Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее перспективных подходов направленного воздействия на генетический armapaf клетки, является метод комплементарно-агресованной модификации нуклеиновых кислот (НК) с помощью производных олигонуклеотидов, содержащих в своем составе ковалентно присоединенные реакционноспособные группировки.
Среди большого разнообразия химических групп, используемых в составе олигонуклеотидшх реагентов, наиболее широко применяется алкилирувдая 4-(М-2-хлорэтил-и-метиламино)феиильная группа. Ранее были исследованы химические и кинетические аспекты реакции внутри-комплексного алкилирования олигояуклеотидными производными, несущими в своей структуре ароматическую Н-2-хлорэтилачиногруппу на 5' или 3'-конце цепи. В то же время структурные аспекты подобных реакций практически не изучены. Монно полагать, что существенную роль в эффективности и позиционной направленности комплементарно-адресованной модификации играет пространственная ориентация модифицирующей группировки в структуре дуплекса. Поэтому для более полного понимания механизма комплементарно-адресованной модификации НК необходимо детальное изучение конформации олигонуклеогидных комплексов, а также структуры образующихся продуктов реакций. Исследование конформационннх особенностей образующихся аддуктов актуально также с точки зрения последующего узнавания модифицированных участков нуклеиновых кислот ферментами репарации и влияния структуры модифицированного узла на эффективность процесса репара--ции образующихся дефектных участков нуклеиновых кислот.
Стабильность комплексов "КК-мишень - олигонуклеотидный реагент" может быть значительно повышена путем присоединения к олиго-нуклеотиду пслиароматических гетероциклических группировок, таких как остатки акридина, фенантридина и феназияа. Было показано, что реакции внутрикомплексного алкилирования в подобных стабилизированных комплексах, протекают с высокой эффективностью и селективностью. В связи с этим повышается роль и актуальность исследования общих механизмов стабилизации Hit-дуплексов с помощью ковалэнтно-присоединенных интеркалирующих группировок, что также невозможно без изучения особенностей их пространственной структуры. В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение пространственной структуры как продуктов реакции ьнутрикомплексного алкилирования, так и стабилизированных комплексов в водном растворе.
Цель работы. Целью настоящей работы было исследование пространственной СТРУКТУРЫ МОДеЛЬНЫХ ДУПЛексОВ (D-i ), (D-2) И (D-3 )
методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в комбинации с методом ограниченной молекулярной механики:
r* pd(CpCpApApApCpA)
R <](CpGpGpTpTpTpGpTp)
L J (D-l )
Phn-NH-(CH2)2-NH-pd(CpCpApApApCpA) pd(CpCpApApApCp)rA
d(CpCpGpTpTpTpGpTp) d(CpGpCpTpTpTpGpTp)
(D-2) (D-3)
где: R - остаток 4-[11-2-хлорэтил-Ы-метиламино]бензиламидного фрагмента; Phn - остаток. 10-(2-гидроксиэтил)феназиния.
Дуплекс (D-i) является продуктом реакции внутрикомплексного алкилирования по N-3 положению нуклеогидного звена с(8) октанукле-
ОТИДа-МИШеНИ pd(TpGpTpTpTpGpGpC) С ПОМОЩЬЮ 4-[Ы-2-ХЛ0рЭТИЛ-М-ме-
тиламино]бензил-5'-фосфамидного производного гептануклеотида pd(cpCpApApApCpA). Дуплекс (D-2), содержащий ковалентно присоединенный по 5'-фосфатной группе гептануклеотида остаток ю-(2-гидроксиэткл)-феназиния, представляет собой модель стабилизированного феназином дуплекса.
Новизна работы. Новизна данной работы заключается в том, что в ней впервые комбинацией методов двумерной ЯМР-спектроскопии (2М-ЯМР) и ограниченной молекулярной механики (ОММ) исследованы пространственные структуры продукта реакции внутрикомплексного алкилирования и стабилизированного олигонуклеотидного дуплекса с ковалентно -присоединенным остатком феназина в водном растворе; получены термодинамические характеристики исследуемых комплексов.
Практическая ценность. Предложены модели наиболее вероятных низкоэнергетических конформаций ковалентного аддукта (D-i), а также феназин-содержащего дуплекса (D-2) в водном растворе. Эти сведения важны для детального понимания общих механизмов внутри-комплексной комплементарно-адресованной модификации НК, а также процессов стабилизации НК-дуплексов с помощью ковалентно-прксоединенных интеркалирующих группировок.
Апробация работы. Результаты работа докладывались, на VI всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров" (Харьков, 1988), международном симпозиуме "Синтез олигонуклеотидов: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991), VII всесоюзной конференции "Спектроскопия биополимеров'* (Харьков, 1991), международной конференции "Терапевтические препараты на основе нуклеиновых кислот" (Clearwater Beach, Флорида, США, 1991).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ"!
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы из 134 наименований и содержит 19 таблиц и 40 рисунков.
