Содержание к диссертации
Введение
Методы количественного определения пептидов и их применение (обзор литературы) 7
Введение 7
Проблема эндогенности 8
Подготовка образца 10
Экстракция 10
Преципитационная очистка 12
Ультрафильтрация и диализ. 12
Хроматографическая очистка 13
Твердофазная экстракция 17
Оптимизация процесса пробоподготовки 18
Биологические методы 19
Иммунохимические методы 20
Методы с использованием антител 20
Радиорецепторный метод 25
Хроматографические и смежные методы 27
Пептидомика 38
Заключение 42
Результаты и обсуждение 44
Оценка стабильности пептидного состава ткани 44
Выделение эндогенных внутриэритроцитарных пептидов 51
Методика количественной оценки по площади пика 61
Выделение пептидов из экстрактов тканей крысы 64
Заключение
Экспериментальная часть 96
Анализ состава лизата эритроцитов человека 96
Получение биологического материала 96
Хроматографический анализ лизата 96
Первичная обработка биологического материала 96
Получение пептидной фракции 97
Хроматографический анализ пептидной фракции 97
Выделение пептидов 98
Выделение неокиоторфина 99
Количественная оценка 99
Масс-спектрометрический анализ 99
Установление структуры 100
Анализ состава экстрактов тканей крысы 100
Получение биологического материала 100
Экстракция 100
Первичное фракционирование 101
Хроматографический анализ 101
Количественная оценка 102
Масс-спектрометрический анализ 102
Установление структуры 102
Выводы 103
Список литературы
- Проблема эндогенности
- Выделение эндогенных внутриэритроцитарных пептидов
- Первичная обработка биологического материала
- Хроматографический анализ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования состава низкомолекулярных фракций экстрактов тканей млекопитающих и демонстрация наличия биологической активности у отдельных компонентов привели к формированию концепции пептидного профиля ткани [Slemmon JR, 1997], тканеспецифичного пептидного пула [Karelin АА, 1998], или пептидома, как логического расширения понятия протеома [Ivanov VT, 2000] Показано, что основными компонентами пептидома являются фрагменты функциональных белков, некоторые из которых способны проявлять эффекты, аналогичные действию гормонов и нейромедиаторов [Nyberg F, 1997], для многих из них показана способность влиять на пролиферацию опухолевых клеток [Ivanov VT, 2003] Предполагаемой функцией пептидных комплексов в организме является поддержание тканевого гомеостаза [Ivanov VT, 2005] Количественное исследование пептидного состава тканей, биологических жидкостей и культур клеток актуально, т к является первым и основным шагом к пониманию механизмов формирования пептидома, а также к оценке биологической роли эндогенных фрагментов функциональных белков как в индивидуальном плане, так и в составе пептидных комплексов
Цель работы. Целью работы является исследование состава низкомолекулярных фракций лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы на наличие в них пептидных компонентов, подтверждение их эндогенности, оценка уровня их содержания и установление первичной структуры
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено полное исследование пептидного состава лизата эритроцитов человека и экстрактов мозга, сердца, легких и селезенки крысы с практическим подтверждением эндогенности идентифицированных компонентов Полученные результаты позволили сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома и изменения его состава в ответ на изменение состояния ткани Кроме того, на основании полученных результатов разработана методика приблизительной количественной оценки содержания преобладающих пептидных компонентов в сложных смесях, не требующая их глубокой очистки Методика основана на определении площадей хроматографических пиков и обеспечивает точность,
достаточную для оценки возможной биологической роли анализируемых компонентов
Апробация работы и публикации. Результаты данной работы представлены на международных (27-й Европейский и 20-й Американский пептидный симпозиумы) и российских симпозиумах с международным участием (1-й Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, III Российский симпозиум «Белки и пептиды») По материалам исследования подготовлено и опубликовано 11 печатных работ
Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 154 ссылки
Проблема эндогенности
В последнее время все более популярной методикой выделения пептидов из сложных смесей становится твердофазная экстракция — быстрый и эффективный способ очистки и концентрирования образцов для дальнейшего анализа. При твердофазной экстракции используются матрицы с различными типами модификаций, обеспечивающий адсорбцию пептидов (как правило, по распределительному или ионообменному механизму). Широкое распространение получили одноразовые картриджи для твердофазной экстракции, производимые различными фирмами. Так, в упомянутом выше примере определения пептидов различной природы в моче человека [42] твердофазная экстракция на С 18-картриджах использовалась для выделения пептидов из фильтрата (промывка 2% раствором NaCl в 0.1% трифторуксусной кислоте, элюция пептидов в системе метанол-вода-трифторуксусная кислота 80:19.9:0.1). Выбор типа модификации матрицы определяется природой анализируемого вещества. Так, при анализе взаимодействия смеси стандартных пептидов с набором обращенно-фазных картриджей различного типа (октадецил, октил, циклогексил, фенил, этил и цианопропил; промывка в 0.1% трифторуксусной кислоте, элюция последовательно 20% и 50% ацетонитрилом, содержащим 0.1% трифторуксусной кислоты) было показано, что для экстракции сильно полярных пептидов (глутатион, VGSE) требуются С 18-картриджи, а гидрофобные пептиды (WW, DRVYIHPFHLLVYS) могут быть экстрагированы с помощью гораздо менее гидрофобных Сг и CN-картриджей [52]. Примером применения твердофазной экстракции для фракционирования пептидных смесей может служить система из соединенных последовательно катионообменного (карбоксиметил, СМ) и анионообменного (четвертичный метиламмоний, QMA) картриджей [53]. Пептидный экстракт в аммоний-ацетатном буфере (рН 5.0), содержащем 20% ацетонитрила, пропускался через систему картриджей, после чего картриджи отсоединялись, и пептиды элюировались тем же буфером, содержащим 1 М NaCl. Такое разделение пептидов на три фракции (кислые, щелочные и нейтральные пептиды) существенно облегчало дальнейший анализ сложных пептидных смесей (на примере триптического гидролизата казеина). Аналогичный подход (фракционирование с помощью ионообменных картриджей) при анализе пептидного состава экстрактов мозга [7] позволил увеличить число анализируемых веществ с 50-100 до 600 и более. Оптимизация процесса пробоподготовки
Для успешного осуществления процесса подготовки образца для количественного анализа пептидов необходимо наличие надежного метода регистрации анализируемого вещества, позволяющего обнаружить его присутствие во фракциях, получаемых на каждом этапе разделения. Чаще всего используются метод регистрации анализируемого вещества с помощью специфических антител, метод синтетических стандартов, а для биологически активных веществ - метод регистрации специфической активности в биологических тестах. Поскольку иммунологические (а в ряде случаев — и биологические) методы регистрации являются количественными, их применение позволяет одновременно решить вторую важную задачу, возникающую в процессе подготовки образца - определение суммарного выхода анализируемого вещества (по совокупности результатов определения выхода на каждом этапе очистки). Различные аспекты применения иммунологических и биологических методов для количественного определения пептидов будут рассмотрены ниже.
Величина суммарного выхода исследуемого вещества в процессе пробоподготовки может быть определена и с помощью синтетических стандартов. Например, при количественном анализе эндогенных опиоидных пептидов в различных отделах мозга крысы [54] выход анализируемых веществ (Tyr-Phe, Met-энкефалин, Leu-энкефалин, сс-эндорфин, [А 6]Ьеи-энкефалин, у-эндорфин, [Arg6,Gly7,Leu8]Met-энкефалин, [Arg ,Phe JMet-энкефалин) в процессе подготовки образца (экстракция 0.1 М НС1, преципитация НСІСч, твердофазная экстракция на С is-картридже) определялся с помощью синтетических стандартов (100 пмоль/г ткани) и составил 93±4, 92+6, 85±7, 61 ±8, 86+7, 65±6, 83±7 и 84+7 % соответственно. Зависимость выхода от количества вещества компенсировалась построением для каждого из синтетических пептидов калибровочного графика зависимости отношения выхода пептида к выходу внутреннего стандарта (Tyr-Phe) от количества пептида (область линейности 10-500 пмоль/г ткани). Другой пример - определение геморфиновых пептидов в спинномозговой жидкости человека [55]. Синтетические геморфины в различных концентрациях (0.01, 0.05, 0.1 и 0.2 мкг/мл) добавлялись в контрольные образцы спинномозговой жидкости, не содержащие геморфинов. Далее образцы подвергались процедуре пробоподготовки (твердофазная экстракция на картриджах Sep-Pak Qs), содержание геморфинов анализировалось с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ и радиоиммунного анализа. Выход анализируемых веществ составлял 44-76%. Существуют и другие методы идентификации анализируемых веществ в процессе пробоподготовки, основанные на их уникальных (по сравнению с основной массой веществ в образце) свойствах. В качестве примера можно привести метод химической идентификации, использованный при выделении амидированного фрагмента основного белка миелина (рМРА14) из мозга свиньи [45]. Присутствие анализируемого вещества во фракциях в процессе пробоподготовки (экстракция 0.5 М уксусной кислотой, адсорбция на альгиновой кислоте, две стадии хроматографической очистки - с помощью гель-фильтрации и препаративной обращенно-фазной ВЭЖХ) регистрировалось по наличию С-концевого амидированного тирозина (ферментативное отщепление, дансилирование, идентификация с помощью тонкослойной хроматографии [56]).
Процедура подготовки образца обычно оптимизируется для анализа определенного вещества: в каждом конкретном случае последовательность стадий предварительной очистки подбирается таким образом, чтобы максимально простым способом обеспечить уровень очистки и выход анализируемого вещества, достаточные для успешного применения выбранного метода количественного анализа.
Выделение эндогенных внутриэритроцитарных пептидов
Как видно из таблицы, оценочные величины отличаются от истинного количества не более чем на порядок для любых пептидов. Такая точность оценки тканевой концентрации вещества является достаточной, например, для оценки его возможной биологической роли in vivo на основании результатов исследования концентрационной зависимости его биологических эффектов in vitro. Для пептидов с длиной цепи 15-45 аминокислотных остатков и содержащих триптофан и тирозин оценка является более точной (отличие не более чем в 2 - 2.5 раза). Данное обстоятельство было предложено использовать в дальнейшем для представления приблизительных количественных оценок по площади пика в виде диапазона величин, границы которого рассчитываются исходя из номинальной величины, полученной в соответствии с вышеупомянутым базовым соотношением (1000 мВ с - 500 пмоль).
Соответствие между преобладающими пиками на хроматограмме и преобладающими компонентами в анализируемой смеси было предложено устанавливать по данным масс-спектрометрического анализа (MALDIOF). Корректность такого подхода была подтверждена контрольным экспериментом по сравнению интенсивностей сигналов в масс-спектре для двух пептидов, значительно отличающихся по способности к ионизации, смешанных в различных пропорциях (от 1:10 до 10:1) и в различных исходных концентрациях (10"4 М и 10"5 М). В качестве таковых были выбраны неокиоторфин (TSKYR, MW = 653.35) и Met-энкефалин (YGGFM, MW = 573.23). Результаты представлены в Таблице 4.
Как видно из таблицы, преобладающим компонентам в смеси соответствуют преобладающие компоненты в масс-спектре. Данное обстоятельство было предложено использовать в дальнейшем для установления соответствия между хроматографическими пиками и веществами по данным масс-спектрометрического анализа соответствующих фракций. Выделение пептидов из экстрактов тканей крысы
С учетом результатов, полученных для лизата эритроцитов, была предложена менее затратная схема анализа эндогенных пептидов для тканей (мозг, сердце, легкие, селезенка) крысы. В базовые принципы построения схемы были внесены следующие изменения:
В процессе пробоподготовки набор ингибиторов различных типов протеаз (10 б М пепстатин А, 10"4 М PMSF, 2 мМ EDTA) добавляется в буфер для гомогенизации ткани (10% АсОН), для оценки эндогешюсти выделяемых пептидов параллельно готовится контрольный образец, не содержащий ингибиторов. Все операции осуществляются на холоду (0-4С) в течение минимально возможного времени (гомогенизация - 1 мин, осветление - 10 мин).
С целью повышения разрешающей способности метода, первичное фракционирование осуществляется с учетом необходимости не только максимальной очистки от белков, но и оптимального обеднения пептидных фракций по числу компонентов. Для образцов экстрактов тканей крысы применена препаративная гель-фильтрация, получены 4 пептидсодержащих фракции: (1) 2.5 -5 к Да, (2) 1.5-2.5 к Да, (3) 0.5 - 1.5 к Да, (4) 0.5 к Да + адсорбированное на матрице геля.
Состав материала пептидсодержащих фракций анализируется с помощью микропрепаративной оф-ВЭЖХ в стандартных условиях в одну стадию, с одновременным разделением материала на суб-фракции, соответствующие основным хроматографическим пикам. Количество пептидного материала во фракциях оценивается по площади пика УФ-поглощения на длине волны 226 нм. Для оценки спектральных характеристик элюируемых веществ параллельно регистрируется профиль элюции на 280 нм.
Материал суб-фракций подвергается масс-спектрометрическому анализу. Вещества, соответствующие основным сигналам в масс-спектре, идентифицируются по спектру вторичных ионов (MS/MS). (a)
В результате сравнительного анализа было показано, что отсутствие ингибиторов протеолиза приводит не к увеличению содержания имеющихся компонентов (их уровень содержания в большинстве случаев неизменен), а к появлению новых (Рис. 12). Полученные результаты свидетельствуют о принципиальном различии протеолитических механизмов, задействованных в образовании преобладающих компонентов пептидома интактной ткани и гомогената. Таким образом, преобладающие пептидные компоненты экстрактов тканей, приготовленных с использованием ингибиторов протеолиза, можно рассматривать как реально присутствующие в ткани на момент ее разрушения. Поскольку все операции с образцами интактной ткани осуществлялись на холоду и за минимально возможное время, единственным промежутком времени, в течение которого сохранялась принципиальная возможность появления артефактов ех vivo, искажающих пептидный профиль ткани in vivo, был период от момента умервщления животного до момента заморозки извлеченного органа в жидком азоте. Возможность существенного изменения пептидного профиля (по крайней мере, в отношении преобладающих компонентов) в течение этого промежутка представляется маловероятной: многочисленные примеры [1, 7-14] свидетельствуют об относительной устойчивости (по меньшей мере, в течение нескольких часов) пептидных профилей тканей к посмертным изменениям, как в целом, так и в отношении отдельных компонентов. На этом основании присутствие пептида в качестве преобладающего компонента в составе экстракта ткани, полученного в присутствии ингибиторов протеолиза, можно достоверно экстраполировать к его присутствию в ткани in vivo в сопоставимом количестве, и таким образом классифицировать пептид как эндогенный.
Таким образом, по результатам хроматографического анализа все преобладающие пептидные компоненты были разделены на три группы (Рис. 12): (1) эндогенные - присутствующие в сопоставимых количествах в экстрактах, полученных как в присутствии, так и в отсутствие ингибиторов протеолиза; (2) артефакты экстракции - присутствующие только в экстрактах, приготовленных без использования ингибиторов протеолиза; (3) эндогенные пептиды, существенным образом меняющие свое содержание (как в сторону увеличения, так и уменьшения) в экстрактах в результате деградации в отсутствие ингибиторов протеолиза.
Сбор материала суб-фракций в ходе ВЭЖХ-разделения осуществлялся непрерывно, вдоль всего профиля элюции, для всех образцов. Границы фракций задавались вручную, согласно ходу профиля элюции на 226 нм (Рис. 13-16), с целью максимально отделения суб-фракций, соответствующих основным хроматографическим пикам. В качестве таковых рассматривались пики, не менее чем десятикратно превышающие по высоте положение общей базовой линии.
Первичная обработка биологического материала
Большинство (47 из 49) идентифицированных эндогенных гемоглобиновых пептидов аналогично внутриэритроцитарным пептидам образуют группы N- и С-концевых фрагментов различной длины: 14 (7 пар) N-концевых фрагментов обоих вариантов а-цепи в диапазоне от 1-9 до 1-34, 9 С-концевых фрагментов а-цепи в диапазоне от 134-141 до 106-141, 19 (12 - за вычетом парных) N-концевых фрагментов обоих вариантов Р-цепи в диапазоне от 1-10 до 1-33, 5 С-концевых фрагментов Р-цепи в диапазоне от 139-146 до 120-146. Эндогенные фрагменты сывороточного альбумина также образуют группу, предположительно сформированную процессом последовательной экзопептидазной деградации: 25-48, 25-49 и 25-50. Кроме того, среди остальных идентифицированных эндогенных пептидов многие являются N- и С-концевыми фрагментами функциональных белков.
На основании этого сходства можно предположить, что механизм образования эндогенных фрагментов гемоглобина и других функциональных белков в тканях аналогичен предложенному для эритроцитов: квазиравновесный (стационарный) процесс последовательной экзопептидазной деградации первичных (эндопептидазных) фрагментов белка, при котором в тканях детектируется присутствие лишь его наиболее устойчивых (долгоживущих) промежуточных продуктов. Можно также предположить сходство механизмов первичного расщепления цепей гемоглобина в тканях и в эритроцитах (гемоглобины человека и крысы имеют одинаковый структурный мотив -лабильная связь Asp-Pro в позициях 94-95 в а-цепи и 99-100 р-цепи). При этом, уровень тканевого содержания N- и С-концевых фрагментов гемоглобина в тканях в среднем на порядок превосходит уровень содержания аналогичных пептидов в эритроцитах, что не позволяет рассматривать присутствующие в тканях эритроциты в качестве непосредственного источника выделяемых из тканей гемоглобиновых пептидов. Таким образом, общий механизм возникновения первичных тканевых фрагментов гемоглобина in vivo остается неясен.
ч, Среди пептидов, идентифицированных как артефакты, образующиеся в процессе выделения в отсутствие ингибиторов протеолиза, также наблюдаются аналогичные структурные группы, но на основе других участков последовательности гемоглобина, либо же из иных белков: (1) фрагменты 17-31, 13-31, 13-29 а-цепи гемоглобина; (2) фрагменты 32-45, 32-44, 32-43, 32-42, 32-41, 33-41 Р-цепи гемоглобина; (3) С-концевые фрагменты 349-374, 355-374, 356-374 р(у)-актина; (4) фрагменты 308-323, 308-324, 311-324 глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Можно предположить, что образование этих групп подчиняется тем же закономерностям, что и у эндогенных пептидов (последовательная экзопептидазная деградация, наблюдаются лишь наиболее устойчивые продукты), при иной специфичности первичного эндопептидазного расщепления белка-предшественника. В частности, для гемоглобина, с учетом присутствия в тканях эндогенных фрагментов а(1-34) и р(1-33), появления фрагмента а(1-32) в качестве артефакта и резкого (на порядок) увеличения содержания фрагмента Р(1-31), предполагаемыми сайтами первичного расщепления в отсутствие ингибиторов протеолиза, не реализующимися при эндогенной деградации, являются связи Met32-Phe в a-цепи и Leu -Leu в Р-цепи. В целом, на основании полученных данных можно предположить, что число сайтов первичного эндопептидазного расщепления белков, реализующегося в гомогенизированной ткани в кислых условиях, больше, чем в случае их эндогенной деградации.
На основании полученных результатов можно сформулировать предполагаемые механизмы формирования пептидома ткани, поддержания постоянства его состава и возникновения изменений:
Пептидом ткани в норме представляет собой квазиравновесный (стационарный) набор промежуточных продуктов процесса последовательной экзопептидазной деградации первичных фрагментов тканевых белков. При этом, в детектируемых количествах присутствуют лишь наиболее долгоживущие промежуточные продукты этого процесса, т.е. те, для которых константа скорости образования в достаточной мере превышает константу скорости распада.
Количественные изменения в пептидоме (т.е. изменения уровня содержания отдельных преобладающих компонентов без потери ими статуса преобладающих) происходят преимущественно вследствие изменения локальных констант скоростей на тех или иных этапах процесса последовательной деградации пептидов (т.е. вследствие изменения состава и/или уровней активности в наборе тканевых экзопептидаз).
Качественные изменения в пептидоме (т.е. изменения состава набора преобладающих компонентов, исчезновение ранее присутствовавших и появление новых) происходят преимущественно вследствие изменения состава набора первичных фрагментов белков (т.е. вследствие изменения состава и/или уровней активности в наборе тканевых эндопептидаз).
Разделение механизмов количественных и качественных изменений не абсолютно, Количественные изменения могут быть вызваны изменением интенсивности (без изменения специфичности) первичной фрагментации; качественные изменения могут быть вызваны существенными изменениями аминокислотной специфичности процесса экзопептидазной деградации пептидов (т.е. в результате перехода количественных изменений в качественные).
Хроматографический анализ
Проблема эндогенности исследуемых веществ прямо или косвенно касается всех аспектов данной работы. Полученные в работе результаты показывают, что принятые для инактивации протеолиза меры (рН 3.5, ингибиторы) достаточны для предотвращения изменений в пептидном профиле ткани в процессе ее гомогенизации и экстракции пептидов. Тем не менее, в отношении проблемы эндогенности данный подход имеет ряд очевидных ограничений.
Во-первых, невозможно полностью исключить образование наблюдаемых пептидов в процессе гомогенизации ткани под действием неких гипотетических короткоживущих (и потому не обнаруживаемых при сравнительном анализе образцов, приготовленных с разницей во времени инкубации) и нечувствительных к предложенному набору ингибиторов протеаз, активных при рН 3. Хотя, согласно базе функциональных данных ферментов BRENDA (http://www.brenda-enzymes.info) существование таких протеаз маловероятно.
Во-вторых, стабильность гомогенатов тканей в присутствии ингибиторов протеолиза строго показана лишь в отношении преобладающих пептидных компонентов. Эндогенность минорных компонентов в рамках данного подхода гарантирована быть не может, и требует отдельного рассмотрения.
В третих, несмотря на принятые меры для предотвращения изменений пептидного состава тканей ex vivo (минимизация рабочей температуры и длительности процедур в операциях с интактной тканью), соответствие наблюдаемых пептидных профилей составу пептидома тканей in vivo следует считать лишь приблизительным или гипотетическим. Тем не менее, основываясь на известных данных о характерных скоростях посмертной генерации или деградации пептидов в тканях, присутствие преобладающих (по меньшей мере, наиболее представленных) пептидных компонентов в экстрактах тканей, процедура приготовления которых предусматривает инактивацию протеолитических ферментов, можно надежно экстраполировать к их присутствию в тканях in vivo в сопоставимых концентрациях.
Вообще говоря, проблема эндогенности распадается на два аспекта, общий и частный. Если под общей эндогенностью понимать присутствие исследуемого вещества в организме в состоянии физиологической нормы при отсутствии внешних воздействий, то проблема не имеет строгого решения в силу недостаточной определенности этих понятий. В любом исследовании речь всегда идет о конкретном объекте (или наборе сходных объектов), находящихся в определенных условиях, то есть о частном случае физиологической нормы для данной группы организмов и данного набора внешних факторов. Проблема же частной эндогенности, если под эндогенностью понимать точное количественное соответствие между наблюдением исследуемого вещества в ходе анализа и его реальным присутствием в организме на момент анализа, также не имеет строгого решения: сам процесс анализа неизбежно влияет на состояние анализируемого объекта. Особенно это касается традиционно используемых инвазивных методов анализа, нарушающих связность объекта. Поскольку живой организм является гетерогенной и не равновесной, но квазиравновесной системой (т.е. локальный уровень содержания любого компонента определяется локальным равенством скоростей его образования из предшественников и распада на продукты), изоляция любой его части (или же прекращение жизнедеятельности организма) немедленно запускает процесс изменения уровней содержания компонентов.
Таким образом, эндогенность, как общая, так и частная, является абстрактным понятием, для которого возможна лишь та или иная степени приближения со стороны реальных результатов, последовательно от «менее эндогенных» к «более эндогенным» веществам. В случае общей эндогенности это достигается - в широком смысле -накоплением статистического материала. В случае частной - последовательным выявлением и компенсацией возможных путей изменения концентрации анализируемых веществ в ходе анализа. В обоих случаях важное значение имеет применение различных методических подходов: сопоставление результатов, полученных разными путями, делает более обоснованной экстраполяцию полученных реальных результатов к идеальному состоянию.
Следует, однако, учитывать, что результаты пептидомных исследований критически зависят от процедур, применяемых в ходе пробоподготовки и анализа, что затрудняет корректное накопление статистических данных и прямое сопоставление результатов, полученных в разных исследованиях. Сколь бы ни были стандартизованы системы подготовки образцов, их неизбежные индивидуальные различия могут сказаться на результатах одновременного анализа большого числа веществ, хотя бы в отношении некоторых из них. Строгая стандартизация аналитических систем также невозможна: сочетание высокой эффективности разделения (совершенно необходимой при одновременном анализе большого числа веществ) и неизбежных индивидуальных различий в селективности (как результата интерференции различий аналитических систем с различиями объектов анализа) приводит к слабой воспроизводимости результатов, получаемых в однотипных аналитических системах для однотипных объектов. Тем не менее, в последнее время уделяется много внимания унификации методических подходов и технических средств в рамках крупных международных пептидомных проектов.
В рамках данной работы описан один из этапов приближения к эндогенности -компенсация изменений пептидного состава биологического образца в процессе кислотной экстракции пептидов. Выявлен механизм уменьшения степени эндогенности (активация кислых протеаз и приведение их в контакт с субстратом в гомогенате), предложен способ его компенсации (ингибиторы), проверена его эффективность (результаты сравнительного анализа), получены новые, «более эндогенные» результаты. С опорой на справочные данные (база данных функциональных характеристик протеолитических ферментов), результаты изучения пептидного состава экстрактов тканей крысы экстраполированы к эндогенности на уровне замороженного образца ткани. С опорой на литературные данные [7-13], эти результаты частично экстраполированы далее, к частной эндогенности in vivo в среднем для данной группы животных.
Кроме того, сопоставление «более эндогенных» и «менее эндогенных» результатов, выявившее определенное сходство между двумя наборами пептидов, как качественное (структурные группы, преобладание гемоглобина), так и количественное (доля пептидного материала 0.1% от веса сырой ткани, число преобладающих компонентов 100, уровень их содержания 100 пмоль/г - 10 нмоль/г) не противоречит выдвинутой ранее гипотезе о биологической роли пептидома (поддержание тканевого гомеостаза путем буферизации совокупной биологической активностью индивидуальных компонентов пептидома, демпфирующей импульсное действие отдельных биологически активных факторов [2]).
