Введение к работе
Актуальность проблемы. Полисахариды являются одними из наиболее распространенных природных полимеров, участвующих в целом ряде важных биохимических процессов. Эти макромолекулы построены из разнообразных моносахаридных остатков, отличающихся стереохимическои конфигурацией и неуглеводными заместителями и соединенных различными типами межмоноса-харидных связей. Данные свойства полисахаридов определяют исключительною сложность их структурного анализа, и поэтому развитие и совершенствование эффективных методов установления строения полисахаридов является одной из наиболее актуальных задач современной химии углеводов.
Структурный анализ полисахаридов с использованием традиционного подхода, основанного на расщеплении полимерных цепей на олиго- и моноса-харидные фрагменты и их исследовании, является трудоемким и во многих случаях неуспешным из-за ограничений при проведении селективного расщепления полисахаридов по требуемым гликозидным связям, а таюке при разделении олигосахаридных фрагментов. Поэтому особо перспективным представляется предложенный в ИОХ РАН и в ряде зарубежных центров метод компьютерного бездеструктивного структурного анализа полисахаридов. Он основывается на компьютерном расчете спектров 13С-ЯМР всех возможных полисахаридов с данным моносахаридным составом и Поиске структуры, для которой наблюдается наилучшее совпадение рассчитанного и экспериментального спектров. Компьютерный метод широко и успешно применяется в настоящее время для установления строения регулярных линейных полисахаридов.
. Исследование возможности применения компьютерного подхода для определения строения вицинально разветвленных (разветвленных по соседним по-тожениям) полисахаридов, анализ которых особенно труден, показало, что их :пектры не могут быть в общем случае рассчитаны с использованием уравнений і баз данных, применяемых при расчете спектров линейных полисахаридов. Проведенные ранее исследования ряда модельных соединений показали, что для шцинально разветвленных олигосахаридов характерны специальные спектраль-ше эффекты, заключающиеся в отклонениях химических сдвигов 13С от аддитивности (далее - отклонения от аддитивности), без знания которых расчет :пектров вицинально разветвленных полисахаридов невозможен. Настоящая ра-юта посвящена актуальной теме - систематическому исследованию вицинально іазветвленньгх олигосахаридов с целью определения величин отклонений от ад-1ИТИВН0СГИ, выяснению причин их возникновения и приложению полученных [анных для развития компьютерного метода структурного анализа регулярных ицинально разветвленных полисахаридов.
Цель работы. Целью данной работы были направленный химический син-
тез серий модельньк олигосахаридов (А-Е) и некоторых других, содержащих 2,3-диэкваториальный (А-В), 2-аксиально,3-экваториальный (Г,Д), и 3,4-диэк-ваториальный (Е) узлы разветвления, а в качестве заместителей Sug1 и Sug2 -моносахаридные остатки с a-D-, p-D-, a-L- и p-L-конфигурациями; детальное исследование спектров 13С-ЯМР и определение величин отклонений от аддитивности; конформационный анализ олигосахаридов с использованием теоретических расчетов методами молекулярной механики и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера и выявление структурных параметров, определяющих возникновение отклонений от аддитивности в спектрах '^С-ЯМР разветвленных олигосахаридов; систематизация найденных спектральных характеристик исследованных олигосахаридов и применение их в компьютерном структурном анализе природных вицинально разветвленных полисахаридов.
oh^s»oi м*
&I02-O \.и і Sug2-0 -
A R1 - ОМе, К2 - R3 - Н, R4 -ОН ГДЕ
Б R1 - R3 - И, R2 - ОМе, R* -ОН В* R1 - ОМе, R2 - R* - Н, R3 -ОН
Sugl, Sug2 - остатки шшосзиирцаов
Научная новизна. Впервые проведен эффективный стереонаправленный синтез серий 2,3-ди-О-гликозилированных a-L-рамнопиранозидов, a-D-манно-пиранозидов, а- и p-D-глюкопиранозидов, p-D-галактопиранозидов и 3,4-ди-О-гликозилированных a-L-рамнопиранозидов, содержащих 2-аксиально,3-эквато-риальный, а также 2,3- и 3,4-диэкваториальный узлы разветвления. При получении целевых трисахаридов систематически изучено гликозилирование гликозил-ацетатами в присутствии триметилсилилтрифлата, тиогликопиранозидами под действием тритилперхлората, бензобромальдозами при промотировании солями ртути и трифлатом серебра.
Предложен новый подход к синтезу a-L-фукозилированных производных, основанный на гликозилировании бензобромфукозой в условиях реакции Гель-фериха; выявлены структурные особенности гликозил-акцепторов, влияющие на эффективность а-фукозилирования. Синтетические возможности* метода продемонстрированы на примерах получения производных природных олигосахаридов - фрагментов гликопротеинов и полисахаридов.
Впервые, основываясь на данных молекулярно-механических расчетов и экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера, проведен теоретический и экспериментальный конформационный анализ широкой серии 2,3-ди-О-глико-зил-а-Ь-рамнозидов, содержащих вицинальный 2-аксиально,3-экваториальный узел разветвления и включающих в качестве заместителей моносахаридные ос-
татки с a-D-, p-D-, a-L- и p-L-конфигурациями. В спектрах 13С-ЯМР трисахаридов определены величины отклонений от аддитивности. Показано, что возникновение этих эффектов связано с различием конформаций дисахаридньгх фрагментов трисахаридов и соответствующих дисахаридов, и как следствие, изменением внутримолекулярных протон-протонных взаимодействий, влияющих на величины химических сдвигов сигналов в спектрах '3С-ЯМР. Исследована зависимость величин отклонений от аддитивности от структурных особенностей трисахаридов - конфигурации С2 и С4 атомов в терминальных моносахаридных остатках и характера структурных фрагментов при их С2, а также при 01 бис-гликозилированного остатка рамнозы.
Изучены особенности спектров 13с_яМР серии 2,3-ди-0-гликозил-а-0-маннозидов, содержащих, как и 2,3-ди-0-гликозил-ос-Ь-рамнозиды, 2-аксиаль-но,3-экваториальное разветвление; показано подобие величин отклонений от аддитивности для обеих групп трисахаридов. Проведено спектральное (ЯМР) и конформационное исследование серий 2,3- и 3,4-диэкваториально разветвленных трисахаридов, определены значения отклонений от аддитивности в их спектрах 13С-ЯМР.
Исследована возможность перенесения величин отклонений от аддитивности между группами стереохимически подобных трисахаридов, а также трисахаридов с одинаковым типом разветвления, но в разных положениях.
Составлена компьютерная программа для структурного анализа регулярных вицинально разветвленных полисахаридов, основанная на расчете спектров 13С-ЯМР разветвленных полисахаридов с использованием величин отклонений от аддитивности, определяемых из спектров модельных трисахаридов. Компьютерный анализ использован при установлении строения О-антигенных полисахаридов бактерий Escherichia coli и Pseudomonas solanacearum, состоящих из сложных пентасахаридньгх повторяющихся звеньев.
Определены величины отклонений от аддитивности в спектрах 13С-ЯМР группы линейных трисахаридов, 1,2-дизамещенных в центральном звене. Най-ценн'ые спектральные характеристики использованы при модификации программы компьютерного структурного анализа разветвленных полисахаридов, в том шсле 1,2-дизамещенных в основной цепи.'Модифицированная программа применена для структурного анализа О-антигенного полисахарида из Е. coli OIB.
Практическая значимость. Осуществлен направленный синтез широкой :руппы разнообразных линейных и разветвленных олигосахаридов, необходимых іля физико-химических и биохимических исследований. Предложены новые и усовершенствованы известные методики гликозилирования, что расширяет арсенал методов построения гликозидных связей, повышает их эффективность и трощает условия их проведения.
Исследованы спектры ЯМР и конформации синтезированных олигосахаридов; измерены величины ядерных эффектов Оверхаузера, наблюдаемых в результате предоблучения аномерных протонов моносахаридных остатков в олиго-сахаридах. Полученные данные об особенностях конформационного строения разветвленных олигосахаридов необходимы для выяснения пространственное организации более сложных олиго- и полисахаридов, содержащих подобные структурные фрагменты.
Определены значения спектральных эффектов гликозилирования в спектрах І^с-ЯМР дисахаридов и отклонений от аддитивности в спектрах 2,3- и 3,4-вицинально разветвленных олигосахаридов, а также в линейных трисахаридах с 2-О-гликозилированным ("1,2-дизамещенным") цешральным моносахаридным звеном. Найденные характеристики использованы для дополнения имеющихся и составления новых баз данных для компьютерного анализа линейных и разветвленных полисахаридов.
Составлены и использованы программы для компьютерного структурного анализа вицинально разветвленных полисахаридов, в том числе содержащих 1,2-дизамещенные моносахаридные звенья в основной цепи.
Апробация полученных данных. Результаты настоящей работы докладывались на XVI и XVII Международных углеводных симпозиумах (Париж 1992, Оттава 1994), VI и'VII Европейских симпозиумах по углеводам (Эдинбург 1991 Краков 1993), Международной конференции по гдикотехнологии (Сан Диего 1994), Гордоновской конференции по углеводам (Тилтон, 1993), X Симпозиуме по гликоконьюгатам (Краков 1993), III и IV Советско-Шведских симпозиума? по химии и биохимии углеводов (Киев 1988, Лунд 1990), Симпозиуме по кон-формационным исследованиям олигосахаридов, полисахаридов и гликоконью-гатов (Ле Круазик 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 32 статьи, в том числе 2 обзорные, в отечественных и международных журналах, а также 10 тезисов докладов на международных конференциях.
