Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Механизм терминации трансляции эукариот 7
1.2 Структура и функции erfi 8
1.3 Структура и функции erf3 15
1.4 Ключевые отличия механизма терминации трансляции в прокариотах и эукариотах 17
1.5 Механизмы контроля ошибок трансляции и гомологи эукариотических факторов терминации трансляции 18
1.6 Методы спектроскопии ямр для определения структуры биологических макромолекул в растворе 26
1.7 Метод молекулярной динамики для исследования биомолекулярных систем 41
2. Экспериментальная часть 46
2.1 Материалы 46
2.2 Методы исследования 47
3. Результаты 65
3.1 Отнесение сигналов в спектрах ямр 65
3.2 Структура c-Flomehaerfl 68
3.3 Температурный эффект 74
3.4 Исследование стабильности конформеров 76
3.5 Исследование динамики атомов основной белковой цепи с-домена erf1 76
3.6 Расчет динамики движения с-домена белка ERFI 79
3.7 Расчет динамики движения полноразмерного белка erfi 89
4 Обсуждение результатов 94
4.1 Сраві іение ямр структуры с-домена с кристаллической 94
4.2 Стабилизация конформаций мини-домена 95
4.3 Динамика атомов основной цепи с-домепа erfi 97
4.4 Сравнение результатов расчета молекулярной динамики с результатами экспериментов ямр 98
4.5 Гомологи мини-домена ERFI и консервативность аминокислотной последовательности 99
4.6 Рациональный выбор мутаций остатков мини-домена для изучения функциональной активности 100
4.7 Предполагаемая функциональная роль мини-домена 329-372 в процессе терминации трансляции 103
Выводы 105
- Структура и функции erfi
- Методы спектроскопии ямр для определения структуры биологических макромолекул в растворе
- Структура c-Flomehaerfl
- Стабилизация конформаций мини-домена
Введение к работе
Актуальность проблемы
Биосинтез белка на рибосоме по матрице РНК (трансляция) является одним
из важнейших биохимических процессов в клетке. Механизм трансляции
находится в фокусе интенсивных исследований в течение последних пятидесяти
лет. Актуальность таких исследований подтверждает, в частности, факт
присуждения Нобелевской премии по химии 2009 года трем исследователям за их
вклад в изучение структуры и функции рибосомы. Тем не менее, до настоящего
времени установлены далеко не все детали механизма процесса трансляции.
Наибольшее количество нерешенных вопросов связано с процессом трансляции в
эукариотах. В частности, не определены многие ключевые аспекты механизма
остановки биосинтеза белка (терминации трансляции) при достижении стоп-
кодона мРНК. Известно, что ключевую роль в механизме терминации трансляции
в клетках эукариот играют белки eRFl и eRF3, называемые факторами
терминации трансляции (eukaryotic Release Factor) первого и второго класса
соответственно. Белок eRFl проявляет структурно-функциональную мимикрию
молекулы тРНК, и обеспечивает узнавание стоп-кодона, а также последующее
освобождение синтезированного белка из терминационного
рибонуклеопротеинового комплекса. Фактор терминации трансляции второго класса eRF3 является рибосомо- и eRFl-зависимой ГТФазой. Этот белок кодируется жизненно важным геном и необходим для стимулирования активности eRFl и повышения эффективности процесса терминации. Трехмерная структура eRFl человека была ранее определена в кристалле. Было, в частности, установлено, что белок состоит из трех доменов, соединенных гибкими линкерами. При этом каждый из доменов ответственен за определенную функцию. Так, N-терминальный домен играет ключевую роль в узнавании стоп-кодона, обеспечивая строго специфическое взаимодействие eRFl с каждым их трех возможных триплетов UAA, UAG и UGA. Средний (М) домен участвует в гидролизе связи между полипептидной цепью синтезированного белка и тРНК в пептидилтрансферазном центре 60S субъединицы рибосомы. Все функции С-терминального домена до конца не установлены, но было показано, что этот домен участвует во взаимодействии с eRF3. Это позволяет предположить для него регуляторную роль в процессе терминации трансляции. Фрагмент eRFl, состоящий только из М и С-доменов способен связываться с рибосомой эукариот и индуцировать ГТФазную активность eRF3. В то же время, фрагмент, состоящий лишь из N и М доменов, сохраняет функциональную активность полноразмерного eRFl in vitro.
Структура, динамика и функции С-домена eRFl изучены значительно меньше чем N и М доменов белка. Так, в рентгеновских структурах полноразмерного eRFl, как в свободной форме, так и в комплексе с eRF3, С-домен имеет обширные неразрешенные фрагменты. Очевидно, что установление структуры и исследование динамических свойств С-домена eRFl необходимо для понимания его роли в механизме терминации трансляции и определения молекулярных аспектов регуляции этого процесса.
Цель работы
Целью данной работы является изучение структуры в растворе, динамики и функций С-домена фактора терминации трансляции eRFl человека. Для достижения указанных целей в работе были поставлены и решены следующие задачи:
Определение структуры высокого разрешения С-домена белка eRFl в растворе методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР);
Экспериментальное определение динамических свойств белковой цепи С-домена eRFl с помощью спектроскопии ЯМР;
Исследование молекулярной динамики и междоменных взаимодействий в eRFl методом молекулярного моделирования in silico, с использованием полученных экспериментальных данных по структуре и динамике белка.
Научная новизна
В работе впервые получены данные о структуре высокого разрешения С-домена фактора терминации трансляции eRFl человека в растворе. Впервые получены структурные данные для фрагмента 329-372 белка, не определенного ранее в кристалле. Установлено, что фрагмент 329-372 структурирован и формирует отдельный минидомен, существующий в виде двух конформеров с равной населенностью, медленно (в шкале времени от секунд до минут) переходящих друг в друга. Для каждого из конформеров определена структура высокого разрешения в растворе. Элементом новизны является сам факт определения структуры двух конформеров белка. Установлено также, что С-терминальный фрагмент 414-437, не разрешенный, как и фрагмент 329-372, в кристаллической структуре eRFl, неструктурирован в растворе. Полученные семейства структур ЯМР для каждого из конформеров депонированы в банк данных белковых структур PDB (коды 2KTU и 2KTV).
Впервые методом ЯМР изучена динамика основной белковой цепи С-домена eRFl человека. Установлено, что амплитуда молекулярных движений структурированной части домена сравнительно невелика.
Исследована стабильность конформеров С-домена eRFl при различной температуре, рН и ионной силе раствора. Показано, что при рН раствора ниже рКа протонирования имидазольного фрагмента гистидина белок неустойчив. После рефолдинга белка из раствора с пониженным рН остается только один конформер.
Рассчитаны длинные (до 200 не) траектории молекулярной динамики С-домена eRFl и исследованы факторы стабилизации мини-домена. Изучено влияние состояния протонирования имидазольного кольца гистидина на устойчивость конформаций белка. Рассчитаны траектории молекулярной динамики полноразмерного eRFl с использованием полученных структур ЯМР фрагментов С-домена, не определенных в кристаллической структуре полноразмерного eRFl. Исследовано междоменное взаимодействие eRFl и
влияние на него конформационного состояния мини-домена и состояния протонирования имидазольных фрагментов остатков гистидина.
На основании полученных результатов установлены основные факторы стабилизации конформаций мини-домена и сделаны предположения о функциональной роли С-домена в процессе терминации трансляции.
Практическая значимость работы
Полученные результаты дополняют имеющиеся данные о структуре eRFl человека и представляют новую информацию об организации фрагментов белка, структура которых была неизвестна ранее. Установление структуры мини-домена 329-372 позволило исследовать детали молекулярного механизма междоменных взаимодействий в факторе терминации трансляции eRFl человека методами молекулярной динамики и сделать рациональный выбор мутаций аминокислотных остатков в области мини-домена для исследования их влияния на уровень терминационной активности фактора. Результаты работы позволили расширить понимание молекулярных основ регуляции процесса терминации трансляции и выдвинуть новые экспериментально обоснованные предположения о функции С-домена eRFl человека в этом процессе.
Апробация работы
Основные положения данной работы и ее результаты были представлены на семи международных конференциях и научных школах:
International Youth Scientific School "Actual problems of magnetic resonance and its application", 23-28 September, 2007, Kazan, Russia.
XV International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists "Lomonosov", 8-11 April, 2008, Moscow, Russia.
EUROMAR 2008, 6-11 July, St. Petersburg, Russia.
International Conference "Advances in NMR of protein and nucleic acid molecular recognition", 16-18 October, 2008, Murnau, Germany.
Joint NMR-life and Extended-NMR Meeting "New approaches to biomolecular structure determination", 27-29, October, 2008, Berlin, Germany.
XVI International Scientific Conference of Undergraduate, Postgraduate Students and Young Scientists "Lomonosov", 13-18 April, 2009, Moscow, Russia.
EMBO World Practical Course, "Structure and dynamics of biomolecules by NMR spectroscopy", 21-30, September, 2009, Rosario, Argentina.
Публикации
По материалам диссертационного исследования на момент подготовки автореферата опубликованы 1 статья в реферируемом журнале, 1 статья в сборнике трудов научной конференции и 5 тезисов докладов. 1 статья принята к печати в журнале FEBS Journal.
Структура и объем диссертации
Структура и функции erfi
Первая структура с атомным разрешением полноразмерного белка eRFl человека (437 аминокислотных остатков) была получена методом рентгеноструктурного анализа (РСА) Н. Song и коллегами в 2000 году (4). Это достижение внесло существенный вклад в понимание механизма терминации трансляции. Белок состоит из трех доменов, сочлененных гибкими линкерами, и проявляет структурно-функциональную мимикрию молекулы тРНК (Рис. 2А, Г). Выделяют N-терминальный, средний (М) и С-терминальный домены. Каждый из них несет строго определенные функции (4-6). N-терминальный домен (1-141 остатки, нумерация по eRFl человека) может быть поставлен в соответствие с антикодоновой петлей тРНК (10, 11). Было показано (12-14), что консервативные последовательности NIKS (остатки 61-64) и YxCxxxF (остатки 125-131) этого домена являются критичными для узнавания стоп кодона и обеспечивают строго специфическое взаимодействие с каждым из трех возможных терминационных триплетов UAA, UAG и UGA. Вместе с тем, механизм узнавания стоп-кодона до конца не изучен. Предполагается, что рибосома служит платформой для сборки комплекса мРНК-pPHK-eRFl и определяет геометрию расположения функциональных элементов молекул в области сайта связывания стоп-кодона (15). Непосредственно взаимодействовать с основаниями стоп-кодона могут как нуклеотиды рибосомальной РНК (16), так и аминокислотные остатки N-домена (14). Первое предположение подтверждается следующими экспериментальными данными: 1) нуклеотиды рРНК находятся в тесном контакте с основаниями тРНК (8, 17-19), 2) мутации в рРНК существенно влияют на терминацию трансляции и увеличивают процент сквозного прочитываиия стоп-кодонов (20), 3) авторами (21) было показано, что в большой субъединице рибосомы прокариот имеются 2 петли в области сайта связывания стоп кодона, аналогичные по структуре антикодоновой петле тРНК, однако несущие последовательности, комплементраные стоп-кодонам. Возможность непосредственного контакта остатков N-домена и мРНК обосновывается наблюдением специфических химических сшивок и результатами мутагенеза. Обнаружение химических сшивок между остатком лизина 63 и 4-тиоуридином, находящемся в первом положении терминационного триплета, позволило предположить, что инвариантные остатки IK консервативного фрагмента NIKS необходимы для опознавания первого уридина в стоп-кодоне (13).
Также было показано (12, 22, 23), что введение мутаций во фрагменты NIKS и YxCxxxF фактора терминации трансляции человека существенно влияют на специфичность узнавания стоп-кодонов. Результаты работ (22, 23) свидетельствуют о том, что основную роль в узнавании аденозина во втором положении стоп-кодона играют остатки С127 и F131 фрагмента YxCxxxF, тогда как Y125 необходим для успешного узнавания нуклеозида в третьем положении. М-домен Средний (М) домен (142-275 а.о.) несет инвариантную последовательность GGQ (183-185 а.о.), необходимую для гидролиза связи между синтезированным белком и тРНК. Функционально он сопоставляется акцепторной петле тРНК (24, 25). Важно отметить, что расстояние между фрагментами NIKS и GGQ в РСА структуре полноразмерного белка eRFl превышает расстояние между соответствующими функциональными элементами тРНК более чем на 20 А. Данный факт позволяет предположить, что в процессе образования терминациошюго комплекса молекула eRFl претерпевает конформационную перестройку, которая ведет к уменьшению расстояния между NIKS и GGQ (4, 26). Гидролиз связи между вновь синтезированным белком и ССА 3 концом молекулы транспортной РНК происходит в пептидилтрансферазном центре (ПТЦ) рибосомы. ПТЦ располагается в большой субъединице между A PI Р сайтами и является самым консервативным участком рибосомы. ПТЦ формируется исключительно нуклеозидами молекулы рРНК и не включает аминокислотные остатки рибосомальных белков (27). На текущий момент предполагается, что гидролиз связи пептидил-тРНК осуществляется путем нуклеофильной атаки карбоксильного углерода сложноэфирной связи кислородом молекулы воды (Рис. 3) (4, 27, 28). Образуется тетраэдрический интермедиат. Далее происходит перенос протона на 2 (3 )-гидроксил 3 концевого аденозина пептидил-тРНК и разрыв сложноэфирной связи. Для эффективного протекания реакции необходима правильная координация молекулы воды относительно объекта нуклеофильной атаки. Подобная каталитическая активность может проявляться как нуклеозидами рРНК, так и аминокислотными остатками М-домена eRFl, расположенными в ПТЦ. Известно, что самопроизвольный гидролиз сложноэфирной связи в ПТЦ протекает в отсутствии факторов терминации трансляции, однако его скорость очень невелика и составляет 1 реакцию на 14 часов для прокариотического терминационного комплекса (29). Многочисленные исследования функций субъединиц рибосомы показали (30-33), что поддержание корректной структуры ПТЦ необходимо для эффективного гидролиза связи пептидил-тРНК. Из этих данных следует предположение, что нуклеозиды ПТЦ рибосомы не осуществляют кислотно-основной катализ реакции и служит каркасом для координации ССА 3 фрагмента тРНК, GGQ петли eRFl й молекулы воды.
Рисунок 3. Схема гидролиза сложноэфирной связи в пептидилтрансферазном центре большой субъединицы рибосомы (27). Петля GGQ М-домена eRFl располагается непосредственно в ПТЦ (8, 14). Было показано, что мутации любого из двух остатков глицина трипептида приводят к подавлению гидролиза сложноэфирной связи, но не влияют на способность eRFl связываться с претерминационным комплексом (25, 29, 34, 35). Предполагается, что данные остатки глицина играют структурирующую роль и опосредуют правильное расположение петли в ПТЦ. Функция глутамина до конца не ясна. Предположение о том что именно этот остаток координирует молекулу воды (4) плохо согласуется с экспериментальными данными, согласно которым мутации Q185G и Q185R (нумерация по eRFl человека) приводит к снижению активности eRFl in vitro лишь на 50% (34). Однако, любые мутации остатков этого фрагмента как в эукариотах так и в прокариотах оказывались летальными (4, 36). Интересно отметить, что факторы терминации трансляции первого класса Е. coli (37) и S.cerevisiae (38) подвергаются пострансляционному процессингу и оказываются метилированы по Ns положению глутамина петли GGQ. В клетках дрожжей метилирование осуществляется в цитоплазме. Метилтрансфераза, представлена в виде гетеродимера двух белков: каталитической субъединицы YDR140w и цинк связывающего белка YDR046w (39). Процесс протекает только в присутствии eRF3 и является существенным для поддержания терминационной активности фактора. Метилирован ли человеческий eRFl неизвестно. Этот вопрос будет дополнительно прокомментирован в обсуждении результатов данной работы. С-домен Структура и функции С-теминалыюго домена eRFl (276-437 остатки) наименее изучены. C-eRFl можно разделить натри структурных субдомена: основное ядро 276-328, 373-413, мини-домен 329-372 и С-терминальный неструктурированный фрагмент 414-437. На данный момент существуют 2 экспериментальные структуры С-домена: одна в составе свободного полноразмерного белка eRFl (код в банке данных PDB 1DT9), другая - в составе eRFl в комплексе с eRF3 (3E1Y). Обе модели получены методом РСА и в обеих для С-домсна определены только координаты атомов основного ядра.
Методы спектроскопии ямр для определения структуры биологических макромолекул в растворе
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в растворе является одним из наиболее мощных инструментов определения трехмерной структуры биомолекул. Ограничения и возможности ЯМР интересно рассмотреть в сравнении с методом рентгеноструктурного анализа, другим широко распространенным методом, позволяющим определить структуру атомного разрешения белка. К преимуществам ЯМР можно отнести следующие возможности: Структура белка определяется непосредственно в растворе. Понимание организации третичной структуры в нативных условиях является важным условием для интерпретации функциональной роли биомолекулы. Многочисленные исследования (97, 98) показали, что укладка третичной структуры отдельных доменов белковой глобулы в кристалле и в растворе меняется незначительно. Обычно отличия состоят в небольших отклонениях относительной ориентации элементов вторичной структуры (99). В то же время, взаимное расположение доменов может меняться существенно (100). Активно развивающиеся в настоящее время ЯМР методики исследования структуры белков, основанные на измерении констант остаточного диполь-дипольного взаимодействия (КДДВ), позволяют определять относительную ориентацию жестких структурированных элементов белка в растворе при наличии его трехмерной модели, не прибегая к повторному полному определению структуры белка (101, 102). Некоторые белки содержат фрагменты, координаты атомов которых не могут быть определены методом РСА. Этими элементами могут являться как неструктурированные участки белковой цепи, так и подвижные фрагменты, обладающие структурой, которая дестабилизируется в процессе кристаллизации. В последнем случае ЯМР позволяет получить исчерпывающую структурную информацию. Эта информация может быть крайне важна, т.к. подвижные фрагменты белковой цепи часто задействованы в формировании активных центров ферментов (24).
Хорошим примером белка с частично не определенной методом РСА структурой является исследованный в данной работе С-домен eRFl. В структуре eRFl, полученной методом рентгеновской кристаллографии, отсутствуют координаты атомов мини-домена 329-372 и С-терминального фрагмента 414-437 (4). Эксперименты по измерению скоростей продольной и поперечной релаксаций в сочетании с измерением гетсроядреных ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО) для ядер 15N амидных фрагментов основной цепи дают информацию о молекулярных движениях в пико- наносекундной шкале времени (103-105). Измерение величин остаточных КДДВ в различных слабо ориентированных средах позволяет исследовать динамику колебаний как отдельных связей, так и целых доменов друг относительно друга в субмилисекундном временном интервале (100, 106, 107). Скорости обмена подвижных протонов на дейтерий (108) и изменение изотропного химического сдвига в процессе конформационного обмена (109) предоставляют информацию о более медленных движениях. Метод является крайне чувствительным к слабым взаимодействиям. ЯМР позволяет определять интерфейс белок-лигантдного взаимодействия при Кд порядка 10"3 М (ПО). Это свойство активно используется в методиках ЯМР-скрининга для поиска и оптимизации новых лекарственных соединений (111). Наряду с весомыми преимуществами, ЯМР обладает и рядом недостатков: Ограничение на молекулярную массу исследуемой биомолекулы. С увеличением молекулярной массы возрастает скорость релаксационных процессов, что вызывает уширение пиков вплоть до полного их исчезновения. Одновременно растет и число наблюдаемых сигналов в спектрах ЯМР. Это приводит к интенсивному перекрыванию пиков, снижает возможность адекватного анализа спектра и повышает вероятность ошибочной интерпретации спектральных данных. Аналогично, эффект перекрывания пиков наблюдается, если в молекуле белка присутствуют неструктурированные фрагменты: сигналы атомов таких участков аминокислотной цепи попадают приблизительно в одну и ту же область спектра, содержащую, в то же время, сигналы атомов структурированных элементов белка. Наиболее критичным оказывается перекрывание сигналов в спектрах NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY), по интенсивности которых определяются межатомные расстояния. Длительность процедуры определения структуры Методология обработки и интерпретации спектральных данных слабо автоматизирована, что делает процесс определения структуры относительно больших (более 100 а.о.) белков достаточно трудоемким. В то время как получение структуры РСА в среднем занимает около месяца с момента подготовки образца, для определения структуры ЯМР высокого качества нужно не менее года. Высокая стоимость изтопно меченных образцов. В настоящее время методология ЯМР активно развивается. Разрабатываются новые подходы для улучшения качества спектров и извлекаемой из них информации. Метод TROSY (Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy) (112) позволяет существенно уменьшить ширину пиков. Введение многомерной (3D и более) спектроскопии на образцах, меченных изотопами 13С и 15N, значительно снижает процент перекрывания сигналов (113). Аналогичной цели служат методики частичного или полного дейтерирования образцов и избирательное введение изотопно меченных аминокислот.
С применением данных подходов удается получить отнесение химических сдвигов ЯМР для белков с молекулярной массой до 100 кДа. Из анализа спектров ЯМР была получена интересная информация об организации мультисубъединичного комплекса шаперона 900 кДа (114). Тем не менее, оптимальными объектами для исследования методом ЯМР остаются сравнительно небольшие белки молекулярной массой до 30 кДа. Подставляя в выражение (5) численные значения гиромагнитного отношения для ядер Н у = 2.67 10 8 1/(Тс) и значение В0=14.09 Т, соответствующее частоте резонанса ядер 1Н 600МГц, получаем ДЕ=6.3 10 26Дэ1с. Эта величина мала в сравнении со средней энергией тепловых колебаний при комнатной температуре Е2язк =кТ=4.04 10 Дою. Таким образом, разница заселенностей двух энергетических уровней, рассчитываемая в соответствии с распределением Больцмана, оказывается невелика при температуре измерения. Это объясняет относительно низкую чувствительность метода и, как следствие, высокие требования к концентрации белка в образце (около 1 тМ для успешного накопления многомерных ЯМР спектров). Химический сдвиг При помещении исследуемых молекул в магнитное поле, возникает диамагнитный момент, обусловленный орбитальным движением электронов. Это движение электронов образует эффективные токи, которые создают вторичное магнитное поле, пропорциональное, в соответствии с законом Лоренца, полю В0 и противоположно направленное. Таким образом, локальное поле в том месте, где находится исследуемое ядро, равно: Вэфф=В0(1-а), (7) где с — константа экранирования. Химический сдвиг характеризует отклонение частоты резонанса данного сорта ядер относительно стандарта и определяется выражением: где со0 - несущая частота, со и coref частоты резонанса данного ядра и стандарта соответственно. Величина химического сдвига крайне чувствительна к химическому окружению атома. Это позволяет определять вторичную структуру белка путем сравнения экспериментально измеренных величин химических сдвигов с аналогичными величинами, известными для белков с определенной трехмерной структурой (115).
Структура c-Flomehaerfl
Статистическая характеристика семейств, включая величины средних квадратичных отклонений координат атомов, представлена в таблице 6. Детальный анализ NOESY спектров позволил идентифицировать ряд ограничений на межатомные расстояния, различающиеся для двух конформеров белка. Кроме того, было установлено, что в растворе фосфолипидных бицелл DMPC/DHPC, как и в растворе отрицательно заряженных бицелл DMPC/DHPC/SDS, на 90% присутствует только один из конформеров, тогда как в разбавленной анизотропной среде, приготовленной на основе смеси СігЕ5/п-гексанол, устойчив только второй конформер. Это обстоятельство дало возможность определить величины КДДВ для каждого из конформеров белка в отдельности и получить индивидуальные наборы ограничений для каждого из состояний. Далее конформер, устойчивый в DMPC/DHPC будет называться открытым, а конформер, присутствующий в среде Сі2Е5/п-гексанол - закрытым. Как было указано выше, ориентирующая сила среды DMPC/DHPC оказалась недостаточной для измерения КДДВ с хорошей точностью, поэтому в расчетах использовались КДДВ, полученные в двух других средах. Электростатические и морфологический свойства сред значительно отличались: DMPC/DHPC/SDS содержит бицеллы плоской формы с отрицательным зарядом поверхности (131), а среда С12Е5/П-гексанол состоит из нейтрально заряженных частиц цилиндрической формы (135). В связи с этим тензоры порядка в этих средах также оказались различными. Таблица 5. Параметры тензора порядка. Изображение репрезентативных структур двух рассчитанных семейств приведено на рисунке 20. В структурах обоих конформеров можно выделить три основных фрагмента: (1) структурное ядро белка (остатки 277-328 и 373-413) (2) мини домен 329-373; и (3) неструктурированный С-терминальный фрагмент 414 - 437. Структура основного ядра белка идентична в обоих конформерах и находится в полном соответствии со структурой РСА 1DT9. Она образована четырьмя р-тяжами PI, (32, рб и Р7 (остатки 301-303, 320-323, 389-392 и 409-412 соответственно) формирующими единую Р-структуру белка, окруженную четырьмя а-спиралями al, a2, a4 и a5 (остатки 278-294, 305-313, 374-381 и 397-405 соответственно).
Среднее квадратичное отклонение по тяжелым атомам основной цепи (Са, С и N) от кристаллографической структуры eRFl составляет 1.58 ± 0.06 А. Структура мини-домена 329-372, координаты атомов которого отсутствуют в ранее опубликованных кристаллических структурах eRFl человека, сформирована тремя антипараллельными р-тяжами рз, Р4 и Р5 (остатки 329-335, 339-344 и 367-372 соответственно) и искаженной а-спиралью аЗ (остатки 348-356). Установлено, что элементы вторичной структуры мини-домена 329-372 практически идентичны для обоих конформеров. Наиболее существенными структурными различиями между конформерами являются положение искаженной а-спирали по отношению к Р-структуре и сопутствующий сдвиг петли 357-266 (Рис. 21). Положение боковой группы остатка His356 также существенно отличается: в одном из конформеров (называемом «открытым») боковая группа His356 позиционируется вблизи ароматических колец ТугЗЗІ и Phe357 (Рис. 21 А), тогда как в другом конформере (называемом «закрытым») имидазольное кольцо боковой группы гистидина пространственно сближено с отрицательно заряженными боковыми группами Glu365 Различные ориентации петли 357-366 по отношению к искаженной а-спирали соответствуют различным конформациям основной цепи Phe 357 (величины диэдральных углов составляют -60 ±3 (ф) и -38 ± 4 (і//) в открытом конформере и +57 ± 3 (ф) и +6 ± 4 {у/) - в закрытом), что полностью согласуется с наблюдаемыми различиями в интенсивностях ЯЭО HN357- HN358 в спектрах NOESY. Перестройка конформации основной цепи приводит и к изменению расстояний между атомами остатков верхнего витка искаженной а-спирали, что также соответствует изменению ЯЭО в спектрах (Рис. 22). Наиболее существенно меняется расстояние между атомами HN358 -На355: кросс пик наблюдается только для открытого конформера, в то время как ЯЭО HN358 - На наблюдается в обоих случаях. Структура центральной части петли 357- Рисунок 22. Фрагменты спектров 366, соответствующая фрагменту 359-363, [ H,15N]-NOESY HSQC для идентична в обоих конформерах. Это открытого (левый) и закрытого подтверждается большим количеством (правый) конформеров, в которых интенсивных ЯЭО, соответствующих контактам наблюдается различия в между удаленными по цепи аминокислотными интенсивностях сигналов, остатками. Структура петли может стабилизироваться водородной связью между кислородом карбоксильной группы Asp359 и протонами HN Thr362 и Gly363, а также гидрофобным взаимодействием метальных групп остатков Thr358 и Thr362 и СН2 протонов остатка Asp359 (Рис. 6). Среднее по семейству ЯМР структур расстояние между атомами кислорода СО Asp359 и протона HN Thr362 в открытом конформере 2.34 ± 0.01 Айв закрытом 2.56 ± 0.26 А; соответствующие расстояния для СО Asp 359 - HN Gly363 составляют 1.70 ± 0.02 А и 1.87 ± 0.10 А для открытого и закрытого конформеров соответственно Повышение температуры от 298 до 313К ведет к существенному снижению интенсивности кросс пиков ЯЭО от HN Gly 337, а также ЯЭО между атомами HN Thr358 - На His356 и HN Thr338 - HN Glu339 в открытом конформере. При этом интенсивности аналогичных сигналов в закрытом конформере остаются неизменными.
Такой эффект для сигналов Gly337 можно объяснить увеличением скорости обмена амидного протона с водой. Этот вывод подтверждается наблюдением интенсивного обменного сигнала между резонансом HN Gly 337 и воды. Уменьшение интенсивности кросс-пиков между соседними остатками для Thr338 и Thr358 может быть обусловлено динамическими процессами. Указанные данные свидетельствуют о том, что петля 336-338, а также фрагмент 356-358 в открытом конформере оказываются более подвижными при повышении температуры, чем в закрытом. Для остатков His334, Leu368, Пе369 и Glu370 наблюдается существенное сужение линий и повышение интенсивностей сигналов HN кросс пиков при увеличении температуры от 298 до 313К. Этот эффект объясняется ростом скорости конформационного обмена с повышением температуры, т.к. для этих остатков не обнаружено кросс пиков между амидными протонами и водой. His334 находится на центральном тяже 3-листовой пластины мини-домена и пространственно сближен с остатками Leu368, Пе369 и Glu370, что объясняет одинаковый характер конформационных перестроек, происходящих в остатках, находящихся далеко друг от друга в аминокислотной последовательности белка. В спектрах [ H/ -HSQC наблюдалась незначительная разница в интенсивностях сигналов для двух конформеров, что является свидетельством приблизительно одинаковой населенности обоих конформационных состояний. Было проведено исследование стабильности конформеров в зависимости от температуры, ионной силы и рН раствора. Обнаружено, что в диапазоне температур от 5 до 40С, а также при увеличении концентрации NaCl в растворе от 50 до ЮОмМ оба конформера остаются стабильными и сдвиг равновесия в сторону какой-либо одной формы не наблюдается. При изменении рН раствора в диапазоне от 6.0 до 8.0 также не наблюдается изменений в населенностях конформеров, однако, при понижении рН ниже 6.0 наблюдается медленная агрегация, которая существенно ускоряется при рН ниже 5.4. Процесс преципитации обратим, однако после рефолдинга белка из кислого раствора (рН 3.5) в смеси наблюдается только закрытый конформер. Важно отметить, что рН 6.0 соответствует рКа протонирования боковой группы имидазольного кольца остатков гистидина.
Стабилизация конформаций мини-домена
Населенность двух конформационных состояний C-eRFl в растворе приблизительно одинакова, что следует из близкой интенсивности сигналов двух конформеров. Следовательно, энергии образования конформеров должны быть приблизительно одинаковы. Вместе с тем, принимая во внимание сравнительно большие времена жизни двух состояний, энергетический барьер конформационного перехода должен быть достаточно велик. Возможны два варианта стабилизации конформации. Мини-домен содержит два остатка пролина в положениях 348 и 372. Можно было предположить, что цис-транс изомеризация этих остатков приводит к образованию двух конформации мини-домена. Однако удвоения сигналов не наблюдается ни для остатков пролина ни для находящихся в непосредственной близости по аминокислотной цепи других остатков. Таким образом, цис-транс изомеризация пролинов не может быть причиной образования двух конформации мини-домена. Второй вероятный путь стабилизации состояний может быть связан с образованием сети ионных взаимодействий между полярными группами аминокислотных остатков мини-домена. Этот путь стабилизации состояний детально рассмотрен выше и подтвержден, как экспериментальными структурными данными, так и расчетами молекулярной динамики. В соответствии с экспериментальными данными, ключевым различием между двумя конформациями является положение боковой группы остатка His 356 (сближенного с отрицательно заряженными карбоксилиьными группами остатков Glu365 и Glu357 в закрытом конформере и с боковыми группами остатков ТугЗЗІ, Phe357 и Gln350 в открытом), а также различная ориентация искаженной ос-спирали и петли 357-366 по отношению к р-листовой пластине мини-домена. Расчет молекулярной динамики показал, что стабилизация положения боковой группы His356 в закрытом конформере действительно осуществляется за счет образования полярных контактов между имидазольным кольцом остатка His356 и карбоксильными группами Glu365 и Glu357. В случае открытого конформера, имидазальное кольцо позиционируется внутрь мини-домена в область гидрофобного кармана за счет образования 7г-стэккинг взаимодействия с ароматическими группами остатков ТугЗЗІ и Phe357.
При протонировании имидазольного кольца остатков гистидинов открытого конформера наблюдается быстрый переход His356 в положение, соответствующее закрытому конформеру. Далее происходит постепенная переориентация искаженной а-спирали и петли 357-366. Из этих данных расчета следует, что стабилизация положения имидазольного кольца His356 является ключевым элементом для формирования открытой или закрытой конформаций мини-домена. Агрегация белка при понижении рН ниже рКа имидазольного фрагмента остатков гистидина может быть обусловлена присутствием последовательности из шести гистидинов на С-конце белка. Это предположение согласуется с результатами расчетов траектории МД: введение положительного заряда на остатки гистидинов в модельной структуре, содержащей только один гистидин на С-конце, приводит к искажению конформаций основного структурного ядра белка в результате взаимодействия С-терминального гистидина с отрицательно заряженными аминокислотными остатками центральной части С-домена eRFl человека. Характер молекулярных движений атомов основной белковой цепи С-домена eRFl является сложным. Анализ релаксационных данных 15N показал, что основное ядро белка 276-328, 373-413 является сравнительно жестким в широком интервале характеристических времен движений (от пикосекунд до минут и, вероятно, больше). Эти данные находятся в полном соответствии с результатами кристаллографического исследования полноразмерного белка eRFl человека. Мини-домен 329-372, не разрешенный в структурах РСА, присутствует в растворе в 2-х конформациях. Это свидетельствует о наличии в данной области белка сравнительно медленных движений, протекающих в шкале времени от секунд до минут. Вместе с тем, амплитуды движений остатков мини-домена, протекающих в шкале времени от пс до нс, невелики, что следует из больших величин параметра порядка S , которые по своим значениям оказываются близкими к таковым для основного ядра белка. Наиболее подвижными фрагментами мини-домена являются петли 335-339 и 357-366. Точный анализ релаксационных данных N для фрагмента 335-339 оказался невозможным из-за существенного перекрывания сигналов в спектрах корреляции ядер N и Н, однако, данные для петли 357-366 удалось проанализировать. Как видно из рисунка 25, относительные амплитуды молекулярных движений в пс-нс шкале времени для остатков петли 357-366 оказываются выше, чем для всех остальных аминокислотных остатков белка, за исключением терминального фрагмента 414-440. Из анализа величин параметра Т2 следует, что коррелированные движения атомов основной цепи в милисекундной шкале времени практически отсутствуют. Анализ релаксационных данных показал также отсутствие движений основной цепи белка, происходящих со временем корреляции около 1 нс. Это отличает характер динамики С-домена от М-домсна eRFl, в котором именно эти два типа движений были ключевыми. Можно утверждать, что более медленные конформационные перегруппировки, протекающие в шкале времени от секунд до минут, являются наиболее характерными для динамики С-домена eRFl.
Подвижность атомов основной цепи белка С-домена на протяжение траектории расчета находится в хорошем соответствии с данными релаксационных экспериментов для всей аминокислотной последовательности. Все эксперименты ЯМР из которых были получены пространственные ограничений для расчета структуры проводились при нейтральном значении рН. Поскольку все три остатка гистидина мини-домена His334, His356 и His366 доступны для взаимодействия с молекулами воды, либо расположены непосредственно на поверхности белка, то при данном значении рН имидазольные фрагменты этих остатков не должны быть заряжены. В этих условиях в растворе наблюдаются два конформера, что хорошо согласуется с результатами моделирования. При понижении рН ниже величины рКа протонирования имидазольного фрагмента His (-6.0), наблюдается медленная агрегация белка, процесс ускоряется при дальнейшем понижении рН. После рефолдинга белка из кислой среды в растворе присутствует только закрытый конформер. Эти данные также хорошо согласуются с результатами расчета МД, согласно которым при наличии положительного заряда на остатках гистидина, открытый конформер быстро переходит в закрытый. В спектрах ЯМР для открытого конформера наблюдалось исчезновение сигналов ЯЭО HN Thr358 - На His356 и HN Thr338 - HN Glu339, а также увеличение скорости протонного обмена для остатка Gly337 при повышении температуры. Эти данные свидетельствуют о повышенной подвижности открытого и непротонированного конформера по сравнению с закрытым при температуре 313К, что находится в полном соответствии с результатами расчета, согласно которыми подвижность открытого и непротонированного конформера в области петли 335-338 и верхнего витка искаженной спирали 348-356. оказывается выше чем подвижность закрытого и непротонированного конформера. В тоже время по результатам расчета следует ожидать более высокой подвижности а-спирали 348-356, чем это предсказывается из экспериментальных данных. Этот факт может быть объяснен недостаточной параметризацией тг-стэккинг взаимодействий в неполяризуемых полях.
