увеличивает энергию денатурации нативного фермента.
Анализ рентгеноструктурных данных и изучение рН-зависимости ингибнрования РРазы фторид-ионом позволил высказать новое предположение о роли остатка Asp67 в катализе неорганической пирофосфатазы Е. coli.
Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002 г.), Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), 29 Конгрессе Европейского Биохимического сообщества FEBS-2004 (Варшава, 2004), 3 международном конгрессе по пирофосфатазам (Бирмингем, 2004).
Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах и содержит -& рисунков и 47 таблиц.
Строение петель
Наиболее, распространенными\ элементами вторичной структуры белков, являются а-сшірали и р-листы. Между собой эти структурные элементы соединяются , малоупорядоченнььмл участками- петлями. По классическому определению, петли -это нерегулярные, (апериодические) элементы структуры,, соединяющие- элементы регулярной (периодической) вторичной структуры. В более широком смысле.петлями называют любые, неупорядоченные участки полипептпднон цепи («random coil»). Однако, иногда петли в значительной мере структурированы и могут рассматриваться как регулярный элемент [9]. Петли, как правило, имеют относительно высокое значение.: В-фактора, однако занимают вполне определенное, положение в- структуре, белка. В их строении-наблюдаются закономерности.. Практически во всех белковых структурах,, даже-, для; длинных,- протяженных петель, наблюдается: сближенность их концевых, участков; Расстояние, между началом и. концом петли (от. первого Са-атома. до последнего) обычно менее 10 А и не превышает двух третьих от максимального расстояния между двумя любыми Са-атомами в петле [10]. Таким образом, петли прикрывают торцевые части регулярных элементов - структуры. Также нужно- заметить., что крайне: редко наблюдается «наложение» петли на петлю-(или-«пересечение: петель»). Наложение петель, в-пространстве энергетически невыгодно (дополнительное: изгибание.. угроза-столкновения и дегидратации). Петли обычно расположены на поверхности белковой глобулы,, закрывая: гидрофобный кор. В составе: петель преобладают гидрофильные остатки, которые образуют водородные контакты с молекулами воды. Петли практически никогда не входят внутрь.белковой.глобулы.. В отом случае,. перестройка привела.бььк разрыву водородных связей с водой и в итогек дестабилизации глобулы [11] Такая позиция: петель, определяет их важность для, молекулярного распознавания, каталитической активности ферментов и специфичности связывания лигандов. Таким образом, помимо структурной роли, петли могут играть важную роль в биологической функции белков. Анализ первичной структуры петель показывает, что центральное положение в них часто занимают остатки Gly или Pro, режеЭег, Thr или Asp.. Последовательности1 петель менее консервативны, чем последовательности участков, формирующих гидрофобный кор белка. Однако, если входящие в состав петли аминокислотные остатки принимают участие в катализе,.то для них наблюдается более высокая консервативность, чем для остальных, чисто структурных, остатков [12]. Наличие остатков - глицина в составе петли не является;: обязательным условием, однако, его присутствие открывает большую свободу в выборе конформаций.
Остаток глицина сильно отличается по строению и свойствам от. других" аминокислотных остатков,1 Благодаря; отсутствию бокового радикала,, он придает поли пептидной цени большую свободу в выборе конформаций. В частности, это выражается в возможности «скручивания» цепи, вокруг С„-атома: остатка глицина,, который при этом-служит" своеобразным., шарниром. Включение даже одного остатка; глицина, в участок ноли пептидно и цепи приводит к резкому возрастанию ко нформ анионной гибкости этого участка, что особенно характерно для коротких петель. 2.2.2. Классификация петель. Базовая классификация петель была предложена в 1968 году [13]. Она основана на.количестве входящих в петлю остатков; Так,, у-повороты состоят, из трех "остатков: [14], р-повороты (называемые иначе р-изгибы) - из четырех аминокислотных остатков и т.ДІ.Эта классификация была дополнена и.расширена в последующие годы. Каждый класс был разбит па подклассы, которые различаются геометрией остатков петли; и последовательностью мотива [15. 16]. Более длинные петли могут рассматриваться как шпильки, оканчивающиеся соответствующим элементом (например, р-поворотом). Альтернативный тип классификации, основат на определении элементов структуры, которые соединены данной; петлей. Так. р-р\ петли соединяют две антипараллельные р-цепи (т.н. Р-шпилька) [17]. Остальные семейства;включают,сш. а-р" и. р-а. петли и делятся на подклассы; в зависимости от геометрии входящих в петлю остатков. Некоторые авторы: классифицируют петли по форме основной цени [18]. Такой? тип классификации удобен при моделировании пространственных структур ab initio: По мере увеличения.числа решенных белковых структур, становилось все более: очевидным, что петли, выполняющие определенную биологическую роль, могут иметь сходную конформацию в; различных белках, поэтому они; классифицированы по; функциональному признаку [19]. К наиболее распространенным мотивам относятся EF-кальций связывающая петля [20],. NAD(P) связывающая; петля. [21] И: АТР-связывающая: или так называемая Р-петля [22]. В состав у-поворота входят всего 3 аминокислотных остатка. Эта петля стабилизируется за счет одной водородной связи между первым и последним остатками і и і+2 (рис. 3). Положение і+1, в вершине поворота, как правило, занимают остатки Pro или Gly, хотя встречаются и другие аминокислоты, содержащие небольшой боковой радикал (например, Ala) [23, 14]. Встречается два типа у-поворотов - классические и обращенные (inverse). Разница состоит в значениях торсионных углов остатка, расположенного в вершине поворота (і+1): Из этих двух поворотов классические повороты редко, но все же встречаются в белках, например, в легкой цепи некоторых иммуноглобулинов. В большинстве случаев эти повороты находятся в повороте Р-шпильки.
Обращенные гамма повороты, несмотря на то, что находятся в начале петли, иногда встречается в Р-шпильках. В редких случаях этот поворот используется для разворота основной цепи на 180. -поворот. Для создания наиболее «крутого» разворота полипептидной цепи в белках чаше всего используется р-иоворот, или р-нзгиб. Структура тгого элемента изображена на рисунке 4. Эта петля состоит из четырех аминокислотных остатков и обычно является; соединительным звеном в Р-шпильке, стягивая; окончание соседних. ТЯЖЄЙІ в антипараллельных Р-листах. Стабилизация; структуры, происходит благодаря-образованию водородной связи; между СО-группон первого: аминокислотного остатка (О.и NH-группой третьего остатка О +З) [16]. Существуют два-основных-типа Р-изгибов,.1 и II; различаюшихся-конформацией пептидной связи, между остатками 2". и: 3 [24]. Основное: отличие, которое можно1 наблюдать на рис. 4, состоит в том, что атомы кислорода и водорода ПЄПТИДЕІОЙ группы направлены в противоположные стороны относительно плоскости поворота; Для обоих: типов Р-изгибов: торсионные углы входящих: R поворот остатков могут принимать только определенные значения, что: накладывает ограничения на- выбор-аминокислотных:остатков, способных.занимать определенную позицию в петле. Так,. например; для поворотов I типа позицию; 1 способны преимущественно занимать Asn; His, Gly, Asp, в то время как позиция: 2 является строго консервативной и в ней может, находиться исключительно остаток глицина. Для изгибов; типа Іі наблюдается: противоположная ситуация, Вотом случае,позицию71.может занимать только Gly. а в; позиции 2 могут стоять преимущественно остатки Asn, Asp или Ser. Петли, образованные шестью аминокислотными остатками, называются к-поворотами. Впервые такой тип поворотов был описан Шелманом [26] как петля на С-концс а-спирали, состоящая из шести аминокислотных остатков со значениями торсионных углов, характерными для левозакрученной спиральной конформации (OIL). Такой элемент впоследствии был назван «мотив Шелмана». При этом, в отличие от водородной связи, типичной для р-изгибов (между 2 и 5 остатками поворота, см. рис. 5), в ті-повороте формируется водородная связь между 1 и 6 остатками. В большинстве гс-поворотов существуют обе эти связи. Позже было установлено, что л-повороты могут встречаться в любой из двух хиральных форм, а или ак, в зависимости от конформации входящих в петлю остатков. Исчерпывающий анализ базы данных белковых структур показывает, что иногда л по вороты встречаются и на окончаниях р-цепей [28]. Внутренняя классификация л-летель связана с конформационной характеристикой 5-го остатка. Вес многообразие д-петель разбивается на четыре класса: 1) лак-поворот, остаток в 5 положении имеет значения фиір углов, характерные для кк-области на карте Рамачандрана; 2) тгаі.-поворот, остаток в 5 положении располагается о области с ; 3) к\\.-поворот является хиральиым по отношению к паі-повороту; 4) щ- но ворот, остаток в 5 положении расположен в р области на карте Рамачандрана. Предпочтительным остатком для принятия aL конформации является Gly и, в меньшей степени, Asn.
Роль остатков глицина в формировании структуры и обеспечении- конформационной подвижности активного центра.
Сравнительный анализ аминокислотного состава гидролаз показах что наиболее часто в абсолютно консервативных позициях встречаются: остатки Glyи Asp [70]. В сумме Gly и. Asp составляют 50% всех консервативных остатков, Как правило, консервативные остатки, глицина не играют заметной, роли- в химических актах активации;молекул в каталитическом цикле. Не обладая заместителем у С«-атома, Gly лишен выраженной химической; функции. Тем не: менее: остатки; глицина; имеют принципиальное, значение в ферментативном: катализе, играя уникальную, роль, во-первых, в обеспечении правильной7 укладки белковой: структуры, и во-вторых. В: придании полипептидной цепи необходимой степени конформационной гибкости. Глицин: может играть, роль узловой1 точки, обеспечивающей: возможности. изменения направления полипептидной цепи при ф олдинте белка, особенно при сборке активного центра;. Это обеспечивается за счет энергетически облегченного вращения вокруг связей - C-N: и С-С (большая конформационная свобода в; выборе: торсионных углов, ф и у). Наличием; консервативных остатков глицина можно объяснить, кажущийся парадокс, что совершенно одинаковые активные центры «формируются» из совершенно разных полипептидных цепей. Остатки глицина могут также играть роль конформационных: «шарниров». обеспечивая: конформационнуга. подвижность структурного элемента. При исследовани и, poj і и остатков глицина иногда удается сделать: выбор: между этими возможностями, разделив ((структурообразующую» и «гибкость- обеспечивающую» функции. Лнтонлеурин, нейротоксин морской актинии, взаимодействует с высоким:сродством с наїриеиьш каналом (Nav) и инактивирует его. Нейротоксин состоит из 49 аминокислотных остатков, сшитых тремя дисульфидными связями. Конформация белковой глобулы представляет собой структуру, 4 антииараллельных р-тяжа- (остатки; 2-4, 20-23,. 34-37 и 45:48),.. соединенных между собойр-поворотами и петлями: Три.консервативных диеульфидных связи (Cys4-Cys46,, Cys6-Cys36f и= Cys29-Cys47) обеспечивают жесткость полипептидной.цени,. и только один у часто к п о липептидной. цепи,: называемый обычно « петля; Лгц 14 » (остатки 8-17), проявляет: высокую разупорядочешюсть. Аминокислотная последовательность данного участка: не. выявляет консервативности,. однако наблюдается присутствие: самой петли: во всех известных актнниевьтхлчжеинах. В данной петле находятся два остатка глицина (GlylO и Glyl5) и еще один - в примыкающем регионе (Gly20) [71].
Замена консервативных остатков: глицинов, на аланин. приводит к.: следующим результатам; Мутантный: вариант: с заменой Gly20AIa оказался неспособен к фолдингу, что показывает определяющую роль Gly20 в образовании необходимых: контактов Р-цени на. начальных; этапах сворачивания-пептида. Глищшьт в положениях 10 и, 15 не: являются структурно-определяющими,. КД-спектры мутантных вариантов G10A, G15A и- G10/VG15A практически не отличаются, от исходного спектра. Однако замены любого из этих остатков резко снижают сродство токсина к натриевому каналу. Этот результат подтверждает, что Gly 10 и Glyl5 обеспечивают высокую подвижность.этои: петли, что необходимо для эффективного связывании с натриевым каналом;, Растворимые: неорганические пирофосфатазы.(РРазы); катализируют гидролиз нирофоефата (РРІ) с. образованием двух фосфат-ионов (Pj).. Минимальная- схема, гидролиза: включает- образование холоформы (комплекса, фермента: с двумя і ионами металла-активатора); связывание субстрата: (комплекса, пирофосфата с:: металлом), собственно гидролиз и последовательный;уход двух образующихся фосфатов (рис. 22). Обнаруженный сравнительно» недавно дополнительный этап;, изомеризация: фермент-субстратного комплекса (стадия, которая характеризуется константами скоростей А и; кн, см. рис:), подчеркивает важную роль конфирмационных изменений в катализе [72].. Гидролиз пирофосфата происходит прямой атакой нуклеофильной молекулы воды, связанной между ионами металла Ml и М2 (Wa на рис. 23), на электрофильный атом фосфора без образования промежуточного ковалентного фермент-субстратного интермедиата [76]. Два образующихся при гидролизе фосфата и центры их связывания традиционно обозначаются как Р1 (уходящий) и Р2 (электрофильный). Последовательные стадии ухода обоих фосфатов в рН-оптимуме гидролиза (около 8,5 для РРазы Е.соИ) являются скорость-лимитирующими [77]. Бактериальные РРазы семейства I функционируют как гомогексамеры, построенные из двух тримеров, уложенных один на другой в форме сэндвича. Субъединица пирофосфатазы является однодоменным белком (рис. 24). Основу глобулы составляет стабильный гидрофобный кор. Пространственная структура стабилизирована только нековалентными взаимодействиями [75]. Полипептидная цепь РРазы Е. coli организована в 7-цепочечный закрытый Р-цилиндр. В структуре пирофосфатазы Е. coli имеется также две длинные а-спирали. В молекуле белка присутствует 4 р-шпильки, 16 р-изгибов и 2 у-поворота (рис. 25). Из 175 аминокислотных остатков в состав РРазы Е. coli входят 9 остатков глицина. Гомологичные остатки Gly56 и 154 располагаются в р-цепях, Gly66, 100 и 147 - в р-изгибах. Остальные остатки глицина имеют низкую гомологию.
Полипептидная цепь РРазы Е. сої і содержит несколько подвижных областей. К ним, в частности, относятся три петли, обрамляющие полость активного центра, которые образованы остатками 63-67, 97-101 и 141-149 и обычно обозначаются как I, II и III). Подвижность этих трех петель обеспечивается консервативными остатками глицина: Gly66, GlylOO и Glyl47. Активный центр фермента представляет собой большую полость диаметром около 20 А, основание которой опирается на гидрофобный кор [75]. Активный центр растворимых пирофосфатаз условно можно разбить на две части по подвижности структурных элементов. Одна часть образована стабильными элементами структуры, в ней расположена половина субстрат-связывающих остатков (Lys29, Arg43, Tyr55). Многие остатки, расположенные в этом районе, участвуют в межсубъединичных контактах, что дополнительно повышает структурную стабильность данной части активного центра. Остальные субстрат-связывающие (Tyrl41, Lysl42) и металл-связывающие остатки (Asp65, Asp67, Asp70, Asp97 и Asp 102) расположены в подвижных участках полипептидной цепи. Благодаря такому строению активного центра, структура растворимой пирофосфатазы легко может изменяться при связывании лигандов в процессе катализа. Действительно, рентгеноструктурный анализ комплексов растворимых РРаз с различными лигандами позволяет проследить специфические изменения, которыми сопровождаются последовательные стадии катализа. Данные дифференциальной спектроскопии и рентгеноструктурного анализа свидетельстуют, что на стадии связывания ионов металла происходят значительные конформационные изменения. Наложение структур апоформы РРазы E.coli и комплексов с ионами металлов (Mn2+, Mg2+ или Са2+) показывает, что образование комплексов ЕМ\ и EMi инициирует изменение положения многих функциональных групп активного центра [78-80]. При этом смещаются не только непосредственные лиганды ионов металла (Asp65, Asp70 и Asp 102), но и другие остатки активного центра (напр., Lysl04, Glu20, Рго68, Tyr55, Glu31, Asp42, Asp67, Glu98, Tyrl41, см. рис. 26). Благодаря разветвленной сети нековалентных контактов конформационные изменения передаются во все части глобулы, так что изменяют свое положение и аминокислотные остатки, весьма удаленные от активного центра (например, Arg86). Еще одним следствием связывания ионов металлов является увеличение количества молекул воды, связанной с белком, в том числе появление структурированной воды в активном центре. При образовании холоформы происходит не только движение боковых групп, но и смешение подвижных участков полипептидной цепи. Наибольший сдвиг наблюдается для петель И (97-101) и Ш (141-149) (рис. 26 (б), нижняя панель). Петля I (63-67) смещается не так значительно. Кроме сдвига, в особенности для: петли II, наблюдается конформационное изменение другого типа - скручивание полипептидной1 цепи; т.е. изменение торсионных:. углов: остатков, вокруг глшшна 100 (рис. 26 (б), верхняя панель) [75].
Гидролиз субстрата.
Последующие стадии каталитической реакции - гидролиз субстрата и уход продуктов - могут быть проиллюстрированы только для пирофосфатазы S. cerevisiae (Y-РРазы), т.к. для пирофосфатазы Е. coli до последнего времени не была получена пространственная структура комплекса с продуктами реакции. Наложение структур комплексов Y-РРазы с Мп и пирофосфатом (фермент-субстратный комплекс, стабилизированный фторид-ионом) и с четырьмя ионами Мп и двумя фосфатами дает возможность проследить конформационные изменения, которые сопровождают собственно гидролиз PPj [73]. Кроме того, анализ последней структуры демонстрирует некоторые промежуточные конформационные изменения, происходящие после гидролиза, но до диссоциации фосфатов. В структуре Y-РРаш к комплекте с Мп2 м Р, оба фосфата имеют две альтернативные кокформапии,. которые соответствуют двум послединагельным интермедиатам после гидролиза РР,. Для электрофильного фосфата. Р2. эти конформации были названы Р,ир и Pt ,"v". Конформация р "" характерна для фосфата Р2 непосредственно после гидролиза, т.к. один из кислородныхашмов (0\и), пришедший от атакующей частицы, все еше находится между ионами металла Ml и М2. Конформация?Р;ир характерна для последующей стадии реакции, на которой,.согласно предположению авторов, образуется "редактированный продукт \ Две альтернативные конформации, наблюдаемые: для- фосфата Р1,. соответствуют этим интермедиатам. Наблюдаемая; координация, фосфат-ионов согласуется с ассоциативным механизмом гидролиза, при котором электрофильныи фосфат Р2 обращает свою конфигурацию, в то время как-уходящий фосфат Р1 сохраняет исходную конфигурацию. При: наложении активного центра фосфатного комплекса: в «down»-конформации И РР;- видно; что собственно гидролитическая стадия изменяет положение. групп: активного центра лишь незначительно. Сдвигаются только группы: -непосредственные диганды фосфатов, например Lys56(Lys29 в Е. со//),. Lysl 93-(Lysl42.. в E.coti).
Смещения основных цепей непосредственно после гидролиза не наблюдается. 3.4; Уход продуктов. Конформационные изменения,. сопровождающие: последовательный, уход двух: Р;1 относятся:к наименее попятным структурным и механистическим аспектам действия; РРаз: Из возможных- конформациопных.: изменений, которые., предположительно., должны: происходить- при; уходе- фосфатов,- необходимо- выделить одно;: разворот-фосфата Р2 из; «down»- В «ир»-конформацию (рис. 28). Эта перестройка, наблюдается в: структуре. Y-РРазы, когда: центр Р1 все еще заполнен:. Наблюдаемая? «up» -конформация:Р2, но всей,вероятности, является:переходной между гидролизом РР;1 и, уходом- Р; . Разворот Р2" требует, в. частности,, ухода кислородного атома-.. ON-U из координационной сферы ионов металла как Ml, так и М2 [73]. Наложение структуры фосфатного:комплекса Y-РРазы.в:«up»-конформации на: структуру холофермента: позволяет оценить: в целом: структурные последствия ухода: двух фосфатов, после гидролиза; В.- основном і конформационные: изменения? на;.этой: стадии: похожи на перестройки; наблюдаемые на; стадии . связывания. субстрата (п. 3.2). Однако упомянутые, структуры являются лишь начальной:; и конечной: точками; сложного процесса, гораздо более сложного, чем связывание субстрата. Существование: по меньшей мере двух стабильных интермедиатов, наблюдаемых в структуре 45 фосфатного комплекса Y-РРазы 1E9G, подтверждает этот вывод. В целом изменения, происходящие после диссоциации обоих продуктов, очень напоминают изменения в Е-РРазе при связывании СаРР„ но происходящие в обратном порядке: два иона металла Ml и М2 отодвигаются друг от друга, боковая группа Arg78 (43 в Е-РРазе) разворачивается из активного центра в раствор. Основная цепь на этом этапе сдвигается в основном на участках вокруг Asp! 15 (65, петля 1) я Asp 147 (97, петля II). Таким образом, конформационные изменения очень схожи для различных РРаз. Удивляет тот факт, что и перестройки, затрагивающие подвижные участки основной цепи, также весьма похожи для прокариотического и эукариотического ферментов. На каждой стадии катализа наблюдаются свои, специфические конформационные изменения, причем смещение основной цепи не всегда коррелирует с се конформационной подвижностью. Консервативность строения подвижных элементов и претерпеваемых ими структурных перестроек может говорить о том, что наблюдаемые изменения играют определенную роль в катализе, только в этом случае имеет смысл сохранение конформационной подвижности данных участков в процессе эволюции. Актуальной задачей современной биохимии является, выяснение роли, конформационных изменений: в функционировании белков. Выше были;: описаны, конформашонные изменения, которые, судя по данным ренттеноструктурного анатиза,. происходят: по- ходу катализа неорганической, пирофосфатазой; Настоящая; работа посвящена, выяснению, возможной роли: наблюдаемых перестроек длят функционирования фермента. Первая, часть посвящена изучению роли неупорядоченных участков 97-10] (петля II) и 141-149 (петля III) , расположенных у входа в активный центр РРазы . соІі,.в катализе. Для этого были изучены свойства, мутантных РРаз с пониженной; гибкостью данных участков (варианты- с заченами-остатков: глицина GlylOOAla, и; GIyl47Val).
Вторая; часть работы посвящена; количественной характеристике, стабильности/подвижности глобулярной структуры РРазы: и оценке вклада в нее; некоторых факторов, таких как: введение мутаций; и связывание лигандов,. Для;- этого изучена термическая: и химическая: денатурация-нативного фермента и некоторых мутантных вариантов и рассчитаны термодинамические параметры денатурации. В- последней части работы проанатизирована возможная.роль остатка Asp67 в катализе РРазой E.coli. Дія этого привлечены последние данные «рептгеноструктурной кинетики» фермента; 4.1: Исследование мутантных вариантов Е-РРазы GlylOOAla и Glyl47VaL. 4-III: Положение остчткив Gfy 100 и Gly 147 в структуре РРазы Е. coiL- Строение петель И- и III показано на рисунке,: 29. Как: показывает анализ пространственных, структур,петли II и III претерпевают по ходу катализа; похожие: изменения ;конформаций; в І двух различных белках- Р Разах из дрожжей и E.coli. Эти,, петли содержат функционально-важные: остатки, участвующие в- связывании: ионов металла (Ml.и МЗ). Короткая:; петля: II": (рис. 29; а) соединяет, цепи P-6(Val90hr96) и р-7 (Aspl02-Hisl 10), входящие, в; Р-цилиндр. В; этой: подвижной области; расположены: лигандьі: ионов: магния, - Asp97" и; AspI02. Тетрада Asp97-Giu98-AIa99-Glyl00- представляет, собой 3-изгиб. где пептидный атом азота остаткаАБр97 и кислородный атом пептидное группы; GlylOO: связаны; водородной; связью {2,97 А)... Остаток; глицина занимает, четвертое положение в .тетраде, хотя-для классических р-изгибов предпочтительнее Gly в третьем положении. Во всех имеющихся структурах РРазы Е. colt торсионные углы 9 Выравнивание аминокислотных последовательностей растворимых РРаз (около 80), обнаруженных в базе данных [82], показывает, что только две РРазы (обе - из прокариотических организмов) не имеют ни одного остатка глицина в гомологичной петле II (рис. 30). Примерно треть прокариотических РРаз и все эукариотические ферменты содержат Gly не в четвертом положении тетрады, а в третьем. Девятнадцать РРаз содержат по два остатка глицина в гомологичном участке. В структуре, где Gly занимает третье положение в тетраде (РРаза S. cerevisiae), его конформация соответствует а. области карты Рамачандрана. Эта область не запрещена для аминокислотных остатков с боковыми радикалами, полому наличие глицина вланном P-ичшїіе.: в принципе, не является необходимым условием. Тем не менее, высокая консервативность Gly 100 подразумевает, что введение вместо него остатка с боковым радикалом может вызвать определенное напряжение структуры в результате неоптимальных, значений торсионных углов и, как следствие, локальную дестабилизацию глобулярной структуры РРазы. Участок III, содержащий Gly 147, представляет собой более; длинную петлю,. которая соединяет а-спираль A (GIul28-Hisl40) и цепь р-8 (Vall50-Glui56, рис. 29vt7). Спираль-Л играет важную роль в формировании межсубьединичного контакта..В этом регионе также: расположены: остатки Туг141 ц Lysl42, участвующие в связывании пнрофосфатной части субстрата.
Количественная оценка стабильности структуры РРазы
Чтобы, количественно оценить, вклад различных; факторов, таких: как. произведенные мутации; в конформационную стабильность, РРазы, необходимо было найти подходы к количественной оценке собственно стабильности белковой структуры; . С этой.целью в: работе:использовали ;три метода: изучение: влияния вязкости среды на-каталитические параметры,, определение: энергии термической денатурации РРазы; и определение энергии химической денатурации. 4.2.1. Влияние вязкости среды на каталитические параметры РРазы. В ферментах основные каталитические события происходят в активных центрах; куда., как правило, молекулы воды имеют лишь ограниченный доступ. Однако любой1 глобулярный белок имеет наружную гидратную оболочку и функционирует в водном растворе. Если в ходе каталитической; реакции: происходит смещение каких-либо экспонированных элементов структуры, то их гидратная оболочка при движении трется об растворитель. Подобное трение определяется вязкостью раствора, н котором работает фермент. При значениях относительной вязкости, около 2,5 - 3. которые характерны для-внутриклеточной1 жидкосзи [96. трение:влияет на движение молекулы бедка в целом, на скорость диффузии его субстратов или продуктов, а также на скорость смещения: экспонированных элементов структуры. В тех случаях, когда. движение таких элементов определяет скорость катализа в целом, вязкость среды будет влиять па каталитические: параметры. Это может быть- движение доменов при образовании;активного центра; смещение.петель-при переходах активного центра из закрытого в открытое состояние; ассоциация субъедиииц с. образованием активного олигомера и др. Таким образом, изучение влияния вязкости; среды на каталитические параметры фермента может дать ценную информацию о роли коиформационной динамики, его молекулы в катализе. В частности, иногда„таким подходом- удается количественно оценить вклад: конформашюнных изменений в. скорость-лимитируюшую стадию катализа. В литературе описано применение подобного подхода к исследованиям таких ферментов, как: карбоксипептидаза [97], алкогольдегндрогеназа [98], глутатион-трансфераза [99] и др: Во всех случаях.скорость ферментативнойреакцииснижаетсяс увеличением вязкости среды, поскольку на лимитирующей стадии каталитической реакции ключевую роль ш-рают разного рода конформационные изменения белковой молекулы.
В;качестве RHCKOгена..т.е. соединения; повышающего вязкость растворов в исследованиях ферментов- использовали- глицерин.. глюкозу, сахарозу. полиэтиленгликоль [97-100], Эти- вискогены:: не: взаимодействовали специфически с: исследованными объектами, а влияли: па. скорость катализа косвенным: иутем.\ Применение различных вискогенов. в: зависимости от их; размера, дает возможность количественно оценить вклад в катализ конформашюнных нзмененийрашого уровня -от смешения экспонированных боковых трупп до взаимного смешения доменов. В настоящей работе изучали; влияние вязкости на: каталитические- параметры, гидролиза: MgPP; нативной: РРазойї Е: coli и некоторыми:, мутантными вариантами, в первую очередь с заменами GlylOOAla и Glyl47VaI. Гидролитическую активность РРаз: измеряли; в: диапазоне концентраций: субстрата- в буферных растворах; содержащих возрастающие концентрации вискогена. Для создания растворов с различной вязкостью были ,выбраны: несколько веществ; различающихся по; молекулярной, массе:: глицерин, глюкоза и ацетилированный полиэтиленгликольЛЭГ-бООО.1 (В-литературе отсутствуют: данные: о возможном взаимодействии РРазы с этими: соединениями). Относительную вязкость растворов п/п о измеряли отдельно ,тдя каждиго раствора. Полученные значения каталитических параметров, ксМ и k JKm, нормировали на значение соответствующего: параметра: в; отсутствие вискогена: (при относительной вязкости т\/ца—0 и- представляли в- следующих координатах: по- оси абсцисс откладывали значение- относительной вязкости (т/го), а по: оси; ординат -величину,- обратную-значению нормированного параметра (к cat и (A at/Klm) ) (рис. 3 8). Использование ацетилировашюго по боковым, гидроксильньш группам ПЭГ-6000 было технически.затруднено тем, что в ходе измерения активности в полимерной: молекуле происходил гидролиз сложноэфирных связей в боковых радикалах: При этом,. во-первых, изменялась вязкость раствора, а во-вторых, pHj что приводило к большому разбросу при измерении каталитических параметров: При: использовании глицерина в качестве: вискогена зависимости- получались -нелинейные, т.е., помимо повышения вязкости,, какой-то фактор вносил, дополнительный: вклад в снижение: кса1 и к л1Кт.. Наблюдаемое значение Кт. и для нативного фермента, и для мутантных, вариантов сильно увеличивается при росте: концентрации. вискогена.
Было высказано предположение, что молекула глицерина за счет своего: маленького размера; может, проникать в активный центр: и специфически взаимодействовать с РРазой, что приводит к.нелинейности полученных графиков и к. невозможности рассчитать необходимые величины (рис; 38). При использовании глюкозы полученные зависимости носили линейный характер (рис. 39). Согласно теории [101], если конформационные изменения экспонированных структурных элементов не вносят вклад в скорость катализа, то измеряемые параметры не зависят от вязкости, и тангенс угла наклона прямой равен 0. Это происходит, например, когда скорость-лимитирующей стадией является собственно химическая стадия. Противоположный случай, тангенс угла наклона равный 1, наблюдается, если реакция контролируется диффузионными процессами, например, диффузией высокомолекулярного субстрата или продукта. Для нативной РРазы тангенс угла наклона принимает промежуточное значение (табл. 8). Для параметра кса tgct=0,36. Это означает, что скорость-лимитирующая стадия, уход продуктов, довольно «чувствительна» к одному или нескольким конформационным переходам экспонированных элементов. Другими словами, какие-либо структурные перестройки, сопровождающиеся движением экспонированных элементов и необходимые для катализа, происходят в той же временной шкале, что и каталитическая реакция. Для- мутантных вариантов GlylOOAIa. и GlyI47Val значения: тангенса, угла наклона для параметра 1/ а( несколько снижаются (табл. 8). Отсутствие достаточного количества данных в литературе не позволяет судить, насколько серьезными являются! наблюдаемые. отличия;. Для=варианта. Gly 147Val наблюдается: снижение тангенса. угла: наклона почти вдвое по сравнению с нативной: РРазой.Можно предположить, что это значительное, снижение чувствительности: параметра: кс к: вязкости раствора; Полученный результат позволяет предположить,.что в нативной РРазе описанные вьпде: перестройки, включающие петлю III; дают больший вклад в скорость-л имитирующую стадию, чем перестройки петли II. В мугантиых. РРазах тангенс угла, наклона: не. достигает нулевого значения; т.е.. помимо перестроек петель: \\. и Ш, в скорость-лимитирующую; стадию, вносят большой; вклад смещения; каких-либо; еще: доступных растворителю структурных элементов. Не исключено1 также, что для катализа важным; типом; информационных: изменений: является возможность, «скручивания»-полипептидной, цепи; а не ее смещения. Именно для «скручивания», т.е. изменения двугранных: углов р тр. особенно важно присутствие остатков глицина. В1 литературе отсутствуют данные о том, насколько чувствительным может быть подобное изменение конформации к изменению вязкости раствора, поскольку «скручивание», по-видимому., не приводит к сильному изменению контактове растворителем.
