Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосома осуществляет синтез белков во всех клетках, считывая информацию о последовательности аминокислот с матричной РНК. Этот процесс называется трансляцией. Уровень базовой трансляции в клетке может меняться в зависимости от условий окружающей среды, при этом рибосома участвует в регуляции экспрессии генов с помощью множества специфических механизмов. Регуляция трансляции вносит свой вклад в адаптацию клетки к внешним условиям. Для регуляции экспрессии генов, рибосомы бактерий взаимодействуют с РНК-полимеразой, с различными белковыми факторами, низкомолекулярными веществами.
Функциональные центры рибосомы состоят преимущественно из остатков РНК. Во всех организмах рибосомные РНК содержат модифицированные нуклеотиды: псевдоуридин и нуклеотиды, метилированные по различным положениям гетероциклического основания или по 2' положению рибозы. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы и псевдоуридинсинтазы, каждая из которых специфична для одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Функция некоторых модифицированных нуклеотидов заключается в обеспечении устойчивости бактерий к антибиотикам за счет изменения участка связывания антибиотика в рибосоме. Функция модифицированных нуклеотидов в рРНК Escherichia coli, не придающих клетке устойчивость к антибиотикам, изучена слабо. При делециях генов модифицирующих ферментов в той или иной степени наблюдается снижение скорости роста клеток по сравнению с клетками дикого типа. Ни одна из модификаций рРНК не обеспечивает работу базовых стадий трансляции. На данный момент модифицированным нуклеотидам рРНК приписывают роль в инициации трансляции, созреванию и сборке рРНК, поддержанию структуры рибосомы, регуляции трансляции при определенных условиях.
Таким образом, изучение функциональной роли посттранскрипционных модификаций рРНК важно как для разработки подходов для создания новых антибиотиков, так и для понимания фундаментальных аспектов работы рибосомы. В данной работе мы использовали штамм с двойной делецией генов rsmD, rsmB, для которого характерно отсутствие метилирования G966/C967 в 16S рРНК. Это позволило описать влияние метилирования G966/C967 на жизнедеятельность бактерии Escherichia coli, а также изучить функционирование рибосом, лишенных этих модификаций, на различных этапах трансляции.
Цель работы.
Исследовать влияние модифицированных нуклеотидов m G966/m С967 16S рРНК на жизнеспособность бактерии Escherichia coli в различных условиях.
Изучить роль модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 16S рРНК в регуляции экспрессии генов бактерии Escherichia coli.
Выявить стадии трансляции, для которых важно наличие модифицированных нуклеотидов m2G966/m5C967 16S рРНК.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы был создан штамм, несущий двойную делецию генов RsmD и RsmB метилтрансфераз. Было подтверждено отсутствие модификаций G966/C967 16S рРНК в полученном ArsmBIArsmD штамме. Рибосомы мутантного типа были охарактеризованы с помощью различных тестов in vivo и in vitro. Была исследована выживаемость клеток ArsmBIArsmD штамма по сравнению с клетками дикого типа при различных условиях. Холодочувствительный фенотип ArsmB/ArsmD штамма свидетельствует о необходимости модификаций рРНК для адаптации клетки к пониженной температуре. Это подтверждалось существенным
замедлением перехода к логарифмической фазе роста клеток в отсутствие модификации G966/C967 при дополнительной нагрузке на аппарат трансляции.
Уровень синтеза белка во многом определяется эффективностью инициации трансляции его мРНК. Эффективность инициации во многом определяется стабильностью 70S инициаторного комплекса. Известно, что ряд метилированных нуклеотидов 16S рРНК участвуют в отборе инициаторной fMet-TPHKf е и AUG код она мРНК. Однако в литературе отсутствуют данные о молекулярных механизмах, посредством которых модифицированные нуклеотиды 16S рРНК влияют на инициацию трансляции. В данной работе было показано, что отсутствие m G966/m С967 модификаций в 16S рРНК приводит к пониженной эффективности инициации с неканонических инициаторных кодонов in vivo.
Кроме того, было обнаружено, что метилирование G966/C967 увеличивает эффективность связывания инициаторной тРНК в Р-участок 30S субчастицы при образовании 30S и 70S инициаторных комплексов in vitro. Более явно эффект проявлялся при наличии неканонического AUU инициаторного кодона в мРНК. Полученные результаты позволяют детально описать механизм влияния метилирования G966/C967 на инициацию трансляции.
На примере метилирования G966/C967 впервые было показано участие метилирования рРНК в регуляции экспрессии генов. В данной работе были созданы репортерные конструкции на основе генов люцифераз flue и rluc. С помощью данных конструкций, а также сравнительного протеомного анализа штаммов дикого и мутантного типов было показано, что в ArsmB/ArsmD штамме происходит индукция триптофанового оперона из-за нарушений в механизме аттенюации транскрипции. Это существенно расширяет представления о роли метилирования рРНК в регуляции экспрессии генов.
Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ имени М.В, Ломоносова; докладывали на конференциях: XIV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 11-14, 2007; XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 8 - 12, 2008; международная конференция «Рибосомы» 2010. Орвието, Италия. Май 3-7, 2010; международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Москва, Россия. Ноябрь 17-19, 2010; 16-ая ежегодная конференция «РНК». Киото, Япония. Июнь 14-18, 2011; международный 36 конгресс ФЕБС «Биохимия для будущей медицины». Турин, Италия. Июнь 25-30, 2011; международная конференция ЭМБО «Синтез белка и контроль трансляции». Хайдельберг, Германия. Сентябрь 7-11, 2011.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 68 рисунками. Библиографический указатель включает 157 цитированных работ.
