Введение к работе
Актуальность проблемы. Основной принцип взаимодействия нуклеиновых кислот - принцип комплементарности - положен в основу подхода для направленной модификации нуклеиновых кислот, предложенного Н.И.Гриневой и названного комплементарно адресованной модификацией. Благодаря многочисленным интересным возможностям, открываемым этим подходом, включая направленное воздействие на внутриклеточные процессы, а также благодаря успехам в области олигонуклеогидного синтеза, метод комплементарно адресованной (сайт-направленной) модификации привлекает в последние годы все Возрастающее внимание. В основу этого подхода положены два процесса: первый - реакционноспособЕое производное олигонуклеотида (адреса), комплементарного определенному участку молекулы нуклеиновой кислоты (матрицы), образует с этим участком специфический комплекс и таким образом направляет действие (адресует) ре-акционяоспособной части молекулы; второй - непосредственно химическая реакция функциональной части реагента (алкилирование, фотомодификация, расщепление) с каким-либо основанием вблизи этого участка. Таким образом, комллементационная точность взаимодействия является<определяющей для успешной сайт-направленной модификации молекулы нуклеиновой кислоты.
Первые работы по сайт-направленной модификации, выполненные под руководством Н.И.Гриневой, продемонстрировали высокую эффективность реакции в комплексе на примере алкилирования I6S+23S рРНК е. сої і бензйлиденовнми производными олигоаденилатов, а данные по локализации точек модификации тРНК >СШ)С1 и circh2nh- производными олигонуклеотидов показали, что комплементационная точность узнавания несовершенна и может приводить к множественной модификации нуклеиновых кислот.
Наиболее простыми моделями для изучения процесса сайт-направленной модификации оказались фрагменты одноцепочечноЯ ДНК с малорыраженной пространственной структурой или отдельные оли-голезсксирибонуклеотиды. С использованием этих моделей в качестве матриц для комплементарно адресованной модификации было продемонстрировано высокоселективное алкилирование нуклеотидных остатков вблизи участков связывания реагентов, образующих с ним совершенные комплексы. На основании этого можно было полагать, что несовершенная комплементационная точность является характерной чертей комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот, обладающих достаточно сложной пространственной организацией.
Реакционноспособные производные олигонуклеотидов широко используются в настоящее время не только для сайт-направленной модификации нуклеиновых кислот , но и в качестве зондов для молекулярной гибридизаци, ингибиторов трансляции и транскрипции нуклеиновых кислот in vitro и in vivo. Кроме того, производив олигонуклеотидов начинают приобретать все большее значение как диагностические и лекарственные средства. В связи с этим, компле-ментавдонная точность взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с участком связывания становится чрезвычайно важной проблемой сайт-направленного воздействия на нуклеиновые кислоты.
Цель работы. Целью работы является изучение комплементацион-ной точности сайт-направленного воздействия на нуклеиновую кислоту с известной первичной структурой, обладающей достаточно сложной пространственной структурой; оценка уровня адресованнос-ти, а также факторов, позволяющих повысить комплементационную точность взаимодействия. В качестве матрицы была выбрана I6S рРНК Escherichia coli И четыре реагента dipCCTACGGTT>rA>CKRCl (I), d(pACCTTGTT)rA>CHKCl (II). dtpTTACGACT )rTJ>CHECl (III),
d(pTTTGCTCCCOrA>CKRCi (iv), комплементарные участкам I6S pFHK, различавшимся по характеру участия в формировании вторичной структуры молекулы I6S РНК.
Научная новизна. Впервые на примере сайт-направленного алки-лирования бензилиденовыми производными дезоксирибоолигонуклео-тидов высокомолекулярной РНК, обладающей ярко выраженной пространственной структурой, идентифицированы все комплексы, в составе которых протекает алкилирование РНК. Оценена комплементалион-ная точность модификации и определены относительные стабильности несовершенных комплексов, в которых протекает эффективное алкилирование матрицы. Кроме того, исследовано влияние термодинамических и кинетических факторов, а также стабилизирующих комплекс олигонуклеотидов-эффекторов на специфичность сайт-направленного алкилирования. Впервые показана принципиальная возможность расщепления молекулы РЖ в составе ковалентних аддуктов - продуктов сайт-направленной модификации - с помощью РНКазы Н. Показана принципиальная возможность использования программы контекстного анализа для предсказания сайтов модификации.
Практическая ценность. Предложен метод расщепления РНК в составе ковалентних аддуктов, образующихся в результате комплемен-
тарно адресованной модификации, который может быть эффективно использован для сайт-направленного расщепления молекулы РНК по всем участкам связывания, "адресованного" реагента. Разработан подход к идентификации участков взаимодействия РНК с реакционно-способными производными олигонуклеотидов, который в настоящее время интенсивно используется для идентификации участков алкили-рования I8s рРНК в составе 80S рибосом человека аналогами мРНК. Апробация работы. Результаты работы докладывались на 20М (Новосибирск, 1985 г.), Зем (Тбилиси, 198?) и 40М(Киев, 1989) рабочих совещаниях "Органическая химия НК-дуплексов." и на международном рабочем совещании "Perspectives in Therapeutic and diagnostic application of oligonucleotide derivatives ", (Новосибирск,1988). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 221 странице машинописного текста, состоит из трех глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 267 наименований и содержит 28 рисунков и 16 таблиц.
