Введение к работе
Актуальность проблемы. Биосинтез белка во всех живых организмах происходит на рибосомах. Рибосома представляет собой сложный рибонуклеопротеид, состоящий из двух субчастиц - большой и малой. В состав прокариотической рибосомы входит три молекулы РНК и более 50 белков. Помимо самой рибосомы в синтезе полипептидной цепи участвуют белковые факторы, причем некоторые из них обладают ОТРазной активностью, которая находится под контролем функционального состояния рибосомы.
Рибосома содержит три участка связывания тРНК (А-, Р- и Е-) и три функциональных центра: декодирующий, пептидилтрансферазный и центр связывания факторов элонгации, включающий в себя сарцин-рициновую петлю (SRL) и центр, ассоциированный с ОТРазной активностью факторов элонгации (GAC).
Для осуществления биосинтеза белка необходима четкая координация всех функционально важных участков рибосомы и взаимодействующих с ней факторов трансляции. Благодаря такой сложной организации белок-синтезирующего аппарата он является одной из важнейших мишеней для действия антибиотиков. Ключевую роль в процессе трансляции играют фактор элонгации Tu (EF-Tu) и фактор элонгации G (EF-G). Эти белки необходимы в течение всего процесса трансляции: EF-Tu доставляет аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы, a EF-G катализирует процесс транслокации (согласованное перемещение двух тРНК и мРНК) после пептидилтрансферазной реакции. Несмотря на большой прогресс в области биохимических, биофизических и структурных исследований рибосомы и ее комплексов, многие аспекты работы белок-синтезирующего аппарата требуют дальнейшего изучения. Большинство открытых вопросов связано именно с изучением взаимодействия факторов элонгации с рибосомой.
В данной работе при помощи сайт-направленного мутагенеза спирали 42 23 S рРНК моделировали движение GAC, наблюдаемое в разных функциональных комплексах рибосомы и исследовали влияние этого движения на функционирование EF-G и EF-Tu. Кроме того, в данной работе исследовали роль нуклеотидов U2492, С2556 и С2573 23S рРНК в доставке аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы в составе комплекса с EF-Tu и GTP. Эти нуклеотиды, согласно компьютерной симуляции этого процесса, обеспечивают паузу в аккомодации аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы.
Цель работы.
Исследовать влияние конформации GAC на работу факторов элонгации трансляции Escherichia coli.
Выяснить роль нуклеотидов U2492, С2556 и С2573 в аккомодации аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В ходе данной работе при помощи сайт-направленного мутагенеза получены рибосомы Е. coli, несущие делецию пары нуклеотидов CT030/G1124 (AC1030/G1124) и вставку дополнительной пары нуклеотидов (InsCT030/G1124) в основание спирали 42 23S рРНК, а также рибосомы, несущие мутации UUU2491-3UC, А2573, А2572, A2572U и С2573А в 23 S рРНК. Мутации 23 S рРНК, описанные в данной работе, не были ранее упомянуты в литературе. Рибосомы с мутациями были охарактеризованы с помощью различных тестов in vivo и in vitro.
Мутации ACT030/G1124 и InsCT030/G1124 имитировали движение GAC, наблюдаемое в разных функциональных комплексах рибосомы. Было обнаружено, что вставка пары нуклеотидов сказалась на функционировании EF-G, но не повлияла на работу EF-Tu. Таким образом, была сформулирована модель селекции факторов элонгации рибосомой в зависимости от ее функционального состояния. Открытая
конформация GAC соответствует претранслокационному комплексу, способному связать EF-G, закрытая - посттранслокационному комплексу, готовому к связыванию EF-Tu. Для быстрого и точного синтеза белка в процессе трансляции должна осуществляться координация работы всех функциональных центров рибосомы. В связи с этим, ключевым вопросом является механизм обмена информацией между функциональными центрами рибосомы. Структурные исследования рибосом с мутацией InsC1030/G1124 методом химического пробинга позволили предположить, что сигнал от пептидилтрансферазного центра к центру связывания факторов элонгации может передаваться в виде конформационных изменений через спирали 39, 89, 42 и 91 при помощи мобильного элемента, состоящего из спиралей 96/97 23 S рРНК.
Еще одним важнейшим аспектом функционирования рибосомы является аккомодация аминоацил-тРНК в А-участок рибосомы, которая является одной из стадий, определяющих точность синтеза белка. Ранее опубликованная компьютерная модель, описывающая работу EF-Tu, выявила ряд универсально-консервативных нуклеотидов (U2492, С2573, А2572), формирующих «ворота» на пути З'-конца аминоацил-тРНК во время аккомодации. Эти «ворота» располагаются непосредственно перед пептидилтрансферазным центром и, предположительно, могут обеспечивать дополнительную паузу для диссоциации комплекса аминоацил-тРНК и рибосомы в случае несоответствия кодона и антикодона. В данной работе размер «ворот» варьировали при помощи сайт-направленного мутагенеза нуклеотидов, их формирующих или находящиеся в непосредственной близости от них. Исследование аккомодации аминоацил-тРНК в А-участок рибосом, несущих мутации UUU2491-3UC, А2573, А2572, A2572U и С2573А, при помощи методов быстрой кинетики показало, что нуклеотиды, образующие «ворота», не важны для скорости аккомодации аминоацил-тРНК. В ходе данной работы была найдена мутация UUU2491-3UC в спирали 89 23 S рРНК, ингибирующая пептидилтрансферазную активность рибосомы, если субстратом в А-участке является как пуромицин, так и аминоацил-тРНК. При этом рибосомы с такой мутацией сохраняли способность связывать tPFIK в А- и Р- участки.
Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, позволяющие по-новому рассмотреть функционирование 23 S рРНК, в особенности, взаимодействие пептидилтрансферазного центра и участка связывания факторов элонгации.
Комплекс in vivo и in vitro тестов, использованный в данной работе для изучения структурно-функциональных особенностей рибосом с мутациями, может быть с успехом применен для изучения многих других рибонуклеопротеидных комплексов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: международной конференции «tPFIK-2005», Бангалор, Индия, 2-7 декабря 2005 г.; международной конференции «РНК-2006», Сиэтл, США, 20-25 июня, 2006 г.; 8-й международной конференции по молекулярной биологии института им. Энгельгардта «РНК-белковые взаимодействия», пансионат Буран, Московская обл., Россия, 19-24 августа 2006 г.; международном симпозиуме Медицинского института Говарда Хьюза, Эшберн, США, 26-29 сентября 2006 г.; международной конференции «Рибосомы: форма и функция», Северный Фальмут, США, 3-8 июня 2007 г.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы и выводы. Материал иллюстрирован 43 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель включает 198 цитированных работ.
