Введение к работе
Актуальность проблемы. Реакция метилирования ДНК является одной из основных в биохимии клетки. У млекопитающих метилирование ДНК играет существенную роль в регуляции экспрессии генов, импринтинге, упаковке хроматина, эмбриональном развитии, возникновении онкологических заболеваний. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от чужеродной ДНК, а также тесно связано с регуляцией экспрессии генов и с процессами репликации и репарации ДНК. Метилирование ДНК катализируется важнейшим классом ферментов нуклеинового обмена - ДНК-метилтрансферазами (МТазами).
С5-Цитозиновые ДНК-МТазы обнаружены как у прокариот, так и у эукариот. Аминокислотные последовательности каталитических доменов бактериальных и эукариотических С5-цитозиновых ДНК-МТаз характеризуются общей структурной организацией. Не так давно было установлено, что многие МТазы в клетке осуществляют не только метилирование ДНК, но и обладают другими функциями (например, регуляторной). Так, в базе данных Pfam () содержатся 5065 аминокислотных последовательностей, в которых идентифицируется домен «С5-цитозиновая ДНК-МТаза» (PF00145). Из них лишь 61% содержит только один МТазный домен. В остальных 39% наблюдаются удвоения этого домена и/или какие-либо дополнительные домены. Молекулярные основы взаимодействия такого рода белков с ДНК, особенно с операторными (регуляторными) последовательностями, мало изучены.
Данная работа направлена на исследование механизмов узнавания ДНК бифункциональными МТазами на примере прокариотической С5-цитозиновой ДНК-МТазы SsoII (M.SsoII), входящей в систему рестрикции-модификации (Р-М) П-го типа SsoII. M.SsoII узнает в двутяжевой ДНК последовательность 5'-CCNGG-3' (где N = А, С, G или Т) и в присутствии кофактора -аденозил--метионина (AdoMet) метилирует внутренний остаток цитозина с образованием остатка 5-метилцитозина. Интересной особенностью M.SsoII является ее протяженный N-концевой участок (1-71 аминокислотные остатки (а. о.)), наличие в котором мотива «спираль-поворот-спираль» (СПС) обусловливает способность МТазы выступать в роли фактора транскрипции и регулировать экспрессию собственного гена, а также гена, кодирующего эндонуклеазу рестрикции SsoII (R.SsoII). Регуляция осуществляется благодаря специфическому взаимодействию M.SsoII с промоторной областью генов системы Р-М SsoII (Karyaginaet ah, 1997; Shilov etal, 1998). Основное число контактов M.SsoII с промоторной областью обеспечивает локализованный внутри последней 15-звенный инвертированный повтор (в дальнейшем называемый регуляторным участком).
Таким образом, M.SsoII представляет собой бифункциональный белок: с одной стороны это фактор транскрипции, а с другой - фермент, катализирующий реакцию метилирования ДНК. Какова взаимосвязь между активностями, которые
обеспечиваются разными доменами в составе одной полипептидной цепи, - вопрос, для МТаз практически не исследованный. Это определяет актуальность всестороннего изучения структурно-функциональной организации комплексов M.SsoII с участком метилирования и с регуляторным участком.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлась структурно-функциональная характеристика С5-цитозиновой ДНК-метилтрансферазы SsoII и ее комплексов с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования и регуляторный участок.
В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.
Охарактеризовать третичную и четвертичную структуру апо-формы M.SsoII и ее делеционных мутантов.
Изучить комплексообразование M.SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими участок метилирования или регуляторный участок:
стехиометрию комплексов;
эффективность связывания M.SsoII с ДНК-дуплексами;
скорости комплексообразования M.SsoII с ДНК-дуплексами.
Проанализировать структурную организацию комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок.
Детализировать модель функционирования M.SsoII в клетке как фермента модификации и как фактора транскрипции.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что M.SsoII в апо-форме является мономером. Продемонстрировано, что при взаимодействии M.SsoII с ДНК-дуплексами различной длины (от 15 до 60 пар нуклеотидов (п. н.)), содержащими участок метилирования, образуются специфические ДНК-белковые комплексы со стехиометрией 1:1. Получены структуры низкого разрешения M.SsoII в апо-форме и в комплексе с 15-звенным ДНК-дуплексом, содержащим участок метилирования. Радиус инерции комплекса уменьшается, что свидетельствует о его более компактной структуре по сравнению с апо-формой белка.
Показано, что делеционный мутант, представляющий собой N-концевую область Ssoil-подобных ДНК-МТаз, сохраняет вторичную структуру: он содержит 32% а-спиралей и 20% Р-тяжей. Впервые подобраны условия, в которых данный делеционный мутант способен формировать специфические комплексы с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что в полноразмерной M.SsoII N-концевая область существует в виде структурно обособленного домена. С помощью внутримолекулярной «сшивки» под действием биомалеимидоэтана продемонстрировано, что линкер, соединяющий N-концевую область M.SsoII с областью M.SsoII, ответственной за метилирование, является подвижным.
Показано, что при взаимодействии M.SsoII с 60-звенным ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок, образуются два специфических комплекса. Один
из них имеет стехиометрию 1:1, в то время как второй состоит из двух субъединиц M.SsoII и одного ДНК-дуплекса. Впервые показано, что в комплексе M.SsoII с регуляторной ДНК остаток Cysl42 в каталитическом центре фермента сближен с ДНК. Предложена структура комплекса M.SsoII с ДНК-дуплексом, содержащим регуляторный участок: N-концевые области белка специфически взаимодействуют с регуляторным участком, а области M.SsoII, ответственные за метилирование, неспецифическим образом связаны с ДНК, фланкирующей регуляторный участок. По-видимому, связывание области, ответственной за метилирование, с ДНК в непосредственной близости от регуляторного участка придает дополнительную стабильность этому комплексу.
Впервые показано, что метилтрансферазная и регуляторная активности M.SsoII являются взаимоисключающими: комплексообразование этого белка с регуляторным участком предотвращает его связывание с участком метилирования. Изучение кинетики взаимодействия M.SsoII с ДНК-лигандами свидетельствует о том, что связывание этого белка с участком метилирования происходит значительно быстрее, чем с регуляторным участком. Проведена теоретическая оценка числа участков метилирования и числа регуляторных участков в ДНК клетки. Эффективное метилирование клеточной ДНК обеспечивается M.SsoII за счет большей скорости связывания с участком метилирования и за счет значительного избытка участков метилирования относительно регуляторных участков.
Полученные в настоящей работе данные о свойствах M.SsoII расширяют знания о бактериальных системах Р-М, позволяют понять особенности поведения МТаз как транскрипционных факторов и могут быть использованы для конструирования новых регуляторных белков. Так как ответственные за метилирование домены С5-цитозиновых ДНК-МТаз из разных источников имеют сходную первичную структуру и для них постулирован единый механизм метилирования ДНК, результаты исследования могут быть использованы для объяснения механизмов взаимодействия эукариотических МТаз с ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российском и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), на конференциях «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.), «Ломоносов-2010» (Москва, Россия, апрель 2010 г.), «IV Slovak Biophysical Symposium» (Модра-Гармония, Словакия, апрель 2010 г.), «Workshop "Enzymes and enzyme complexes acting on nucleic acids" of the International Research Training Group Gierjen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded)» (Вильнюс, Литва, май 2010 г.), «6th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification» (Бремен, Германия, август 2010 г.) и «Химия в молекулярной биологии» (Москва, Россия, декабрь 2011 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен структурно-функциональной характеристике доменов, входящих в состав С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз), обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 76 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 333 цитированных работы.
