Введение к работе
'Актуальность проблемы.
Na ,К -АТФаза осуществляет АТФ-завискмое перераспределение ионов Na+ и к!" между клеткой и внеклеточной средой, против градиента концентраций этих ионов. Этот фермент присутствует во всех исследованных клетках эукариот. Белок состоит fg двух субъединиц - а и р. а-субъединица формирует каталитический центр, участки связывания Na+, К+ и сердечных, гликози.т:-'-» {Llngrel J.В. et al 1989). р-субъединица обладает рецепторяой функцией (Gloor S. et al., 1990) и облегчает вс-р-ивание а-^убъединицы в клеточную мембрану (Geerlng К. ^L al., 1989). Функциональные исследования Na+,K+-AT$a3H не могли дать ответа о механизме функционирования фермента без знания его первичной структуры, с ;„" .<-їрьаи исследования Na+,Kf-AT$a3H в ИБХ начались с 1985 году в лаборатории структуры и функции генома человека в сотрудничестве с лабораторией мембранных биоэнергетических систем. Была определена полная первичная структура аир субъединщ На+,К+-АТФазы из почек свиньи и создана модель расположения белковой молекулы в мембране.
Ко . времени начала данной работы было установлено, что у млекопитающих существует семейство генов а-субъединиц и определены структуры кДНК аі, ей и .аЗ субъединиц, а на уровне генома было показано, что. существуют по крайней мере ещЭ три гена а-подоСных субъединиц: ген Н1" .К^-АТФазы и гены аС и сШ, которые могут кодировать либо другие изоформы На+,К+-АТФазн, либо другие АТФазы. Следующим шагом но изучению семейства генов а субъединиц На+,К+-АТФазы явилось изучение экспрессии отдельных субъединщ в различных тканях и 'была доказана тканеспецифичность различных изоформ. Настоящее исследование представляет собой первый этап в работе по выяснению тканеспецифичности на уровне регуляции экспрессии генов. Определение структуры промотерных областей и прилежащих к промотору, областей позволит в дальнейшем локализовать последовательности, участвующие в регуляции экспрессии и з частности обеспэчиващио ткане специфическую экспрессию. Одним из возможных методов исследований является сравнительно-структурный анализ гомологичных регуляторних областей. Наличие консервативных участков может предполагать их функциональную значимость.
Цель работы. Настоящая работа является частью обширного исследования Ма+,К4"-АТФазы , проводящегося в насем институте и за рубежом. Работа посвящена молекулярному клонированию, определению нуклеотидной последовательности и анализу регуляторних областей генов о2 и аЗ Na4 .К*"-АТФазы человека. В связи с этим в данной
работе были поставлены следующие задачи:
I. Найти в клонах, выделенных из геномных библиотек фрагменты, содержащие первый экзон и регуляторше области для генов ей и ей Na+,X+-ATG>a3H человека и определить нуклеотидную последовательность этих областей, определить точки инициации транскрипции для этих генов. 2. Провести анализ регуляторних областей изучаемых генов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы в клонах из геномных библиотек найдены гасльдпвательноста 5" концевых областей генов а2 и аЗ Na+,K+-АТФазы человека . Для гена а2 определена первичная структурі, фрагмента, длиной 5700 п. о., ( в том числе последоваїчльность части первого интрона 3600 п.о.), а для гена аЗ - 1600 к.о.с промоторная и дальняя 5' концевая области). Для гена аЗ определена точка инициации транскрипции. Проведен анализ регуляторних областей изучаемых генов и выявлены потенциальные регуляторше элементы. Методом сравнительно-структурного анализа выявлены консервативные последовательности, которые, вялимо играют определённую роль в функционировании генов а субъединиц. Эти исследования, с одной стороны уже дают общее представление о типе исследуемых промоторов, а с другой стороны они необходимы для последующей точной локализации' и детальной характеристики промоторных и энхансэрных элементов при помощи направленных делеций, мутаций и других генноинкенерных методов исследования регуляции экспрессии.
Объём работы. Диссертационная работа изложена на 89 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуздения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (127 ссылок).
