Введение к работе
.туалыгость проблемы. Изучение структуры и функций факторов транскрипции ляется- важным не только с точки зрения исследования ключевых процессов ізнедеятельности клетки, но и открывает возможности для "направленного ~" здействия на биологические системы путем ингибнрования этих белков.
Фактор транскрипции NF-kB является основным элементом в системе регуляции льшого числа генов, которая позволяет клеткам млекопитающих быстро шепосабливать свою транскрипционную программу к воздействиям окружающей еды. Фактор NF-kB состоит из двух белковых субъединиц р5и и р65 и узнает в ДНК 'клеотидную последовательность из десяти пар оснований (кВ участок): -GGGPuNNPyPyCC-З', где Ри - A, G; Ру - С, Т; N - А, Т, G, С. Известно, что многие ікогеньї и вирусы используют NF-kB для активации транскрипции своих генов. В язи с этим большое внимание в настоящее время уделяется изучению процессов :тивации и функционирования NF-kB в клетке, а также поиску путей направленного аудирования его активности.
Для направленного ингибнрования факторов транскрипции активно развивается звий метод, заключающийся в том, что олигонуклеотидные дуплексы, содержащие іастки узнавания этих белков, используются для их связывания и выведения из эоцесса активации транскрипции. Проведенные исследования показали, что такие /плексы должны прочно связываться с фактором транскрипции, обладать термической абильностыо, быть устойчивыми к действию иуклеаз и проникать сквозь клеточную ембрану. Однако до сих пор не удалось получить ДНК-дуплексы, удовлетворяющие :ем этим требованиям. Для ингибнрования активности факторов транскрипции Зычно используют ДНК-дуплексы, которые нековалентно связываются с белком. Это іачит. что процесс ингибнрования носит обратимый характер и фактор транскрипции с удается вывести на продолжительный период времени из участия в процессах нициации транскрипции.
Поэтому необходим поиск новых структур ДНК-дуплскеов, содержащих одификашш различного рода, которые могут использоваться для эффективного нгибирования фактора транскрипции NF-kB. Особый интерес представляет проблема издания таких ингибиторов NF-kB на базе ДНК-дуплексов, которые обладают
В руководстве работой принимала участие к.х.н., с.н.с. Ивановская М.Г.
- 2-способностью ковалентно связываться с данным белком и являются, таким образом, егс необратимыми ингибиторами.
Целью настоящей работы является разработка ингибиторов для фактора транскрипцш NF-кВ на основе синтетических ДНК-дуплексов, а также исследование структурно-функциональных аспектов взаимодействий в комплексе фактора транскрипции NF-кВ і ДНК.
Научная новизна и практическая ценность. Синтезированы ДНК-дуплексы, содержашш активную тризамещённую пирофосфатную межнуклеотшшую группу в различное ориентации относительно 5' и 3' положений в месте ее введения в структур; олигонуклеотида (схема 4, стр. 6), и изучены их химические свойства. Причем ДНК дуплексы, в которых дизамешенная фосфатная группа, входящая в состаї тризамещё'нной пирофосфатной группировки, присоединена к 3' атому углерод; дезоксирибозы, получены и исследованы впервые. Установлено, что реакционна] способность тризамещенной пирофосфатной группы по отношению і низкомолекулярным нуклеофилам не зависит от ее ориентации в структурі олигонуклеотида.
С целью выбора оптимальной структуры ингибитора для NF-кВ исследован* взаимодействие с субъединицей р50 NF-кВ каждого из серии ДНК-дуплексо одинаковой первичной структуры, но различающихся положением тризамещенноі пирофосфатной группы в кВ участке. Показано, что ДНК-дуплексы, содержащи активную группу, в которой дизамешенная фосфатная группа присоединена к 3' атом углерода дезоксирибозы. не способны ковалентно связываться с р50 независимо о места положения активной группы в кВ участке. Для серии ДНК-дуплексоЕ содержащих активную группу, в которой дизамешенная фосфатная групп присоединена к 5' атому углерода дезоксирибозы. обнаружено четыре положения углеводофосфатном остове кВ участка, введение в которые тризамещенно пирофосфатной группы приводит к эффективному ковалентному связыванш модифицированных дуплексов с субъединицей р50 NF-кВ. Полученные результаты п ковалентному связыванию сравнены с данными рентгеноструктурного анали: комплекса димера р50 с ДНК, содержащей идеализированный кВ участок, показана и относительная корреляция. Использованный метод ковалентного связывания позволи скорректировать положение отдельных белково-нуклеиновых контактов в комплекс димера р50 с ДНК в растворе применительно к исследованному нами кВ участку.
Синтезирован ДНК-дуплекс, содержащий ацилфосфатную межнуклеотидную уппу. Показана возможность его ковалентного связывания с субъединицей р50 іктора транскрипции NF-kB, что является первым примером использования тивированных дуплексов такого типа для ковалентного связывания с белками.
Предложен метод получения ДНК-дуплексов, содержащих кВ участок. типараллельные цепи в которых соединены с помощью мостиковых соединений, держащих две или более алифатические аминогруппы. Показано, что связывание плекса по концевым фосфатным группам повышает его термическую стабильность и тойчивость к действию нуклеаз, а также не препятствует образованию специфичного імплекса с димером субъединицы р50 фактора транскрипции NF-кВ, что позволяет ссматривать такие соединения как потенциальные ингибиторы NF-kB.
Проведённое исследование представляет интерес с точки зрения конструирования -ІК-дуплексов. содержащих химически активные группы, для направленного ггнбирования факторов транскрипции в клетке, что может быть использовано при здании терапевтических препаратов нового поколения.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три атьи и одна принята к публикации. Результаты работы были доложены на 1-ом фопейском биотехнологическом симпозиуме (серия Майами Bio/Technology) (Монте-лрло, Монако, 1994 г.), на 7-ом Конгрессе FAOBMB "Новые направления в юхпмин и молекулярной биологии" (Сидней. Австралия. 1995 г.) и 12-ом еждународном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое пользование" (Ла Хоия, США, 1996 г.).
Структура и объём работы. Диссертация изложена на I ~>Q страницах ішинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения :зультатов. экспериментальной части, выводов и списка литературы; содержит -^ ісункЛ и 14 таблиц.
