Введение к работе
Актуальность проблемы. Во всех живых организмах молекулы РНК различных типов подвергаются посттранскрипционным модификациям с помощью огромного количества различных ферментов. Только к концу прошлого века количество известных природных модификаций четырех основных рибонуклеотидов превысило сотню.
Среди всех классов РНК транспортные РНК наиболее подвержены различным модификациям. Около 11%, 14% и 17% всех нуклеотидов тРНК являются модифицированными в Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae и в клетке животных, соответственно. Эти модификации обеспечивают химическое и функциональное разнообразие тРНК, а также улучшают их структурную стабильность. Жизненную необходимость данных модификаций доказывает очень большое количество генов в геноме, кодирующих ферменты, которые ответственны за них: в некоторых бактериальных геномах представленность таких генов достигает 1%. Метилирование, одна из самых распространенных модификаций, способствует правильному сворачиванию тРНК, улучшая не только процесс аминоацилирования определенными аминоацил-тРНК синтетазами, но и специфичность декодирования в процессе трансляции.
Рибосомная РНК также содержит множество модификаций, сосредоточенных преимущественно в функционально значимых регионах. 16S рРНК E.coli насчитывает 11, а 23S рРНК E.coli - 25 различных посттранскрипционно модифицированных нуклеотидов. Подавляющее большинство модификаций этих нуклеотидов составляют псевдоуридинилирование и метилирование. Известно, что некоторые модификации в рибосомной РНК могут участвовать в механизмах устойчивости клетки к антибиотикам и в процессах взаимодействия рибосомы с растущей пептидной цепью, повышать эффективность связывания рибосомы с аминоацилированной тРНК, способствовать ассоциации субчастиц, а также принимать участие во многих других жизненно важных для клетки процессах.
Функции многих модифицированных нуклеотидов бактериальных РНК до сих пор остаются неясными, и зачастую это связано с отсутствием каких-либо данных о ферментах, осуществляющих их. Знание о генах, кодирующих тот или иной фермент, дает возможность «включать» и «выключать» в клетке соответствующую модификацию, и такие манипуляции позволяют собрать исчерпывающую информацию о ее функции.
Альтернативный способ изучения влияния модифицированных нуклеотидов на функционирование рибосомы заключается в мутагенезе модифицируемых остатков.
Мутации нуклеотида-мишени, как правило, приводят к отсутствию модификации. Такие мутации часто летальны для клетки. Гены мутантных рРНК можно экспрессировать только одновременно с генами рРНК дикого типа. В связи с этим, для дальнейшего изучения свойств рибосом, несущих летальные мутации в рРНК, возникает необходимость создать способ выделения рибосом, несущих в себе соответствующую летальную мутацию из смеси с рибосомами дикого типа.
В данной работе было проведено исследование функций трех гипотетических метилтрансфераз Е. coli: YibK, Yaffi и YfiC, а также разработан метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосомы . coli.
Цель работы.
Проверить, являются ли белки YibK, Yaffi и YfiC Е. coli метилтрансферазами и если являются, то установить субстраты для них;
Определить функциональную роль найденных модифицированных нуклеотидов РНК;
Разработать способ выделения 30S субчастиц рибосом Е. coli методом аффинной хроматографии;
Проверить, в какой степени введение аффинного довеска в 16S рРНК влияет на функциональную активность 30S субчастиц in vivo и in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы было показано, что белки YibK и Yaffi являются SAM-зависимыми метилтрансферазами и метилируют рРНК Е. coli в составе собранных субчастиц, выделенных как из нокаутных штаммов, так и из штамма дикого типа. Это может означать, что и YibK, и Yaffi активны в особых для клетки условиях, а при культивировании клеток в богатой среде при 37С модификации рРНК, за которые отвечают эти ферменты, отсутствуют. Установлено, что и YibK, и Yaffi катализируют перенос метильной группы на 16S рРНК в составе 30S субчастицы рибосомы. Предположение о вероятной метилирующей активности хотя бы одной из исследуемых метилтрансфераз в отношении нуклеотида m G1516 16S рРНК было опровергнуто.
Установлено, что метилтрансфераза YfiC модифицирует только малые РНК, выделенные из экстракта клеток штамма AyfiC. В Е. coli осталось только несколько модифицированных нуклеотидов тРНК, для которых соответствующие ферменты до сих пор не идентифицированы. Подтверждено, что среди малых РНК только тРНКі подвергается метилированию белком YfiC in vitro. Было известно, что тРНКі а содержит
модифицированный нуклеотид m A3 7, для которого не было описано модифицирующего фермента. На полученных путем транскрипции in vitro тРНК было показано, что тРНКз г, содержащая аналогичную m A37 модификацию наряду с другим объемным заместителем на N6 атоме азота, не является субстратом для YfiC. Таким образом, мы показали, что YfiC не может участвовать в формировании посттранскрипционной модификации m t A3 7 в тРНКз г, а исследуемая метилтрансфераза метилирует только один субстрат в Е. coli: тРНКі а. Кроме того, методом MALDI MS было окончательно установлено и подтверждено, что модификация тРНКі а, осуществляемая метилтрансферазой YfiC, представляет собой метилирование экзоциклического атома азота нуклеотида А37.
Было установлено, что для образования модификации m A37 в тРНКі а в клетке достаточно только гена yfiC, а его расположение в геномном контексте не играет принципиальной роли. Путем MALDI MS анализа тРНКі а из штамма AyfiC, метилированной in vitro, показали, что наличие только белка YfiC необходимо и достаточно для осуществления модификации.
Показано, что в богатых и бедных средах, в диапазоне от 30 до 42С скорость роста штаммов дикого типа и штамма AyfiC практически не различаются, и это означает, что модификация m A37 не дает конкурентных преимуществ в стандартных для клетки условиях.
Исследование способности клеток к выживанию в стрессовых условиях показало, что наличие метилирования m A37 в тРНКі а повышает жизнеспособность клеток при осмотическом и окислительном стрессах. Первое, по всей видимости, связано со способностью тРНК, обладающей дополнительной гидрофобной группой, более эффективно связываться с рибосомой в условиях повышения ионной силы внутри бактериальной клетки при осмотическом стрессе. Окислительный стресс, по всей видимости, приводит к ужесточению требований к эффективности взаимодействий в процессе трансляции, в связи с чем отсутствие метилирования нуклеотида A37 в тРНКі понижает жизнеспособность клетки в данных условиях. Вероятно, одной из функций модификации m A37 в тРНКі а является устойчивость бактериальной клетки к осмотическому и окислительному стрессам.
Кроме установления субстратов для трех перечисленных метилтрансфераз Е. coli, также был разработан метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосом, содержащих аптамер к стрептавидину в спирали 33а 16S рРНК. Это позволяет исследовать влияние различных мутаций на функцию и структуру рибосомы, в том числе и содержащих
мутации модифицируемых нуклеотидов. Различными методами было показано, что 30S субчастицы, несущие аптамер, не нарушают функциональную активность рибосомы in vitro и in vivo. Метод аффинного выделения 30S субчастиц рибосомы с помощью стрептавидин-сефарозы является наиболее быстрым и эффективным среди всех известных на сегодняшний день методов выделения мутантных рибосомных субчастиц, а активность полученных рибосом сравнима с активностью рибосом дикого типа.
Известно, что большинство антибиотиков воздействует на рибосому, и механизм устойчивости к ним зачастую связан со способностью бактериальных ферментов метилировать некоторые нуклеотиды рРНК. Создание методологии поиска ферментов, отвечающих за данные модификации, может иметь важное практическое значение для разработки новых антибиотиков. Также важным будет создание простого и эффективного метода аффинного выделения рибосомных субчастиц. Он облегчит исследование свойств рибосом, несущих любую летальную мутацию.
Апробация работы. Материалы диссертации многократно обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова; докладывали на конференциях: XIV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 11-14, 2007; XV Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008» МГУ имени Ломоносова. Москва, Россия. Апрель 8 - 12, 2008; ЕМВО Conference Series on Protein Synthesis and Translational Control. Хайдельберг, Германия. Сентябрь 9-13, 2009; Ribosomes 2010. Орвието, Италия. Май 3-7, 2010
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 46 рисунками. Библиографический указатель включает 160 цитированных работ.
