Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Бактериальная трансляция
Последовательность Шайна-Дальгарно
Стартовый кодон
Элементы вторичной структуры мРНК
AU-богатые участки
Нуклеотидный состав мРНК
Полицистронные мРНК и реинициация
Обсуждение результатов
Создание двойной репортёрной конструкции
Влияние стартового кодона на эффективность трансляции
Зависимость эффективности трансляции от длины SD и расстояния между SD и стартовым кодоном
Влияние элементов вторичной структуры мРНК в области старта трансляции на ее эффективность
Инициация de novo и реинициация трансляции в случае близкорасположенных стартового и терминаторного кодонов
Роль A/U-богатых участков в трансляции моноцистронных и полицистронных мРНК
Высокопроизводительный метод определения механизма действия антибиотиков, основанный на использовании двойной репортёрной системы RFP/CER Материалы и методы
Выводы
Список литературы
- Последовательность Шайна-Дальгарно
- Нуклеотидный состав мРНК
- Зависимость эффективности трансляции от длины SD и расстояния между SD и стартовым кодоном
- Инициация de novo и реинициация трансляции в случае близкорасположенных стартового и терминаторного кодонов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Трансляция - центральный процесс в жизнедеятельности всех организмов, в ходе которого информация, закодированная в нуклеотидах мРНК, переводится в аминокислотную последовательность белка при помощи рибосомы. Согласно центральной догме молекулярной биологии мРНК отводится роль посредника между ДНК, несущей всю наследственную информацию, и рибосомой, превращающей эту информацию в белки. Роль мРНК не сводится лишь к передаче информации с ДНК на рибосому, мРНК принимает непосредственное участие в регуляции и определении уровня экспрессии гена. Отличительные черты бактериальной мРНК, такие как последовательность Шайна-Дальгарно (SD), различные стартовые кодоны, A/U-богатые участки, элементы вторичной структуры мРНК, набор используемых кодонов, организация генов в опероны заметно влияют на трансляцию. Сочетание регуляции на уровне транскрипции, в общем определяющей будет или не будет экспрессироваться данный ген, и регуляции на уровне трансляции, точно и тонко модулирующей уровень синтеза белка, позволяет для данного гена достичь оптимальной экспрессии.
Факторы, влияющие на трансляцию, начали изучаться очень давно, но по отдельности и в совершенно разных системах, что не позволяет сравнивать результаты между собой и оценивать относительный вклад различных элементов мРНК.
Изучение бактериальной трансляции особенно важно еще и потому, что около половины применяемых в настоящее время антибиотиков действуют на рибосому. Механизмы действия могут быть различными: некоторые антибиотики вызывают ошибки в ходе синтеза, другие замедляют скорость трансляции или нарушают структуру рибосомы. Определение механизма действия необходимо для создания лекарственного препарата, а также важно для понимания фундаментальных основ взаимодействия антибиотиков с рибосомой. Стандартный способ проверки антибактериальной активности заключается в измерении уровня ингибирования клеточного роста, но данный подход имеет несколько недостатков: во-первых, необходимы большие концентрации антибиотика, чтобы увидеть заметное снижение роста, а, во-вторых, при таком способе скрининга нельзя ничего сказать о механизме действия антибиотика. Методы для определения механизма существуют, но большинство из них требует in vitro экспериментов и выделения потенциальных мишеней антибиотиков из клетки, что делает их плохо применимыми для широкомасштабного поиска. Поэтому создание высокопроизводительно метода скрининга механизма действия антибиотиков, позволяющего проводить поиск in vivo, представляется крайне актуальным.
Цели работы:
-
Разработать систему для многофакторного анализа влияния элементов мРНК на эффективность трансляции Escherichia coli (E. coli), изучить с ее помощью роль основных элементов бактериальной мРНК в трансляции.
-
Разработать метод высокопроизводительного анализа механизма действия антибиотиков и использовать его для нахождения новых потенциальных антибиотиков с заданным механизмом действия.
Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе данной работы была разработана двойная репортёрная конструкция, основанная на генах двух флуоресцентных белков, позволяющая проводить многофакторный анализ влияния различных элементов мРНК на эффективность трансляции. При помощи данной конструкции впервые показано, что in vivo наибольшую относительную эффективность трансляции обеспечивает SD наибольшего размера (8 нуклеотидов), расположенная на максимально близком к стартовому кодону расстоянии, а для среднего расстояния от старта трансляции продемонстрировано существование оптимального значения длины SD, равное 6 нуклеотидам. Изучено влияние элементов вторичной структуры мРНК в области начала трансляции и обнаружено, что в некоторых положениях элементы вторичной структуры различной прочности оказывают противоположное влияние на эффективность трансляции. В отличие от трансляции моноцистронных мРНК, подробно исследованной во многих работах, регуляция трансляции полицистронных матриц мало изучена. Наша репортёрная конструкция позволила подробно изучить трансляцию бицистронной мРНК: оценить влияние SD, вторичных структур между генами и экспрессии первого гена в опероне на эффективность реинициации трансляции и инициации de novo. При перекрывании или близком расположении стартового и стоп-кодонов SD не настолько необходима для эффективной трансляции, как в случаях большего расстояния между генами одной матрицы или моноцистронных матриц. В ходе работы впервые детально изучено влияние A/U-богатых участков на трансляцию второго гена в опероне, а также обнаружена зависимость эффективности влияния A/U-богатых участков на трансляцию от нуклеотидного контекста участка, следующего за стартовым кодоном. Полученные результаты позволяют лучше понять и количественно оценить эффекты, оказываемые различными элементами мРНК на трансляцию.
Кроме фундаментальных исследований, разработанная система может быть применена и при поиске новых антибиотиков. Нами разработан метод, позволяющий детектировать in vivo присутствие веществ, вызывающих торможение трансляции, и проведен успешный поиск нового антибиотика, тормозящего трансляцию.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: «Chemistry in Molecular Biology», 16-20 декабря, г. Москва, Россия, 2011; «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины», 29-30 сентября, г. Москва, Россия, 2011; 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", 25-30 июня, г. Турин, Италия, 2011;
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 55 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 88 цитированных работ.
Последовательность Шайна-Дальгарно
Основываясь на данных рентгеноструктурного анализа, процесс инициации трансляции можно представить следующим образом. Сначала образуется контакт между SD и 16S рРНК, SD-aSD дуплекс взаимодействует с платформой 30S субчастицы и располагается рядом с рибосомным белком S2, а остальная часть мРНК остается свободной. Затем происходит синхронное ориентирование стартового кодона в Р-сайте и перестановка SD-aSD дуплекса к белку S18. В этот момент мРНК находится в напряженном состоянии. Сразу после инициации, когда один или несколько кодонов были транслированы, но взаимодействия между SD и рибосомой оставались незатронутыми, происходит одновременное движение всей молекулы мРНК в сторону 5 -конца и удлинение спирали с SD. Спираль SD снова оказывается рядом с белком S2, дальнейшая трансляция мРНК сопровождается постоянным вращением и движением в 3 -5 направлении и приводит к разрушению взаимодействия SD-aSD. В ходе трансляции 5 -конец мРНК уже не взаимодействует с этой рибосомой, а становится свободным для посадки новой (рис. 6 Б). Исходя из предложенной модели, можно предположить, что расстояние 11, наблюдаемое в случае матрицы, состоящее из U, соответствует «крайнему положению», при котором сохраняется SD-aSD дуплекс, дальнейшее продвижение рибосомы уже будет приводить к разрушению этого дуплекса, это стадия III (рис. 6Б), а не стадия І, в которой происходит связывание 30S субчастицы на мРНК. А расстояние 8, которое исходя из биоинформатических данных и in vivo экспериментов должно давать большую эффективность, хоть и является «напряженным», но снятие этого напряжение, возможно, и дает необходимый импульс к началу трансляции, первый же шаг который увеличит расстояние между Р-сайтом и SD до 11, и произойдет удлинение спирали SD, наблюдаемое в рентгеноструктурных экспериментах. Еще одно объяснение завышенного расстояния между SD и стартовым кодоном, полученное в рентгеноструктурном анализе по сравнению с бионформатическими и экспериментальными данными состоит в то, что структура комплекса рибосома-мРНК в случае матрицы с протяженным участком U похожа на рибосому не в инициаторном, а в элонгаторном состоянии, т.е. кодон UUU, находящийся Р-сайте в кристалле на момент инициации находился бы в А-сайте, и расстояние между SD и стартовым кодоном было 8, а не 11.
Кроме непосредственного влияния на эффективность трансляции длина SD может влиять и на количество мРНК, это было показано на уже упомянутых матрицах с длиной SD 10, 8 и 6 [12]. Сравнение результатов измерения активности Р-галактозидазы (уровень экспрессии) и измерения количества мРНК, показало что количество мРНК строго зависит от эффективности трансляции - снижение экспрессии приводит к снижению количества мРНК. Аналогичные эксперименты в штамме с частично инактивированной РНказой Е показали значительно меньшую зависимость количества мРНК от эффективности экспрессии, вероятно, это связано с тем, что не транслируемая мРНК в клетках подвергается быстрой деградации. Стабильность мРНК в первую очередь зависит от идущей трансляции, а не от стабильности комплекса между рибосомой и мРНК, так как SD длиной 10 должна была обеспечивать максимальную стабильность, но количество мРНК в этом случае заметно снижено. Расположение на 5 -конце шпильки еще сильнее снижало уровень экспрессии и также приводило к снижению количества мРНК, хотя такая шпилька могла бы наоборот защищать мРНК от действия РНказы Е. В штамме с частично инактивированной РНказой Е количество мРНК со шпилькой на 5 -конце было не сильно снижено, значит, такая структура может нормально транскрибироваться, и пониженное количество мРНК опять связано с низкой эффективностью инициации трансляции.
Взаимодействия между 5 -концом мРНК и З -концом 16S рРНК были подробно изучены при помощи внесения случайных мутаций (любой нуклеотид кроме того который уже был) в aSD (3 -CCUCC-5 ) и в SD (5 -GGAGG-3 ) гена устойчивости к антибиотику хлорамфениколу и отбора выживающих клеток, в которых сочетания новой aSD и новой SD дают достаточный для приобретения устойчивости уровень синтеза белка [13]. Неожиданно оказалось, что распределение нуклеотидов в aSD носит не случайный характер (рис. 7). , 1 211 38 3г 38 46 00 " Ґ УЗ Ь 38 1 00 SD5- Auc Acu CUG Auu UAC aSD з-u GAu V3UA GAO UAu GAU yj 6 13 13 63
Распределение нуклеотидов на каждой из позиций, подвергнутых мутагенезу Вероятность нахождения буквы в данной позиции отражена в ее размере Расчет значения %2 был использован для проверки нулевой гипотезы, заключающейся в том, что нуклеотиды распределяются случайно Р 0 05, Р 0 01, Р 0 001
Можно было бы ожидать, что самым распространенным сочетанием SD-aSD, будет SD-5 -CCUCC-3 и aSD-3 -GGAGG-5 , так как энергия взаимодействия останется такой же как и была. Но, во-первых, оказалось, что только 23% из наблюдаемой трансляционной активности мутантных мРНК можно объяснить силой взаимодействия SD-aSD, а, во-вторых, частота встречаемости С в SD не выше, чем у А или U. Были обнаружены корреляции между заменами нуклеотидов в определенных положениях как для SD, так и для aSD. Для SD обнаружена связь только между 3 и 4 нуклеотидами, это интересно, так как, несмотря на наличие значительной корреляции между ними, никакого предпочтения у нуклеотида стоящего в 3 положении самого по себе нет. Для aSD было обнаружено, что три позиции (2, 3 и 4) влияют на выбор нуклеотидов в других позициях. Анализ последовательностей ковариантных пар не выявил отбора против появления комплементарных пар, значит вторичная структура в aSD не связана с наблюдаемыми ковариациями. Было проанализировано пять случаев сочетания SD-aSD, приводящих к летальному фенотипу (значит экспрессия происходит на очень низком уровне или не происходит вовсе), оказалось, что во всех них на 3 месте в aSD стоит С. Возможно это связано с тем фактом, что С в этом положении делает эффективным трансляцию некоторых других генов Е. coli, чьи продукты и приводят к летальному фенотипу. Анализ 5 -концов генов Е. coli показал наличие четырех генов с участками могущими служить в качестве SD для рибосом с летальным вариантом aSD, это гены sdhA, jhuD, супТ и rimK. Первые три кодируют мембранные белки, a rimK модифицирует рибосомный белок S6. Возможно, повышение уровня трансляции данных белков оказывается губительным для клетки.
Располагаясь на 5 -конце от стартового ко дона SD значительно повышает эффективность трансляции, но подобные последовательности могут быть обнаружены и внутри кодирующих областей, какая им отводится роль до конца остается неизвестным. Биоинформатический поиск SD внутри кодирующих рамок показал, что такие последовательности встречаются и располагаются вблизи кластеров кодонов с низким адаптационным индексом [14]. Оказалось, что можно обнаружить разницу для генов с высоким и низким уровнем экспрессии в расстоянии, разделяющем SD и несколько идущих подряд редких кодонов, для генов с высоким уровнем экспрессии SD расположены ближе к кластерам редких кодонов. Позитивная роль SD в этом случае может быть объяснена стабилизацией взаимодействий между мРНК и рибосомой в момент паузы в трансляции из-за отсутствия подходящих тРНК. Данное предположение нашло частичное экспериментальное подтверждение благодаря составлению «рибосомного профиля», представляющего собой данные о распределении плотности рибосом по всем мРНК [15]. Паузы в трансляции происходят как раз в местах с внутренними SD, эти участки могут регулировать скорость трансляции, давая возможность белку правильно сворачиваться, или, обеспечивая возможность ко-трансляционного процессинга белка. На примере гена ompF (рис. 8 А) видно, что плотность рибосом на мРНК заметно возрастает, когда А-сайт находится через 8-11 нуклеотидов после последовательности похожей на SD. Синонимичная замена SD (GGUGGUG) в ompF дикого типа на последовательность (GGCGGCG) с меньшим сродством к aSD приводит к соответствующему снижению торможения рибосомы. Несмотря на присутствие SD внутри кодирующих областей, их количество меньше, чем могло бы быть в случае их случайного распределения. Если рассмотреть встречаемость пар триплетов похожих на SD, то видно, что чем больше они напоминают SD, тем реже встречаются. Например, пара GGCGGC (Gly-Gly) не похожая на SD встречается часто, а пара GGAGGU (Gly-Gly) близкая к SD встречается крайне редко (рис. 8 Б).
Нуклеотидный состав мРНК
Эффективность трансляции генов, находящихся в одном опероне, может быть связана. Например, для оперона trpEDCBA, было показано, что для эффективной трансляции trpD необходима эффективная трансляция и терминация trpE -стартовый и стоп-кодон этих белков перекрываются (UGAUG) [58]. Для искусственной системы, содержащей ген интерферона альфа, расположенный после гена белка оболочки фага MS2, было показано, что несмотря на наличие длиной SD (AGGAGGU) перед геном интерферона, в случае отсутствия трансляция белка оболочки фага никакой трансляции интерферона не происходило [59]. Причина была в том, что SD интерферона участвует в образовании прочной вторичной структуры, которая судя по всему ингибирует de novo инициацию трансляции, внесение мутации в эту структуру делает трансляцию интерферона возможной и в отсутствии трансляции белка оболочки. Влияние рибосомы, транслирующей первый ген, на вторичную структуру второго гена, вероятно, один из основных механизмов, связывающий трансляцию генов в полицистроннои матрице. Удаление SD перед геном интерферона снизило эффективность его трансляции на порядок, а удаление стоп-кодона от стартового на расстояние от 5 до 30 нуклеотидов уменьшило экспрессию примерно в 3 раза. Стоит отметить, что в использованной искусственной системе реинициация происходила на очень низком уровне, экспрессия второго гена составляла примерно 2% от уровня экспрессии первого, тем не менее можно сделать вывод, что на эффективность реинициации влияет как расстояние между терминаторным и стартовым кодоном, так и наличие SD перед вторым геном.
Анализ всех участков, предшествующих перекрыванию стартового и терминаторного кодонов (UAAUG и UGAUG) для Е. coli, выявил наличие консервативной SD перед сайтами реинициации, что косвенно свидетельствует об участии SD в данном процессе (рис. 31 А) [60]. Экспериментальный поиск элементов мРНК (кроме SD), увеличивающих эффективность реинициации при помощи добавления перед участками перекрывания случайных последовательностей (не содержащих G) не выявил строго консервативных элементов (рис. 31 Б), но были обнаружены новые последовательности, обеспечивающие реинициацию, и для трех из них были найдены схожие последовательности в геноме Е. coli.
Консервативность участков, предшествующих перекрыванию стартового и стоп-кодонов (UAAUG и UGAUG), высота букв отражает частоту встречаемости нуклеотида в данной позиции. А. Анализ всех возможных случаев перекрывания UAAUG и UGAUG из генома Е. coli. В. Анализ последовательностей, полученных в экспериментальном поиске элементов мРНК, увеличивающих эффективность реинициации.
Отличительная особенность эукариотической трансляции - это возможность сканирования 40S субчастицей мРНК в поисках оптимального стартового кодона, возможно, что при реинициации бактериальной трансляции тоже происходит если не сканирование, то, по крайней мере, движение рибосомы (или 30S субчастицы) по мРНК (в любую сторону) к ближайшему стартовому кодону. Впервые такая модель была предложена на основе экспериментов по добавлению дополнительно стартового кодона в промежуток между исходными терминаторным и стартовым ко донами [61]. Отрезок на котором должны располагаться терминаторный и стартовый кодон не должен превышать 40 нуклеотидов, предпочтительно расположение стартового после стоп-кодона, судя по всему, при таком «сканировании» вперед рибосоме двигаться легче, чем назад, так как при движении назад ей мешают идущие за ней рибосомы, так же на эффективность процесса влияет наличие SD и вторичных структур.
Существование оптимального расстояния между стартовым и стоп-кодоном для эффективной реинициации были показано на примере еще одного гена - гена щелочной фосфатазы (phoA) [62]. Были протестированы различные расстояния, и оказалось, что если расстояние больше чем 7 кодонов, то реинициация не происходит, а оптимальное расстояние это 5. Во всех случаях перед стартовым кодоном второго гена отсутствовала SD и инициация трансляции de novo не происходила. Различные стоп-кодоны (UAA, UGA и UAG) на расстоянии в 5 кодонов дают одинаковую эффективность реинициации трансляции. Внесение дополнительных нуклеотидов после стоп-кодона также не приводит к изменениям в эффективности, это значит, что после терминация рибосома сканирует мРНК по одному нуклеотиду, а не по триплетам, в поисках стартового кодона. Снижение количества белка RRF, ответственного за разборку 70S рибосомы, не сказалось на эффективности реинициации, это косвенно указывает на то, что сканирование в поисках нового стартового кодона, возможно, осуществляет сама 70S рибосома, а не 30S субчастица.
Зависимость реинициации от расстояние между стартовым и стоп-кодоном и от активности белка RRF была изучена и в полностью природной системе, в которой трансляция белка лизиса фага GA зависит от трансляции гена белка оболочки, расположенного перед ним таким образом, что их стартовый и стоп-кодон перекрываются (UAAUG) [63]. Увеличение расстояния между UAA и AUG, как и ожидалось, снижает эффективность трансляции второго гена: при расстоянии больше 30 нуклеотидов реинициация уже не происходит. Расстояние в 8 нуклеотидов - оптимально, эффективность реинициации такая же, как и в случае перекрывания кодонов. Расположение кодонов друг за другом UAAAUG, снижает эффективность реинициации примерно в 3 раза. Удаление SD перед первым геном, полностью выключало трансляцию второго, добавление SD перед вторым (при отсутствии первого) возвращало экспрессию белка лизиса на высокий уровень, эти результаты указывают на то, что в природе экспрессии этих двух белков тесно связаны друг с другом, для трансляции второго, необходима трансляция первого. Замена стартового или терминатарного кодонов (UGAUG или UAGUG) не приводила к изменению эффективности, а вот размещение терминаторного кодона через 4 нуклеотида после стартового снижало эффективность реинициации до нуля, рибосома после терминации трансляции первого гена не может пройти назад 4 нуклеотида, чтобы начать синтез второго. В этой природной системе эффективность реинициации была уже значительно выше чем в модельной [59] и составляла 25-30%. Как и в случае с phoA, инактивация RRF не увеличила экспрессию второго гена, возможно, это связано с тем, что RRF не может освободить рибосому с участка UAAUG, удаление AUG вновь возвращает RRF возможность высвобождать рибосому, по всей видимости, активность этого белка зависит от последовательности мРНК. Инактивация RRF приводила к тому, что образовывались укороченные с N-конца варианты второго белка, это значит, что в отсутствии RRF рибосома не узнает стартовый кодон AUG в составе UAAUG, а движется дальше по мРНК инициируя трансляцию случайно на кодонах, следующих за терминаторным.
Для эффективной реинициации оказались необходимы те же факторы, что и для инициации de novo, IF2, IF3 и инициаторная тРНК [63]. Было показано, что две уникальные особенности инициаторной тРНК, формилирование и связывание в Р-сайте, важны для реинициации. Увеличение экспрессии IF2 увеличивало эффективность реинициации. В то время как увеличение экспрессии IF3 приводило к значительному снижению эффективности реинициации. По мнению авторов, последнее указывает на то, что в реинициации принимает участие 30S субчастица, а не 70S рибосома, так как IF3 взаимодействует именно с 30S и занимает место, которое потом будет занимать 50S субчастица, поэтому взаимодействия между 70S и IF3 маловероятно (рис. 32).
Зависимость эффективности трансляции от длины SD и расстояния между SD и стартовым кодоном
Во всех случаях взаиморасположения стартового и стоп-кодонов от -4 и до 3 эффективность трансляции CER при присутствии SD и трансляции RFP в два раза выше, чем в случае моноцистронной мРНК. Выключение трансляции первого гена приводит к примерно двукратному падению сигнала во всех случаях. Замена стартового кодона в IF3 с AUU на AUG приводит к примерно четырехкратному увеличению сигнала, подтверждая предположение о том, что трансляция IF3 в клетках специально снижена и поставлена в зависимость от присутствия самого этого белка. Удаление SD приводит к снижению сигнала, но он все еще остается сравнительно большим, тогда как моноцистронная матрица без SD приводила к падению сигнала до уровня предела обнаружения. Без SD инициация de novo практически не происходит, и экспрессия CER в этом случае наблюдается благодаря реинициации трансляции. Присутствие SD, судя по всему, не настолько важно для реинициации, насколько необходимо для инициации de novo. Увеличение расстояние между генами до 20 нуклеотидов увеличивает зависимость экспрессии второго гена от присутствия SD, если рибосоме (скорее всего 30S субчастице) нужно пройти какое-то расстояние для реинициации, то SD помогает ей удержаться на мРНК, но если стартовый кодон на момент терминации находится внутри рибосомы, то SD играет куда меньшую роль. Интересно, что расположение стартового кодона сразу после стоп-кодона приводит к тому, что реинициация без SD становится настолько же неэффективной, как в случае расстояния 20. Возможно, из-за низкой эффективности трансляции в отсутствии SD, такое взаиморасположение стартового и стоп-кодонов редко встречается в геноме Е. coli.
Если сканирование с 5 -конца для бактериальной трансляции процесс очень маловероятный, то сканирование после стоп-кодона первого гена и до стартового кодона второго считается одним из основных механизмов реинициации. Скольжение рибосомы по мРНК необходимое для реинициации может быть затруднено из-за присутсвия вторичных структур между генами. Мы проверили это предположение, довольно прочная шпилька с энергией сворачивания -9 ккал/моль была помещена между стоп и старт-кодонами. В случае выключения трансляции первого гена наблюдается падение экспрессии второго более чем в три раза, что говорит о реализации инициации трансляции по механизму реинициации. Удаление SD также приводит к очень сильному падению экспрессии, как и в случае UAA 20 AUG, для реинициации на таком расстоянии присутствие SD необходимо.
Полученные нами результаты позволяют разделить исследованные случаи взаиморасположения начала второго и конца первого генов на несколько групп. В первую попадают случаи, в которых экспрессия второго гена сильно зависит от экспрессии первого и в гораздо меньшей степени, чем гены из моноцистронных мРНК, зависит от присутствия SD. Это случаи перекрывания -4, -1 и +3, для последнего одинаковые зависимости наблюдается и для канонического (AUG), и неканонического (AUU) стартовых кодонов. Механизм реинициации до сих пор остается не ясным, какая сила (если такая есть) заставляет рибосому двигаться «вниз» или даже «вверх» по мРНК. Единственный описанный пример движения рибосомы в сторону 5 -конца - это так называемая «обратная транслокация», катализируемая белком LepA [73]. Добавление или удаление одного нуклеотида между стартовым и стоп-кодоном не влияет на эффективность реинициации, поэтому можно предполагать, что рибосома двигается в обе стороны по нуклеотидам, а не по кодонам. Наши данные указывают на то, что если стартовый кодон близко расположен к стоп-кодону, то SD не играет решающей роли в реинициации, несколько нуклеотидов вниз или вверх по мРНК рибосома (или 30S субчастица) может пройти и в отсутствии стабилизирующих взаимодействия SD-aSD. Во второй группе оказываются взаиморасположения, при которых экспрессия второго гена сильно зависит от SD, но есть и зависимость от трансляции первого гена. Такая зависимость наблюдается для большого расстояния между концом первого и началом второго (вне зависимости от присутствия вторичных структур) и уникального взаиморасположения стоп и стартового кодонов - друг за другом. Стабилизирующие взаимодействия SD-aSD, возможно, помогают рибосоме удержаться на мРНК и дойти до старта трансляции второго гена. В случае присутствия вторичных структур между стоп-кодоном и стартовым у SD второго гена еще может быть одна положительная функция: эффективная de novo инициация второго гена облегчает реинициацию трансляции разрушая вторичную структуру, т.е. вторичная структура разрушается не скользящей от стоп кодона к стартовому рибосомой (или 30S субчастицей), а рибосомой, начинающей трансляцию сразу со второго гена, что облегчает скольжение рибосомы от первого гена необходимое для реинициации. В случае расположения стартового и стоп-кодона непосредственно друг за другом (UAAAUG) наблюдается гораздо большая зависимость от SD, чем для положений -4,-1 и 3, такое взаиморасположения редко встречаются в геноме. Тем не менее, хотя для UAAUG и UGAUG нам удалось показать меньшую, чем ожидалось, зависимость от SD, биоинформатический анализ генома выявлял наличие консервативной SD перед такими случаями перекрывания стартового и стоп-кодонов. Роль A/U-богатых участков в трансляции моноцистронных и полицистронных мРНК. A/U-богатые участки в 5 -нетранслируемой области мРНК увеличивают уровень экспрессии, по всей видимости, за счет взаимодействий с белком S1. Большое количество экспериментальных данных накоплено о влиянии A/U-богатых участков на трансляцию моноцистронных мРНК, и практически нет никакой информации о роли этого элемента при трансляции второго гена в опероне. При помощи нашей репортёрной системы мы решили изучить этот вопрос.
Разместив A/U-богатую последовательность гена phoP (UAUUUUAAUAAUUAA) перед SD гена CER в случае моноцистронной матрицы, мы показали, что этот элемент увеличивает эффективность трансляции более чем в четыре раза (рис. 44. 4/7 и 4/7 A/U). Затем мы разместили A/U-богатый участок в конце гена RFP, чтобы изучить его влияние на реинициацию, использовав описанные ранее конструкции с различными случаями взаиморасположения стартового и стоп-кодона. Необходимо отметить, что добавление такого участка на С-конец RFP привело к тому, что белок перестал быть флуоресцентным, поэтому в этих экспериментах проводилась нормировка сигнала CER на количество клеток, определенное по оптической плотности.
Инициация de novo и реинициация трансляции в случае близкорасположенных стартового и терминаторного кодонов
Компетентные клетки штамма BW25113 были добавлены в каждую лунку 96-луночного планшета (по 50 мкл при помощи автоматической рабочей станции Janus (Perkin Elmer). Затем по 1 цл соответствующей плазмиды (1 нг) было добавлено в каждую ячейку, смесь перемешивалась и инкубировалась в течение 30 минут на льду. После теплового шока (2 минуты 44 С) в каждую лунку добавляли 150 мкл среды LB, полученная смесь помещалась на 40 мин в термостат с температурой 37 С. Затем, по 20 мкл разливали на предварительно приготовленные 96-луночные планшеты с агаром (LB-агар + 50 мкг/мл ампициллин), процедуру повторяли три раза, в итоге на следующий день получали три 96-лучночных планшета, для каждой плазмиды получалось по три повтора. При автоматической рабочей станции Janus пересевали выросшие колонии в 2 мл 96-луночных планшет (Qiagen), содержащий 200 мкл LB, и растили 12-16 часов. Выросшие клетки скручивали на ультрацентрифуге 5 минту 5000 об/мин, дважды промывали 0.9% NaCl, и измеряли флуоресценцию при помощи планшеточного флуориметра Victor Х5 2030 (Perkin Elmer) с использование подходящий фильтров поглощение/испускание (430/486 нм для CER и 531/595 нм для RFP). Стандартное отклонение рассчитывалось по трем независимым измерениям.
Использование двойной репортерной системы для анализа механизма действия антибиотиков на чашках с агаром.
Ночную культуру штамма дикого типа BW25113 или AtolC, трансформированных плазмидами pRFPCER, pRFPCERrpL, pRFPCERrpL2A или pRFPCER-PsulA, разбавляли в десять раз свежей средой LB и выливали на чашки с агаром, средой LB и ампициллином (50 мкг/мл). Затем на поверхность высохших чашек помещали диски пропитанные антибиотиками (описание антибиотиков см. в Реактивах и Биопрепаратах). Для фосфомицина, норфлоксацина, левофлоксацина и тобрамицина были использованы половинки или четвертинки дисков. После культивировании в течении ночи при 37 С полученные чашки документировались при помощи цифровой камеры при освещении их ультрафиолетом (254 нм).
Приготовление и тестирование культуральных жидкостей продуцентов известных антибиотиков.
Штаммы Streptomyces venezuelae Ehrlich, Streptomyces fradiae и Streptomyces griseus растили в LB, содержащей 0.1% глюкозы, в течении 3-5 дней при 30 С. Клетки осаждали центрифугирование, а культуральную жидкость концентрировали в 50. Полученные растворы (5-10 мкл) использовали так же как и диски, пропитанные растворами антибиотиков. Поиск антибиотиков, тормозящих трансляцию, среди набора культуральных жидкостей почвенных микроорганизмов (актиномицет). Бумажные диски (Whatman ЗММ) диаметром 4 мм пропитывали 10-50 мкл культуральной жидкости и использовали также как и диски с известными антибиотиками. Приготовление экстракта штамма Micromonospora sp. 428/07 Штамм Micromonospora sp. 428/07 растили в течение 7 дней в специализированной среде (Гаузе №2), затем клетки были отделены центрифугирование, а к 30 мл культуральной жидкости было добавлено 3 мл хлороформа. Смесь перемешивали в течении двух часов при температуре 4 С. Органическая фаза была отделена и выпарена, а образовавшийся осадок растворен в 200 дл стирильной воды MiliQ. Полученный раствор использовался для тестирования механизма действия антибиотика как напрямую на чашке с агаром, так и в жидкой среде, и в in vitro ингибировании трансляции. Работа с РНК. Выделение суммарной клеточной РНК. Растили 2 мл клеток в LB до оптической плотности Абоо=0.5, затем производили выделение с использованием набора реагентов для выделения суммарной РНК фирмы Qiagen согласно протоколу с использованием фирменных реагентов. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин 5 мин (4С), ресуспендировали в 100 мкл раствора ТЕ (с лизоцимом), добавляли 350 мкл раствора RLT (Qiagen), перемешивали и добавляли 250 мкл 96-100% спирта. Раствор переносили на колонку для выделения РНК (Qiagen). Центрифугировали 15 сек 12000 об/мин, промывали колонку 700 мкл буфера RPE (Qiagen) и два раза 500 мкл буфера RW1 (Qiagen). Элюировали с колонки РНК 30 мкл очищенной от РНКаз воды (Qiagen).
Выделение суммарной клеточной РНК при помощи автоматической рабочей станции Janus (Perkin Elmer). Ночную культуру разбавляли в 100 раз и растили в 96-лучноном планшете (1мл) до оптической плотности Абоо=0.4-0.6. Затем клетки были осаждены центрифугированием в течение 5 минуту 5000 об/мин и суммарная РНК выделена при помощи набора реагентов SV Total RNA Isolation System (Promega).
Синтез библиотеки кДНК.
Выделенные образцы РНК обрабатывали ДНказой I (Fermentas), 1 единица фермента на 1 мкг РНК в течении 30 минут, реакцию останавливали нагреванием до 65 С в присутствии 2.5 мМ EDTA. Библиотеку кДНК синтезировали при помощи набора реактивов для синтеза цепи кДНК (Fermentas) с использованием случайного гексамерного олигонуклеотида.
Анализ количества мРНК при помощи ПЦР в реальном времени.
Реакционную смесь готовили также как и для обычного ПЦР, дополнительно добавляя О.Зх-раствор SYBR Green I (Sigma). Использовали четыре набора олигонуклеотидов: для определения количества мРНК RFP, CER, 16S рРНК и RFP-CER для проверки целостности бицистронной конструкции.
Работа с белками. Мечение флуоресцентной меткой вновь синтезированных белков.
Индивидуальную колонию помещали в среду М9, в которые были добавлены все аминокислоты (40 мг/л каждая) и растили ночь при 37С. Полученную ночную культуру разбавляли в 50 раз в 10 мл среды М9 с аминокислотами и растили до середины лог фазы (Абоо=0.5). Клетки осаждали центрифугированием и промывали два раза 0.9% NaCl, а затем опять растворяли в среде М9 со всеми аминокислотами, кроме метионина и разделяли на несколько образцов. Раствор эритромицина и экстракта 428/07 добавляли в надлежащих количествах (указано в Обсуждении результатов), а в контрольную пробирку не добавляли ничего. После 15 минут инкубирования, ко всем растворам добавляли гомопропаргил глицин (25 мкМ, Invitrogen). Встраивание гомопропаргил глицина останавливали скручиванием клеток через 15 минут. Клетки дважды промывали 0.9 NaCl и растворяли в буфере для лизиса. После инкубирования в течение 20 минут на льду раствор замораживали в жидком азоте и медленно размораживали. Затем клетки разрушали обработкой ультразвуком и центрифугировали. Супернатант собирали и хранили при -20С. Для мечения использовали набор Click-iT (Invitrogen) и метку Су5. Помеченные образцы разделяли в одномерной SDS-ПААГ. Детекцию флуоресценции осуществляли при помощи сканера флуоресценции (Fuji).
Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ
Собирали камеру для заливки SDS-ПААГ Mini-Protean II фирмы Bio-Rad, последовательно заливали 10% разделяющий гель, на который наслаивали 200 мкл изопропилового спирта. После полимеризации разделяющего геля, выливали верхний слой воды и заливали концентрирующий гель, в который вставляли "гребенку" для образцов. После полимеризации концентрирующего геля наносили предварительно прогретые при 95С в течение 5 мин образцы. Электрофорез проводили в буфере для электрофореза при 120 V до прохождения бромфенолового синего до конца геля.
После проведения электрофореза гель помещали в ванночку с раствором для прокрашивания белков и инкубировали при небольшом покачивании 1-16 ч. Затем гель переносили в отмывочный раствор того же состава, что и раствор для прокрашивания белков, только без красителя, и отмывали до проявления белковых зон. In vitro трансляция. Для in vitro трансляции использовали мРНК люцеферазы сверчка, S100 экстракт Е. coli и рибосомы, реакцию осуществляли по описанной методике [88]. Активность синтезированной люцеферазы определяли на следующих временных отрезках: 10, 20, 30, 40, 50 и 60 минут. Концентрации антибиотиков указаны в разделе Обсуждение результатов.
