Введение к работе
Актуальность проблемы.
Метод химического лигирования был впервые предложен в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ в 70-х годах. В дальнейшем он был развит как альтернативный энзиматическому метод сборки протяженных фрагментов ДНК. Этот метод основан на сближении концов олигонуклеотидов на комплементарной матрице с последующим образованием межнуклеотндной связи под действием химических реагентов. В основе его лежат два основных подхода. Первый предусматривает предварительную активацию фосфомоноэфирной группы, вовлеченной в образование межнуклеотндной связи в составе ДНК-дуплекса. Второй подход состоит в использовании конденсирующего реагента для синтеза фосфодиэфирной связи непосредственно в ДНК-дуплексе. В настоящее время нашли широкое применение два конденсирующих агента - 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК) и бромциан. Необходимо отметить, что метод активации фосфатной группы с использованием карбодиимида имеет два существенных недостатка. С одной стороны, синтез природной межнуклеотндной связи протекает достаточно медленно, от 40 до 48 часов. С другой стороны, карбодипмид способен модифицировать гетероциклические основания олигонуклеотидов (гуанин и тимин), поэтому продукт лигирования обладает недостаточной чистотой. Это может создавать определенные проблемы, например, при изучении взаимодействия такого продукта с ферментами. Указанные недостатки отсутствуют, если ХЛ осуществляется в присутствии BrCN. Существуют два способа активации фосфатной группы с использованием бромшіана. Первый способ предусматривает проведение реакции в имидазольном буфере. Показано, что в этом случае реальным активирующим агентом является 1-цианоимидазол и скорость реакции сравнима со скоростью образования межнуклеотндной связи под действием карбодиимида (5-20 ч). Второй способ активации, предложенный Н.И.Соколовой в лаборатории Химии нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ, предполагает использование морфолиноэтансульфонатного (МЭС) буфера, оттитрованного триэтиламином до рН 7.5, вместо имидазольного. Этот способ примечателен уникальной скоростью реакции - образование продукта лигирования заканчивается за 3-5 минут. В лаборатории Химии
нуклеиновых кислот Химического факультета МГУ была подробно исследована зависимость эффективности BrCN-индуиируемого лигирования от природы реагирующих групп и нуклеозидов в месте образования межнуклеотидной связи. Однако механизм этой реакции детально не исследовался. Невыясненным оставался и вопрос о зависимости эффективности ХЛ от пространственной организации дуплекса. В то время как лигирование в линейном дуплексе с использованием бромшіана в МЭС-буфере позволяет получить необходимый продукт с практически количественным выходом (90-95 9с), при попытке применения BrCN-индуцируемого метода лигирования к синтезу более сложных структур (например, циклических олигонуклеотидов) было отмечено снижение выхода продукта реакции. Следует отметить, что получение одно- и двутяжевых фрагментов ДНК необычной пространственной структуры может представлять интерес как с точки зрения изучения некоторых аспектов белково-нуклеинового взаимодействия, так и в прикладной области - сенсовой и антисенсовой биотехнологии.
Целью настоящей работы является изучение механизма ХЛ под действием BrCN и оптимизация методики лигирования с использованием BrCN для получения фрагментов ДНК необычной пространственной структуры (например, тех же циклических однотяжевых олигонуклеотидов). Кроме того, важно было выяснить, можно ли использовать метод лигирования под действием карбодиимида и бромшіана для тестирования пространственной структуры ДНК-дуплексов. Это позволило бы быстро получать необходимую информацию о структуре исследуемых дуплексов с использованием простых методик и относительно дешевых реагентов. Научная новизна и практическая ценность работы. В работе изучен механизм активации фосфатной группы под действием бромшіана в МЭС-буфере. Показано, что этот реагент можно использовать не только для химического лигирования, но и для получения производных олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе. Метод химического лигирования впервые использован для тестирования пространственной структуры JHK-дуплексов и получения информации о том, какие из нескольких возможных способов гибридизации реализуются на практике. Оптимизированы условия ХЛ в применении к синтезу олигонуклеотидов необычной пространственной структуры (например, циклических
однотяжевых олигонуклеотидов, которые могли бы найти применение в антисенсовой биотехнологии). Исследованы особенности лнгирования линейного олигонуклеотида на циклической матрице. Показано, что при лигнровании линейного олигонуклеотида на циклической матрице возможно образование катенанов. Изучена зависимость направления реакции и выхода продуктов лнгирования от нуклссгилной последовательности линейного олигонуклеотида и циклической матрицы. С помощью методов лнгирования под действием карбодиимида и BrCN изучено строение места разветвления в трехлучевом ДНК-луплексе с разрывом. Также с использованием этих реагентов показано, что 3'-концевой а- и 5'-концевой р-аномерные фрагменты 76-звенного олигонуклеотида образуют внутримолекулярный параллельный дуплекс. Полученные данные значительно расширяют область применения метода химического лнгирования под действием BrCN и ЭДК. Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3-й Международной конференции по рибонуклеазе Н (Осака, Япония, 1994 г.) и на Международной конференции "Therapeutic oligonucleotides: from cell to man" (Сейяк, Франция, 1995 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы и одна статья принята в печать.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах
