Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы интенсивно развиваются методы поиска новых лекарственных препаратов, основанные на знании свойств и структуры биологической мишени их действия. Для рационального дизайна химического соединения, которое могло бы прочно связаться с биомишенью, необходима как информация о трехмерной структуре мишени, так и понимание факторов, которые обеспечивают высокую специфичность связывания с ней низкомолекулярного лиганда. Такие знания могут быть получены при исследовании механизма действия лучших лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике. Одним из таких лекарственных средств является антибактериальный препарат триметоприм (ТМП). В сочетании с сульфаниламидными препаратами он широко используется для лечения инфекций дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. Мишенью действия ТМП является фермент дигидрофолат-редуктаза (ДГФР; КФ 1.5.1.3).
ДГФР - НАДФН-зависимый фермент, который катализирует реакции восстановления фолиевой и дигидрофолиевой кислот до тетрагидрофоиевой кислоты (ТГФ). Продукт восстановления - ТГФ - выступает переносчиком одно-углеродных фрагментов в реакциях биосинтеза азотистых оснований и некоторых аминокислот. Нормальная жизнедеятельность клетки невозможна без поддержания его концентрации на достаточно высоком уровне. Блокирование работы ДГФР приводит к падению концентрации ТГФ, что вызывает остановку биосинтеза нуклеиновых кислот и белка, блокирует деление клеток и вызывает их последующую гибель.
Вследствие описанной важной биохимической роли, фермент представляет собой отличную мишень для действия антифолатных препаратов, которые должны селективно ингибировать ДГФР паразитических организмов или блокировать фермент злокачественных клеток. Наиболее известными антифолата-ми являются противоопухолевые препараты метотрексат и триметрексат, противомалярийный препарат пириметамин и упомянутый выше антибактериальный препарат триметоприм.
Антибактериальное действие триметоприма обусловлено высокой селективностью связывания препарата с ДГФР бактерий по сравнению с ферментом человека. В основе такой селективности лежит положительный кооперативный эффект связывания между препаратом и кофактором НАДФН при образовании их тройного комплекса с ДГФР бактерий. При связывании этих лигандов с ДГФР человека наблюдается лишь весьма незначительный кооперативный эффект.
Комплексы ТМП с ферментами различных организмов интенсивно изучались ранее с помощью рентгеновской кристаллографии, но до последнего времени не было предложено ни одной гипотезы, которая могла бы удовлетворительно описать молекулярную природу положительного кооперативного эф-
фекта, возникающего при связывании триметоприма и НАДФН с ДГФР бактерий. Поэтому исследование, нацеленное на установление факторов, контролирующих кооперативный эффект связывания указанных лигандов и определяющих высокую селективность действия широко используемого в медицинской практике лекарственного соединения, представляется весьма актуальным.
Цель и задачи исследования
Целью работы является установление природы положительного кооперативного эффекта между антибактериальным препаратом триметопримом и кофактором НАДФН при их связывании с ДГФР бактерий, что обуславливает высокую селективность ингибирующего действия препарата и, как следствие, увеличивает терапевтическую широту триметоприма.
Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:
Определение структуры тройного комплекса ДГФР человека с ТМП и НАДФН, в котором кооперативный эффект связывания лигандов практически полностью отсутствует;
Сравнение полученной структуры с рассчитанной ранее структурой аналогичного тройного комплекса ТМП и НАДФН с бактериальным ферментом (ДГФР L.casei), в котором реализуется положительный кооперативный эффект связывания лигандов;
Определение структуры двух бинарных комплексов ДГФР L.casei -ТМП и ДГФР L. casei-НАДФН для сравнения их со структурой тройного комплекса ДГФР L.casei -ТМП-НАДФН;
Определение динамических свойств белковой цепи в апо-форме ДГФР L.casei, бинарных комплексах ДГФР L.casei с ТМП и НАДФН и тройных комплексах ДГФР человека и L.casei с ТМП и НАДФН;
Детальный анализ всех полученных экспериментальных данных с целью выявления факторов, ответственных за возникновение кооперативного эффекта при связывании антибактериального препарата триметоприма и кофактора НАДФН с ДГФР бактерий.
В качестве основного метода проведения указанных исследований была выбрана спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), поскольку этот метод позволяет получить как структурную, так и динамическую информацию о белке и его комплексах в растворе.
Научная новизна
В работе впервые исследованы детали молекулярного механизма взаимодействия антибактериального препарата триметоприма с его биологической мишенью - ДГФР человека и бактерий (L.casei). Получены структурные данные о серии комплексов, выбранных системно с целью определения природы кооперативного взаимодействия лигандов - ТМП и НАДФН.
Впервые получена информация о структуре ДГФР человека в растворе. Впервые получена структурная информация для комплекса ДГФР человека с триметопримом. Впервые рассчитаны и депонированы в банк белковых структур (PDB) три новые структуры (1YHO, 2НМ9 и 2HQP).
Получена информация о корреляции динамических свойств белковой цепи в широком диапазоне частот с прочностью связывания лигандов. Впервые установлено, в частности, то, что прочность связывания лигандов не обнаруживает заметной корреляции с амплитудами быстрых (в шкале времени от пс до не) движений белковой цепи в соответствующих комплексах. В то же время для более медленных конформационных перегруппировок такая корреляция существует, что отмечалось и ранее.
Установлено, что природа кооперативного взаимодействия ТМП и НАДФН имеет комплексный характер. Оно складывается аддитивно из индуцированных изменений конформации белка, резонансного упрочнения сети водородных связей в белке и прямого лиганд-лигандного взаимодействия.
Практическая значимость работы
В ходе работы разработан системный подход к изучению механизма действия лекарственных средств. С его помощью показано, что процесс молекулярного узнавания контролируется большим числом структурных и динамических факторов, в конечном итоге определяющих свойства того или иного лекарственного препарата. Такой сложный многомерный характер взаимодействия следует учитывать при поиске новых эффективных лекарственных средств, предназначенных для селективного действия на биомишени. Представляется недостаточным искать лишь простую структурную комплементарность лиганда к своей биомишени.
Полученные данные потенциально могут быть применены для поиска новых лекарственных препаратов - как новых ингибиторов ДГФР, так и препаратов, относящихся к другим классам, но взаимодействующих со своими биомишенями аналогичным образом. Кроме того, установленные факторы кооперативного взаимодействия лигандов могут оказаться полезными для понимания природы взаимодействий белков с эндогенными лигандами различной природы.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих российских и международных конференциях, посвященных спектроскопии ЯМР и структурным исследованиям биомолекул: XVII съезд по общей и прикладной химии (Казань, 2003); Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2004» (Москва, 2004); XXI Международная конференция ICMRBS (International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems; Хайдерабад, 2005); IV Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2005); Международная конференция "Biocatalysis-2005" (Санкт-Петербург-Кижи-Валаам, 2005); Международная конференция "Advances in Sciences for
Drug Discovery" (Москва, 2005); Международная конференция «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006); Международный симпозиум СМТРІ-2007 (Москва, 2007).
Публикации
Основные результаты диссертации изложены в 9 тезисах докладов и в 2 статьях в реферируемых российских и зарубежных научных журналах.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и заключения. Общий объем работы составляет 154 страницы текста, включая 59 рисунков, 26 таблиц и список литературы, содержащий 170 ссылок.
