Содержание к диссертации
Введение
1. Роль белков наружной мембраны бактерии neisseria meningitidis в формировании иммунного ответа. 7
1. Эпидемиология менингококковой инфекции 7
2. Проблемы противоменингококковой иммунопрофилактики 8
3. Участие белков наружной мембраны neisseria meningitidis в индукции антибактериального иммунитета 10
3.1. Белок структурного класса 1 -РогА 12
3.1.1. Структура белка РогА и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis 13
3.1.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка РогА 15
3.1.3. Картирование В-эпитопов белка РогА 17
3.1.4. Картирование Т-хелперных эпитопов РогА 19
3.1.5. Изучение иммуногенных свойств белка РогА с помощью синтетических пептидов 19
3.2. Белки структурного класса 2/3 — РогВ 21
3.2.1. Структура белков РогВ и их расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis 22
3.2.2. Антигенные и иммуногенные свойства белков РогВ 23
3.2.3. Картирование Т-эпитопов белка РогВ 24
3.3. Белок структурного класса 4 —Rmp 25
3.3.1. Структура и расположение белка Rmp в наружной мембране Neisseria meningitidis 26
3.3.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка Rmp 27
3.4. Белки структурного класса 5 28
3.4.1. Семейство белков Ора 29
3.4.1.1. Структура и расположение белков Ора в наружной мембране Neisseria meningitidis 29
3.4.1.2. Картирование В-эпитопов белков Ора 31
3.4.1.3. Картирование Т-хелперных эпитопов белков семейства Ора 31
3.4.2. Белок Орс 32
3.4.2.1. Структура, расположение белка Орс в наружной мембране Neisseria meningitidis и его функции 32
3.4.2.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка Орс 34
3.5. Железорегулируемые белки 35
3.5,1. Белки ТЬр трансферринового рецептора 35
3.5.1.1. Структура белка ТЪрВ и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis 37
3.5.1.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка ТЪрВ 37
3.5.1.3. Структура белка ТЬрА и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis 38
3.5.1.4. Антигенные и иммуногенные свойства белка ТЬрА 38
3.6. БелокNspA 39
3.6.1. Структура белка NspA и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis 39
3.6.2. Антигенные и иммуногенные свойства белка NspA 40
3.7. Белок GNA33 41
2. Результаты и обсуждение 44
1. Выбор фрагментов белков наружной мембраны neisseria meningitidis 45
1.1 Выбор фрагментов белка Рог А 45
1.2. Выбор фрагментов белка ОраВ 49
1.3. Выбор фрагментов белкаШрА 51
2. Синтез фрагментов белков наружной мембраны pora, орав и nspa neisseria meningitidis 52
3. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка pora 58
4. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка орав neisseria meningitidis 65
5. Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка nspa neisseria meningitidis 70
3. Экспериментальная часть 74
Выводы 86
- Проблемы противоменингококковой иммунопрофилактики
- Белки структурного класса 2/3 — РогВ
- БелокNspA
- Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка pora
Введение к работе
Бактерия Neisseria meningitidis вызывает инфекционное заболевание, которое приводит к высокой смертности среди заболевших людей, а в случае выздоровления - к частым осложнениям, связанным с поражениями центральной нервной системы. Без оказания, своевременной медицинской помощи смертность от менингококковой инфекции достигает 80%. Для лечения этого заболевания используют антибиотики; при этом смертность снижается до 10%, однако более эффективной и с экономической точки зрения выгодной мерой борьбы с менингококковой инфекцией на сегодняшний день является вакцинация.
По специфичности полисахарида ой капсулы менингококков делят на несколько серогрупп, причем наиболее частой причиной менингококковой инфекции являются три серогруппы - А, В и С. Против инфекции, обусловленной менингококками серогрупп А и С, разработаны довольно эффективные вакцины на основе капсульного полисахарида, которые, однако, обладают определенными недостатками (непродолжительность защитного действия и неэффективность при использовании на малолетних детях). Кроме того, вакцина против менингококка одной' серогруппы не может защищать от заболевания, вызванного менингококком другой серогруппы.
Для производства вакцины против бактерии серогруппы В полисахарид не используют по причине низкой иммуногенности данного полисахарида, который индуцирует образование только лишь IgM-антител в малых количествах, не защищающих от заболевания менингококковой инфекцией. Кроме того, антигенное сходство с молекулярными структурами эмбриональной нервной и некоторых других тканей делает полисахарид В опасным для применения в вакцине из-за вероятности развития аутоиммунных заболеваний.
В настоящий момент актуальной является задача поиска новых, отличных от полисахарида, протективных антигенов N. meningitidis с целью разработки эффективного им-мунопрофилактического препарата, защищающего в первую очередь от инфекции; вызываемой менингококком серогруппы В;
Наружная мембрана бактерии N. meningitidis содержит множество белков, к которым: во время инфекции- образуются протективные и опсовизирующие антитела. Чем больше этих антител у человека, тем менее он восприимчив к менингококковой инфекции. Идея использования белков наружной мембраны менингококка для индукции протектив-ного гуморального иммунного ответа прочно утвердилась за последние 30 лет.
Новый и перспективный подход к созданию противоменингококковой вакцины заключается в синтезе фрагментов белков наружной мембраны менингококка и в создании на их основе искусственного вакцинирующего препарата. Такой подход дает возможность проводить вакцинацию «неинфекционными» химически индивидуальными соединениями, индуцирующими строго направленный протективный иммунный ответ.
С целью выявления пептидных компонентов потенциальной искусственной вакцины против менингококка серогруппы В в рамках настоящей работы была поставлена задача выбора иммуноактивных участков трех белков наружной мембраны менингококка: РогА, ОраВ и NspA, химического синтеза этих участков и изучения их иммуногенных, антигенных и протективных свойств,
Обзор литературы посвящен обсуждению роли белков наружной мембраны N. meningitidis в формировании противоменингококкового иммунитета.
Проблемы противоменингококковой иммунопрофилактики
Доступные в настоящее время вакцины, изготовленные из очищенных капсульных: полисахаридов менингококков серогрупп А, С, Y и W135 способны защитить взрослых людей и подростков от заражения менингококками соответствующих серогрупп. В то же время полисахаридные вакцины вовсе не эффективны для детей от шести месяцев до двух лет, которые наиболее подверженной риску заболевания менингококковым менингитом [11, 12, 13, 2]. Из-за того, что капсульный полисахарид, напрямую взаимодействуя с В-лимфоцитами, не активирует Т-хелперные клетки, вакцинация полисахаридом не формирует долговременной иммунологической памяти, и защита против менингококковой инфекции сохраняется всего около трех лет [3]. Разработка же эффективной менингококковой вакцины против инфекции, вызываемой менингококками серогруппы Влетала настоящим камнем преткновения. Известно, что даже после многократных иммунизации полисахаридом В в крови взрослых людей образуются лишь малоспецифичные и не способные защищать от инфекции антитела класса М [14,15,16]. Кроме того, предполагают, что иммунизация полисахаридом В менингококка оказывает блокирующее действие. на развитие альтернативного пути активации комплемента и снижает бактерицидные свойства специфических антител [9,17]. Полисахарид В образован из остатков JV-ацетилнейраминовой кислоты. Оказалось, что такая структура имеет антигенное сродство с гликопротеи новыми клеточными адге-зинами нервных клеток - NCAM (neural cell adhesion molecule), экспрессированньши на клетках центральной и периферической нервной систем эмбриональных тканей, а также на клетках других тканей человека. С одной стороны близость структур NCAM и бактериального полисахарида В объясняет низкую иммуиогенность последнего, с другой стороны, сложилось устойчивое мнение о высокой вероятности возникновения в ответ на введение препаратов полисахарида В аутоиммунных реакций организма, а при беременности повреждения плода в результате проникновения специфичных к полисахариду IgG антител через гематоплацентарный барьер [9, 18]. Нерешенным остается вопрос быстрой диагностики менингококковой инфекции, в частности серогруппы В, которая имеет решающее значение в первые 24 часа после начала заболевания [19]. В настоящее время вопрос о разработке противоменингококковой вакцины не теряет актуальности.
Тяжесть протекания заболевания, высокий процент смертности, контингент, наиболее подверженный заражению менингококком - дети,. студенты, военные и другие представители тесных коллективов, сопутствующие расстройства центральной нервной системы, недостаточный протективный эффект имеющихся вакцин - все перечисленные факторы говорят о необходимости создания иммунопрофилактического препарата, который гарантировал бы защиту населения от эпидемических вспышек инфекции, вызываемых широким диапазоном штаммов N. meningitidis. Менингококки являются диплококками, т.е. образуют парные клетки. Строение менингококков типично для грамотрицательных микроорганизмов, к которым они относятся. В свете настоящего обзора представляется важным рассмотреть строение внешних оболочек бактерии и серологическую классификацию менингококков. Менингококки окружены полисахаридной капсулой, под которой располагаются разделенные слоем пепти-догликана наружная и внутренняя мембраны (рис. 1). Пили (фимбрии), основание которых заключено в наружной мембране, выдаются над полисахаридной капсулой клетки. Фенотипическая классификация менингококков основывается на антигенных различиях трех групп компонентов наружной мембраны: антигенные различия капсульного полисахарида являются основой для классификации W, meningitidis по серогруппам (А, В, С, Y, WI35 и т.д. - более десяти серогрутщ), антигенные различия внутри 2/3 и 1 классов главных белков наружной мембраны (см. ниже) позволяют делить менингококков на се-ротипы и серосубтипы, наконец, антигенность липополисахарида определяет иммунотип бактерии [20]. К роду Neisseria относится ряд бактерий, среди которых кроме Neisseria meningitis dis (менингококка) следует выделить Neisseria gonorrhoeae - близкого родственника N. meningitidis. Менингококк и гонококк - возбудители соответственно менингита и гонореи; - заболеваний, отличающихся по характеру развития и симптоматике. Однако оба возбудителя имеют огромное сходство в генетическом отношении: гомология ДНК микроорганизмов составляет более 80% [21]. JV. meningitidis являются грам отрицательным и бактериями и поэтому имеют множество морфологических черт, делающих их сходными с другими грам отрицательными бактериями. Достаточно сказать, что работы по установлению структуры и функций множества белков менингококка брали за основу гомологичные белки Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa. 3. Участие белков наружной мембраны Neisseria meningitidis в индукции антибактериального иммунитета Непригодность капсульного полисахарида для иммунопрофилактики, менингокок-ковой инфекции серогруппы В инициировала поиск других протективных антигенов, которыми обладает N. meningitidis. В связи с этим наиболее привлекательны антигены белковой природы наружной мембраны менингококка [3].
Интерес к белкам наружной мембраны возник благодаря следующим наблюдениям: - бактерицидность человеческих сывороток in vitro тесно связана с уровнем антител, образующихся при контакте организма с менингококком [22, 23, 24]; - эти антитела оказались направлены к белкам наружной мембраны менингококка, способны активировать систему комплемента и уничтожать менингококковые клетки [25, 26]. Наружная мембрана менингококков содержит множество белков, среди которых выделяют т.н. основные (или главные) белки наружной мембраны, железорегулируемые белки, которые жизненно необходимы менингококку, а также другие минорные низко- и высокомолекулярные белки, представители которых будут рассмотрены в настоящем обзоре. Как следует из приведенной схемы строения поверхности менингококковой клетки (см. рис, 1), последняя окружена полисахаридной капсулой, должна была бы являться барьером, ограничивающим доступ антител к антигенам, находящейся под ней наружной мембраны. Однако практика показывает, что антитела активно связываются как с бескап-сульиыми, так и с капсулосодержащими штаммами менингококка. Феномен прохода антител и молекул комплемента к наружной мембране через полисахаридную капсулу объясняют полупроницаемостью последней. В самом деле, менингококк нуждается в некоторых белках организма хозяина, таких как трансферрин и лактоферрин, с которыми должны взаимодействовать рецепторы наружной мембраны [3]. Среди белков наружной мембраны N. meningitidis в особую группу выделяют так называемые главные или основные белки. Считается, что именно эти белки вносят решающий вклад в защиту организма при менингококковой инфекции. Основные белки наружной мембраны N. meningitidis условно делят, на пять классов в зависимости от величины молекулярной массы [27]. Высокая иммуногенная активность этих белков, позволяет рассматривать их как наиболее перспективные компоненты белковых вакцин [8], антигенную вариабельность некоторых белков наружной мембраны используют для серологической классификации штаммов N. meningitidis. Начиная с 80-х гг. XX века свойства основных белков наружной мембраны активно изучали, и на их основе предлагали различные варианты экспериментальных противоменингококковых вакцин, которые должны -были стать более эффективными иммунопрофилактическими препаратами по сравнению с простыми полисахаридными проти воменингококковыми вакцинами. Конъюгаты капсульных полисахаридов менингококков серогрупп А и С с белками, известными активаторами Т-хелперных клеток, такими как столбнячный анатоксин, проявили высокую нммуногенность, при иммунизации животных и людей, и индуцировали: образование длительно циркулирующих в крови антител, специфичных к менингококкам соответствующих вакцинных серогрупп [28, 29, 30]. Конъюгированные с белками полиса-харидные вакцины более иммуногены для детей младшего возраста (от 2-х мес.) по сравнению с полисахаридными [31, 32] и имеют хорошие перспективы. В настоящее время некоторые из конъгогированных вакцин против менингококков серогрупп А и С находится на разных стадиях исследования, и даже внедрены в производство.
Белки структурного класса 2/3 — РогВ
Все природные штаммы менингококка экспрессируют на наружной мембране белки 2 или 3 класса, к которым относится белок РогВ [27]. 2 и 3 классы основных белков наружной мембраны представляют собой аллели гена рогВ, контролирующего экспрессию соответствующего белка [47]. Таким образом, у менингококков экспрессия белка РогВ 2 класса исключает экспрессию белка 3 класса, и наоборот - экспрессия белка РогВ 3 класса исключает экспрессию белка 2 класса. Электрофорстическое исследование комплекса белков наружной мембраны N. meningitidis установило молекулярную массу белков 2 класса, которая составила 39—41 кДа, и 3 класса - 35-38 кДа [27]. Белок РогВ интегрирован в наружную мембрану, в которой он образует пору, ответственную за транспорт анионов [44, 45, 46]. По всей вероятности, белок РогВ играет важную роль в жизнедеятельности микроорганизма, поскольку колонии бактерий-мутантов по этому белку характеризуются замедленным ростом in vitro [39]. Полная аминокислотная последовательность белка РогВ установлена при расшифровке генарогВ. Гомология между белками 2 и 3 класса составляет приблизительно 70%. N. gonorrhoeae экспрессирует белки РТА и РГВ, гомологичные белкам 2 и 3 класса N. теп ingitidis, и выполняющими ту же функцию [44,75]. С помощью PorB-специфичных моноклональных антител менингококков дифференцируют на серотипы. Вариабельность белка РогВ довольно высока, и в настоящее время даже с помощью самой полной библиотеки специфичных к нему моноклональных антител не представляется возможным идентифицировать все серотипы менингококка. Последние исследования ДНК N. meningitidis позволили выделить 30 семейств серотиповых детерминант РогВ (14 семейств белков 2 класса и16 семейств белков 3 класса) [76]. При этом с помощью имеющегося на сегодняшний день в наличии набора моноклональных антител доступны серотипированию всего около 50% выделяемых штаммов менингококка. 3.2.1. Структура белков РогВ и их расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis С помощью теоретических, биохимических и иммунологических методов анализа структуры было установлено, что белок РогВ существует в наружной мембране в виде комплексов, состоящих из трех субъединиц [77].
Гипотетическая двумерная модель белка РогВ приведена на рис.7. На наружной мембране экспонировано восемь а-спирализованных петлеобразных участков белка РогВ [49]. Вариабельные районы белков РогВ разных штаммов N. meningitidis расположены в экспонированных участках VR1-4, соответствующих.петлям 1, 5, 6 и 7 [78]. Остальные петли более консервативны и, по-видимому, организуют процесс транспорта анионов [79], при этом непосредственное участие в транспорте принимает петля 3 [48]. В соответствии с разностью молекулярных масс, участки белка РогВ 2 класса, экспонированные на наружной мембране, по сравнению с соответствующими участками белка РогВ 3 класса, длиннее и коиформационно более устойчивы, а также они более устойчивы к действию протеолиза. По всей вероятности более длинные петли белка 2 класса находятся в более тесном контакте с соседним белковым окружением, что стерически затрудняет действие протеолитических ферментов [77, 79]. 3.2.2. Антигенные и иммуногенные свойства белков РогВ РогВ - иммуногенный белок, по своей активности он сопоставим с белком РогА. При мешшгококковой инфекции, вакцинации белковыми вакцинами и иммунизации -животных рекомбинантным неденатурированным: белком РогВ к этому белку образуются бактерицидные антитела [81, 82, 56, 83]. В сыворотках людей, перенесших менингококко-вую инфекцию, обнаруживают превышение уровня РогВ-специфичных антител над уровнем РогА-антител [84, 85, 54]. Исследование формирования противоменингококкового иммунитета после иммунизации людей норвежской везикулярной вакциной показало, что после первой иммунизации образуются антитела, направленные в основном к белкам РогА (I класса) и Орс (5 класса), однако повторная иммунизация той же вакциной через 4-5 лет приводит также к индукции высокого уровня бактерицидных РогВ-спенифических антител [86]. Введение специфичных к белкам класса 2/3 антител лабораторным животным защищает их от экспериментально вызванной менингококковой инфекции [56, 87]. По причине невысокой иммуногенности белок РогВ не ранее рассматривали в качестве вероятного протективного компонента вакцины. Менингококки - экспрессируют белки 1 и 2/3 класса примерно в равных количествах, и это же соотношение белковых компонентов сохраняется в вакцинном препарате, из этого следует, что низкая иммуно-генность белка РогВ не является результатом невысокого содержания данного белка в наружной мембране менингококка. Низкую иммуногенность белка РогВ можно объяснить меньшей длиной, а вместе с тем и меньшей экспонированностью наружных петель (в особенности это характерно для белков 3 класса) на наружной мембране по сравнению с белком РогА [88]. Считается, что интегрированный в мембрану белок РогВ живого менингококка представляет иммунной системе в основном В-эпитопы конформационного типа [78]. Картирование В-эпитопов белка РогВ с помощью набора перекрывающихся синтетических пептидов помогло выявить лишь один линейный эпитоп19-30, который расположен в 1-ой петле молекулы (участок VR1 на рис. 7) [80]. Именно к этому эпитопу образуются антитела при повторной иммунизации людей противоменингококковои везикулярной норвежской вакциной [89, 86]. Линейность эпитопа был подтвержден экспериментами по связыванию специфических антител с денатурированной формой белка [89]. 3.2.3. Картирование Т-эпитопов белка РогВ Белок РогВ способен активировать Т-хелперные клетки, благодаря чему его можно использовать в качестве белка-носителя для слабых иммуногенов [90], но способность белка РогВ в составе везикулярных вакцин активировать
Т-клеточный ответ все-таки ниже, чем Т-клеточная активностью белка РогА [91, 92]. С помощью пептидного картирования белка РогВ серотипа 15 были обнаружены линейные Т-хелперные эпитопы (см. рис. 7) [93]. Интересно, что пептиды, которые наиболее активно стимулируют пролиферацию периферических клеток крови мышей, соответствуют участкам белка, захватывающим консервативные районы белка. Диапазон участков белка, стимулирующих человеческие Т-клетки, однако намного шире, в то же время участки 163-180 и 235-252 (см. рис. 7) способны стимулировать как Т-клетки мышей, так и Т-лимфоциты человека. Это дает возможность переносить результаты иммунологических исследований с животной модели на человека. Перспективу использования белка РогВ в современных проти вомевдшгококковых вакцин оценить пока трудно. С одной стороны, после менингококковой инфекции, а также после повторной иммунизации белковой вакциной у людей наблюдают высокие титры антител к белку РогВ, даже превосходящие по уровню титры антител к белкам 1 класса [85, 84, 86], с другой стороны остается низкой бактерицидная активность РогВ-специфичных антител [57]. В настоящий момент большинство специалистов склонно рассматривать белки 2/3 класса, благодаря их высокой вариабельности в качестве перспективных эпидемиологических маркеров. В то же время вариабельность ограничивает использование данных белков для производства вакцинных препаратов. 3.3. Белок структурного класса 4 - Rmp Представителем белков 4 класса наружной мембраны N. meningitidis является белок Rmp. Расчет молекулярной массы белка Rmp по его аминокислотной последовательности дает величину около 24 кДа, однако две дисульфидные связи белка становятся причиной сдвига полосы, соответствующей этому белку, в восстанавливающих условиях электрофореза к значению массы около 32 кДа. Данная особенность нашла отражение в названии белка - Rmp {reduction modifiable protein - белок, модифицирующийся в восстанавливающих условиях). Гомология между белками Rmp менингококка и РШ N. gonorrhoeae оценивается на уровне 96% [941. Оба белка характеризуются малой антигенной вариабельностью и функционально связаны с поринами [95, 96] и железозависимыми белками менингококка [97]. Аминокислотная последовательность С-концевого участка Rmp гомологична также белкам ОтрА из Е. coli. и OprF из Pseudomonas aeruginosa [98, 99]. Функции белка Rmp остаются малоизученными.
БелокNspA
В 1997 г. в наружной мембране ,/V. meningitidis был обнаружен минорный белок NspA (Neisseria! surface protein А) с молекулярной массой около 22 кДа [163]. Экспрессия этого белка находится под контролем соответствующего гена- nspA. Анализ гомологов белка NspA у родственных микроорганизмов показал, что аминокислотная последовательность белка NspA чрезвычайно консервативна не только у менингококков разных штаммов, но и у всех патогенных бактерий семейства Neisseria. Гомология первичной структуры молекул NspA менингококка и N. gonorrhoeae оценивается на уровне 93% [164]. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов nspA N. meningitidis разных штаммов указывает на еще более высокую гомологию соответствующих белков. Исследования последних лет позволяют говорить о том, что внутри серогруппы В менингококка идентичность белков NspA приближается к 100% [165, 166]. 3.6.1. Структура белка NspA и его расположение в наружной мембране Neisseria meningitidis Функция, которую выполняет белок NspA, пока не установлена. Однако характерное чередование полярных и неполярных аминокислотных остатков в последовательности белка NspA указывает на возможность его существования в форме р-складчатого цилиндра, характерной для пориновых белков. Кроме того, белок NspA присутствует в нерастворимой фракции бактериальных мембран, что говорит о его интегрированности в мембрану. По аналогии с белками-поринами построена гипотетическая двумерная модель молекулы NspA (рис. 13) [166]. Прослеживают сходство структуры белка NspA со структурами других белков N. meningitidis. В частности, белок NspA имеет участки, гомологичные некоторым районам белков семейства Ора, к таким участкам относятся все трансмембранные районы белка, кроме самого ближнего к N-концу молекулы участка и района 4-ой петли белка [166]. Высокое сходство белков NspA среди патогенных нейссерий, а также сродство его первичной структуры с белками Ора, участвующими в процессах инвазии бактерий, говорит в пользу того, что белок NspA влияет на инфекционную способность менингококков [165]. Моноклональные антитела, полученные к белку NspA, связываются с 99% изученных штаммов менингококка.
Эти антитела проявляют бактерицидные свойства против TV". meningitidis основных патогенных серогрупп - А, В и С. Иммунизация рекомбинантным белком NspA, так же как и введение соответствующих моноклональных антител защищает животных от мениигококковой инфекции [163, 164]. Связывание NspA-антител с поверхностью менингококка указывает на то, что белок NspA доступен на поверхности бактериальных клеток, т.е. на мембране присутствуют экспонированные фрагменты белка. Из вышесказанного следует, что белок NspA можно рассматривать в качестве потенциального протекти вного иммуногена в составе противоменингококковой вакцины. По всей вероятности, экспонированные на наружной мембране участки белка NspA разных штаммов N. meningitidis неодинаково доступны для специфических антител: Несмотря на то, что аминокислотная последователышсть интегрированных в наружную мембрану участков белков NspA бактерий разных штаммов консервативна, стало известно, что NspA-антитела не связываются со многими штаммами менингококка, экспресси-руюшимн этот белок [166]. Однако те штаммы, с которыми не связывались антитела, вырабатывали капсульний полисахарид в количестве, до трех раз превосходящем его содержание у штаммов, с которыми связывались антитела. Таким образом, возможно увеличенный слой капсульного полисахарида затрудняет доступ антител к наружной мембране и, соответственно, к белку NspA. С этим предположением хорошо согласуется малая длина наружных петель белка NspA - 10-16 аминокислотных остатков. Для сравнения можно привести длину петель РогА (до 40 остатков), которые, напротив, хорошо экспонированы и доступны для соответствующих антител. С помощью анализа связывания моноклональных антител с различными штаммами менингококка было установлено, что в белке NspA находится, по крайней мере, один эпи-топ. Предполагают, что вероятнее всего этот эпитоп локализован во 2-ой или 3-ей петле белка NspA [165], причем якорными для эпитопа являются аминокислотные остатки 54-55 или 95-96. Поскольку моноклональные антитела способны связываться не только с ре-комбииантным белком, но также и с нативиым белком наружной мембраны менингококка, это позволяет заключить, что предполагаемые В-эпитопы экспонированы на поверхности наружной мембраны [167]. Возможность использования белка NspA для разработки противоменингококковой вакцины связана с его антигенной консервативностью и стабильной экспрессией, чего нельзя сказать, например, о высокоиммуногенных белках семейства Ора. Огромное преимущество белка NspA перед другими белками наружной мембраны N. meningitidis состоит еще и в том, что консервативные эпитопы, к которым образуются бактерицидные антитела, локализованы в экспонированных на наружной мембране петлях белковой молекулы, тогда как большинство эпитопов, которые экспонируют на наружной мембране другие известные белки, носят вариабельный характер. 3.7. Белок GNA33 Значительный вклад в идентификацию протективных антигенов, для разработки белковой противоменннгокковой вакцины был сделан в 2000 г. при полной расшифровке генома (2 272 351 пар оснований) N. meningitidis (штамм МС58 серогруппы В) [168, 169]. Из множества белков наружной мембраны, аминокислотная последовательность которых была выведена в ходе расшифровки генома, следует выделить белок GNA33 молекулярной массой 48 кДа (genome-derived Neisseria antigen).
Сравнение последовательности этого белка с известными белками Е. coli и изучение его ферментативных функций позволило утверждать, что белок (точнее - липопротеин) GNA33 представляет собой мембраносвя-занную литическую трансглнкозилазу A (MltA - membrane-bound lytic transglycosylase A) состоящего из 441 аминокислотного остатка [169]. Белок GNA33 высококонсервативен в ряду разных серогрупп менингококков и гонококков (степень гомологии более 90%) [168]. Предположительно, липопротеин GNA33 участвует в патогенезе бактерии. Рекомбннантный белок GNA33 индуцирует образование бактерицидных антител с высокими титрами у мышей, причем интенсивность иммунного ответа на белок GNA33 сопоставима с интенсивностью ответа при иммунизации животных везикулярной проти-воменинпжокковой вакциной [168]. Антитела к белку GNA33 бактерицидны и способны убивать клетки менингококков в присутствии комплемента. Неожиданной находкой оказалась перекрестная реактивность GNA33-airnn i с белком РогА. Изучение связывания моноклональиых антител, направленных к белку GNA33, с набором перекрывающихся пептидов выявило общий эпитоп QTP, находящийся в белке GNA33 и в 4-ой петле белка РогА серосубтипаР1.2 [170], антитела, связывающиеся с этим эпигоном, обладают про-тективными свойствами и защищают крысят от заражения гомологичным:штаммом,//. meningitidis. Примечательно, что ранее при иммунизации животных короткими пептидами, соответствующими 4-ой петле белка РогА не удалось получить антител, которые были бы бактерицидными или связывались с природным белком РогА [70]. Скорее всего, эпитоп 4-ой петли является конформапионным, поэтому денатурированный белок РогА не способен вызвать образования специфических к данному эпитопу антител [67, 70]. Напро-тив, рекомбинамтный белок GNA33; даже в денатурированном виде индуцировал образование данных антител [170]. Возможно, что в бактерицидную активность антител, индуцируемых белком GNA33, существенный вклад вносят антитела, перекрестно связывающиеся с белками GNA33 и РогА. Таким образом, белок GNA33 является перспективным компонентом нротивоме-нингококковой вакцины в связи с его консервативностью в ряду различных штаммов менингококка и его способностью индуцировать образование бактерицидных антител, перекрестно реагирующих с серосубтиповым эпитопом белка РогА.
Изучение иммуногенных, антигенных и протективных свойств синтетических фрагментов белка pora
В связи с тем, что мышей различных линий часто используют для оценки специфической активности; вакцинирующих противоменингококковых препаратов, способность синтетических фрагментов белка РогА стимулировать образование антител была изучена в экспериментах на мышах линий BALB/c, C57/BI и СВА, различающихся гаплотипами молекул главного комплекса гастосовместимости П класса. При этом линии мышей BALB/c соответствует гаилотип H-2d, линии С57/В1 - гаплотип H-2b, линии СВА - гапло-тип Н-2к. Мышей дважды иммунизировали незащищенными пептидами без конъюгации с белком-носителем с интервалом в 45 дней. Полученные сыворотки исследовали методом иммуноферментного анализа на связывание с пептидами, сорбированными на планшете. В случае отсутствия связывания сывороток мышей всех трех линий для подтверждения отрицательных результатов, которые могли быть обусловлены плохой сорбцией пептида, наносили на плашку конъюгаты пептидов с овальбумином. Титры противопептидных антител в сыворотках, полученных после иммунизации мышей синтетическими пептидами, приведены в табл. 7. Результаты иммунизации мышей свободными пептидами показали (табл.. 7), что пептиды 32-51 (Р-Ш), 118-143 (P-V), 306-321 (P-XJ), 311-328 (Р-ХШ) были иммуногены на всех трех линиях, пептиды 22-41 (Р-П), 178-199 (P-VTI), 223-242 (P-VIII) оказались иммуногеинымц только на одной линии мышей (СВА), пептиды 12-3 Г (Р-І), 77-96 (P-1V), 273-292 (Р-Х);не проявили активности ни на одной линии мышей; Таким образом, все пептиды, за исключением трех неактивных фрагментов 12-31 (Р-І), 77-96 (P-IV) и 273-292 (Р-Х) индуцируют гуморальный ответ хотя бы на одной линии мышей и содержат эпито-пы, активирующие Т-хелпсрные клетки. Полученные данные хорошо согласуются с расчетами мышиных Т-хелперных эпитопов [171]. Так пептиды (Р-Ш), (P-V), (P-IX), (Р-ХІ)-(Р-ХШ), проявившие активность на мышах трех линий, содержат теоретически рассчи- тайные Т-эпитопы мыши. Иммуногенные свойства также проявили не содержащие расчетных Т-эпитопов пептиды (Р-VI), (P-XIV). Возможно, их активность реализовалась за счет взаимодействия с молекулами MHC-I1, для которых не описан мотив связывания. Пептиды (Р-1), (Р-П), (P-IV), (P-VIf), (P-VIH), не содержащие расчетных Т-эпитопов, как и ожидалось, либо оказались неактивными, либо были иммуногены только на одной линии мышей. Наиболее активные пептиды (P-V), (P-XI), (P-XIII) содержат сайты связывания с МНС-Н человека, т.о. возможно, что данные синтетические фрагменты проявят им-муногенную активность при иммунизации людей.
Пептид 306-332 (Р-ХП) в свободном неконъюгированном виде на линии мышей: Balb/c индуцирует образование высокого уровня антител, поэтому следует ожидать, что этот пептид способен активировать Т-хелперные клетки. Способность пептидного фрагмента 306-332 (Р-ХП) белка РотА индуцировать пролиферацию Т-клеток периферических лимфоузлов мышей была изучена на линии мышей Balb/c in vitro. Лимфатические узлы извлекали через семь дней после иммунизации животных пептидом 306-332 (P-XII). Способность лимфоидных клеток пролиферировать in vitro изучали при добавлении данного пептида. Данные по пролиферации стимулированных пептидом Т-лимфоцитов, приведенные в табл. 8, показывают, что индекс стимуляции имеет величину, зависимую от концентрации тестируемого пептида, при концентрации 100 нмоль/мл достигает значения 3,9, т.о. изученный фрагмент белка РогА действительно способен активировать Т-хелперные клетки, что сопровождается способностью пептида 306-332 (P-XII) индуцировать образование антител. Для выявления среди синтезированных пептидов соединений, содержащих В-эпитопы, на которые вырабатываются антитела при менингококковой инфекции, была изучена способность пептидов связываться с сыворотками крови мышей СВА, выживших после заражения сублетальной дозой менингококка серогруппы В (штамм Н44/76). Результаты, приведенные в табл. 9, показывают, что из изученных пептидов белка РогЛ лишь два - пептиды Ї 78-199 (P-VII) и 306-332 (P-XII) связываются с сыворотками инфицированных менингококком мышей. Участок 178-199 (P-VII) соответствует участку 4-ой петли белка РогА (см. рис. 14), против которой, как известно, вырабатываются бактерицидные антитела [3]. Антигенные свойства участка 306-332 (P-XII), соответствующего высококонсервативной 7-ой петле белка, ранее не были описаны. Данные, полученные в настоящей работе, показывают, что участок 306-332 белка РогА представляет интерес для разработки противоменингококковой вакцины, защищающей от заражения широким диапазоном штаммов N. meningitidis. Способность синтетических пептидов индуцировать протективный иммунитет была изучена в экспериментах по активной защите мышей линии СВА. Животных иммунизировали пептидами двукратно, через два месяца после второй иммунизации мышей заражали менингококком серофуппы В (штамм 44/76). Для заражения животных использовали дозы культуры бактерии - 10&, 107 и 108 микробных клеток. Через неделю после заражения подсчитывали число выживших мышей. Все эксперименты, связанные с использованием живой культуры менингококка, были проведены в лаборатории иммунохимии ИБХ РАН им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.
Протективную активность пептидов оценивали в сравнении с результатами, полученными в группе мышей, получивших только инъекцию адъюванта. Результаты по защите мышей синтетическими пептидами из белка РогА от заражения N. meningitidis представлены в табл. 10. Эксперимент по защите мышей от меиингококковой инфекции с помощью синтетических пептидов показал, что при низкой дозе заражения (I06 микробных клеток) наиболее активны пептиды (P-II), (P-V), (P-VII), (Р-ХП)-и (P-XIV), иммунизация которыми защитила всех животных в данной группе. При этом-в остальных группах погибали 1-2 животных, что мало отличалось от показателей контрольной группы мышей, получивших инъекцию адъюванта без добавления пептида. Заражение дозой менингококка 107 м.к. выявило один наиболее протективный пептид- (P-VII), в данной группе выжили все мыши кроме одной, тогда как в контрольной группе выжило менее половины мышей. Также высокую протективную активность проявили пептиды (Р-Ш), (P-V), (P-VIII)-(P-X), (Р-ХП), (P-XIV), при этом количество выживших животных составило не менее 7 животных из 10 в каждой группе. При высокой дозе заражения (10 м.к.) наиболее активными оказались пептиды (Р-Ш), (P-VII), (Р-Х) и (Р-ХП), иммунизация которыми защитила не менее половины животных в каждой опытной группе. Меньшую активность проявили пептиды (Р-V), (P-IX) и (P-XIV) (4 выживших мышей из 10 в группе), остальные пептиды оказались неактивны при этой дозе заражения. Суммирование результатов выживаемости в опытных группах животных по каждому пептиду показхто, что наиболее активными можно считать пептиды (P-VII) и (Р-XII), которые показали суммарный уровень защиты животных 82,1 и 80% соответственно и при использовании каждой из доз менингококка оказывались в группе наиболее актив- пых пептидов. Также активными оказались пептиды (Р-Ш), (P-V), (Р-Х) и (P-XIV), показавшие уровень защиты животных в диапазоне 70-80%. Таким образом, выраженную способность индуцировать защиту животных от заболевания при заражении менингококком проявили шесть пептидов (Р-Ш), (P-V), (P-VII), (Р-Х), (Р-ХП) и (P-XIV). Пептид 32-51 (Р-Ш) расположен в гипервариабельной 1 -ой петли белка РогА, содержит теоретически рассчитанный Т-хелперный эпитоп мыши [171]. Этот пептид иммуногенен на мышах линии СВА и при их иммунизации стимулирует развитие противомеяингококковой защиты. Протективную активность пептидов из 1-ой экспонированной петли белка можно было прогнозировать, поскольку в литературе была, описана бактерицидная активность антител, направленных к L-ой петле белка РогА [49]. Интересно, что из трех перекрывающихся фрагментов 1-ой петли белка (P-I)-(P-III) только один фрагмент 32-51 (Р-Ш) проявил выраженные протективные свойства. Протективные пептиды 118-143 (P-V), 273-292 (Р-Х) и 346-363 (P-X1V) расположены в высококонсервативных областях белка РогА. Пептид 118-143 (P-V) покрывает последовательность 3-ей петли белка РогА. Пептид 273-292 (Р-Х) полностью покрывает последовательность 6-ой петли и захватывает прилегающие к ней трансмембранные участки, а пептид 346-363 (P-X1V) соответствует 8-ой петле и части трансмембранного района.
