Введение к работе
Аісгуальиость проблемы. Метилирование ДНК является природной эпигенетической модификацией генома и играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов. Метилирование ДНК осуществляется ДНК-метилтрансферазами (МТазами), использующими в качестве донора метильной группы кофактор, 5-аденозил-ь-метионин (AdoMet); AdoMet при этом превращается в 5-аденозил-Ь-гомоцистеин (AdoHcy). В эукариотах метилирование происходит по атому углерода С5 остатков цитозина преимущественно в CpG-последовательностях. Распределение метилированных и неметилированных CpG-последовательностей в геноме формирует профиль метилирования, нарушение которого приводит к онкогенезу.
Полициклические ароматические углеводороды, к числу которых относится
бензо[а]пирен (В[а]Р), являются широко распространенными загрязнителями окружающей
среды. В организмах, подверженных воздействию В[д]Р, отмечено образование
множественных мутаций и возникновение рака Основными метаболитами В[а]Р являются
диолэпоксиды - (+) и (-) 7,8-дигидрокси-9,10-эпокси-7,8,9,10 тетрагидробензо[а]пирены
(B[a]PDE), способные образовывать ковалентные аддукты с ДНК. Присоединение
преимущественно происходит по аминогруппе гуанина с образованием (+)- и (-)-транс-
анти -аддуктов Репарация таких аддуктов в эукариотах происходит с низкой
эффективностью, поэтому остатки В[а]Р, ковалентно присоединенные к ДНК, могут вызывать нарушение взаимодействия ферментов клеточного аппарата, в том числе МТаз, с ДНК
Большое количество повреждений, вызванных B[a]PDE, приходится на CpG-последовательности, в особенности, если остаток цитозина в них метилирован. В ранних работах показано, что статистическая обработка B[a]PDE эукариотических клеток приводила к снижению общего уровня метилирования генома (Wilson el al., 1987). Неясными остаются молекулярные механизмы взаимодействия стереоизомерных В[а]Р-Л^^О-аддуктов с МТазами млекопитающих.
МТазы млекопитающих являются малоизученными ферментами. Показано, что их первичные структуры в С-концевой части имеют высокую степень гомологии со структурой прокариотических С5-МТаз, которые изучены более подробно. В связи с этим, прокариотические МТазы могут быть использованы как модельные системы эукариотических аналогов.
В качестве модельных прокариотических МТаз в настоящей работе были использованы МТазы SssI (M.SssI) из Spiroplasma и EcoRII (MEcoRII) из E.coh. М SssI и М EcoRII узнают в ДНК последовательности CpG и CCt/aGG, соответственно, и метилируют в них остатки цитозина (подчеркнуты) по атому углерода в 5-ом положении. Выбор данных
РОС НАЦИОНАЛЬНА). ' БИБЛИОТЕКА ( СПетеИ^гл/^,
МТаз продиктован их сайт-специфичностью, поскольку в эукариотах метилированные остатки цитозина обнаружены как CpG-, так и в меньшей степени, в СрА/т- и Cf^/rGG-последовательностях. Кроме того, объектами исследования были ставшие доступными в процессе выполнения работы МТазы млекопитающих: каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD) и Dnmt2 человека. DranOa вводит метальную группу в новое положение в геноме (т.е. осуществляет метилирование de novo) на стадиях гаметогенеза и эмбриогенеза Dnmt3a-CD не отличается по каталитическим свойствам от полноразмерного фермента. Роль Dnmt2 в клетке неясна и эффективность метилирования ДНК данным белком крайне низкая.
Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение влияния введения в ДНК канцерогенных (+)- и (-)-транс-анти-В[а]Р-РР-Ю-аддуктов на функционирование С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, узнающих последовательности CpG и CCt/aGG.
Задачи работы: 1) конструирование ДНК-дуплексов, содержащих (+)- и (-)-транс-анти-Ща]Р-Ы*-<Ю в различных позициях ДНК-субстрата;
2) определение влияния стереоизомерии аддукта и его локализации в ДНК на различные стадии каталитического цикла прокариотических МТаз SssI и EcoRII и каталитического домена МТазы мыши Dnmt3a.
4) Изучение связывания Dnmt2 с ДНК-дуплексами, содержащими (+)- и (-)-транс-анти-Ща\Р-Ы2-№.
Научная новизна и практическая ценность.
Для M.SssI, M.EcoRII, Dnmt3a-CD и Dnmt2 впервые определены субстрат-связывающие характеристики и кинетические параметры метилирования широкого набора ^модифицированных и модифицированных ДНК-дуплексов.
Методами поляризации флуоресценции и торможения в геле получены значения констант диссоциации фермент_субстратных комплексов указанных МТаз с ^модифицированной ДНК. Для M.SssI взаимодействие с таким субстратом изучено постадийно: найдены каталитические константы и константы скорости переноса метильной группы на ДНК.
В качестве аналогов субстрата были получены ДНК-дуплексы, содержащие в участках узнавания МТаз или прилегающих к ним иуклеотидным последовательностям (+)-и (-)-транс-анти-В[а]?-М2-dG-аддукты (В). Установлено, что устойчивость комплексов M.SssI, Dnmt3a-CD и Dnmt2 с немодифицированной и с В[а]Р-ДНК примерно одинакова. Комплексы M.EcoRII с В[я]Р-ДНК были менее прочные по сравнению с комплексами М ЕсоЯП с немодифицированным субстратом. На основании анализа кинетических констант показано, что для М SssI, М EcoRII и Dnmt3a-CD метилирование ДНК, содержащей В-аддукты, затруднено или даже блокировано в зависимости от стереоизомерии аддукта и его
положения относительно метилируемого цитозина В случае М SssI наибольшее ухудшение метилирования В[а]Р-ДНК наблюдалось при локализации (+)- или (-)-аддукта с 5'-конца участка узнавания В случае Dnmt3a-CD ухудшение метилирования наблюдалось при локализации (+)- или (-)-аддукта в участке узнавания и (-)-аддукта вне его.
Полученные в работе результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения влияния канцерогенных повреждений ДНК на функционирование МТаз млекопитающих Показано, что канцерогенное действие загрязнителя окружающей среды - В[а]Р - включает эпигенетическую составляющую - изменение профиля метилирования ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), 5-м международном симпозиуме New England Biolabs «Restriction/Modification», (Бристоль, 2004), международной конференции «Химические и биологические проблемы протеомики» (Новосибирск, 2004), международной научной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен механизмам функционирования эукариотических ДНК-метилтрансфераз), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (130 ссылок). Материал иллюстрирован 19 рисунками, 8 таблицами и 4 схемами
