Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 13
1.1 Общая характеристика липополисахаридов 13
1.2 Структуры О-антигенов морских грамотрицательных бактерий. 19
1.2.1 Класс Gammaproteobacteria 20
1.2.1.1 Семейство Vibrionaceae 20
1.2.1.2 Семейство Pseudoalteromonadaceae 25
1.2.1.3 Семейство Shewanellaceae 33
1.2.1.4 Семейства Moraxellaceae, Idiomarinaceae, Alter omonadaceae, Oceanospirillaceae 1.2.2 Класс Flavobacteriia 38
1.2.3 Класс Alphaproteobacteria 40
1.3 Спектроскопия ЯМР в исследовании углеводов 42
1.3.1 Одномерная спектроскопия ЯМР 43
1.3.2 Двумерная спектроскопия ЯМР 48
1.4 Липополисахариды морских грамотрицательных бактерий как антагонисты эндотоксинов 52
2 Результаты и их обсуждение 56
2.1 Структурное исследование О-специфического полисахарида Cobetia pacifica КММ 3879т 58
2.2 Структурное исследование О-специфического полисахарида Cobetia pacifica КММ 3878 67
2.3 Структурное исследование О-специфического полисахарида Rheinheimera pacifica КММ 1406 76
2.4 Структурное исследование О-специфического полисахарида Idiomarina abyssalis КММ 227 з
2.5 Структурное исследование О-специфического полисахарида Litorimonas taeanensis G5 99
2.6 Структурное исследование О-специфического полисахарида Echinicola vietnamensis КММ 6221 Ill
2.7 Цитокин-индуцирующая активность липополисахаридов 119
3 Экспериментальная часть 122
3.1 Приборы и материалы 122
3.2 Микроорганизмы и условия их культивирования, удаление капсульного материала и обезжиривание бактериальной биомассы 124
3.3 Выделение липополисахаридов 125
3.4 Электрофорез в полиакриламидном геле 125
3.5 Выделение О-специфических полисахаридов 126
3.6 Компонентный анализ 126
3.7 Химические методы модификации и расщепления полисахаридов 129
3.8 Спектроскопия ЯМР 130
3.9 Цитокин-индуцирующая и цитотоксическая активности 130
Выводы 132
Список литературы 1
- Семейство Shewanellaceae
- Двумерная спектроскопия ЯМР
- Структурное исследование О-специфического полисахарида Cobetia pacifica КММ 3878
- Микроорганизмы и условия их культивирования, удаление капсульного материала и обезжиривание бактериальной биомассы
Семейство Shewanellaceae
Грамотрицательные бактерии являются важнейшим компонентом морских экосистем, ареалы их обитания весьма разнообразны и охватывают прибрежные и открытые акватории океанов, глубоководные и гидротермальные впадины, грунты; помимо свободноживущих форм микроорганизмов, некоторые виды бактерий способны колонизировать внешние оболочки и внутренние поверхности морских животных и растений. Отдельные группы микроорганизмов образуют высоко специфические симбиотические взаимосвязи с организмом хозяина [4].
Экстремальные условия морской среды обитания находят свое отражение в устройстве клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в частности, в таком ее важном компоненте, как ЛПС. У большинства изученных морских грамотрицательных бактерий сохраняется общая архитектура молекулы ЛПС, т.е., как и в случае наземных микроорганизмов, молекула ЛПС построена из липида А, олигосахарида кора и О-специфической цепи. Отличительной особенностью молекул липида А морских бактерий является их низкая степень ацилирования и фосфорилирования, низкое содержание жирных кислот, характерных для липида А наземных бактерий, присутствие в некоторых случаях разветвленных 3-гидрокси- и ненасыщенных жирных кислот [10]. Немногочисленная информация о структурах олигосахарида кора морских микроорганизмов свидетельствует о том, что они также отличаются от таковых для наземных бактерий. Для них характерны более короткие олигосахаридные цепи с большим суммарным отрицательным зарядом [6, 7]. Общей особенностью большинства О-антигенных полисахаридов морских грамотрицательных бактерий является их кислый характер, присутствие редко встречающихся моносахаридов и их этерифицированных или амидированных производных. Анионный характер ОПС морских бактерий, скорее всего, связан с процессом адаптации к морской окружающей среде, поскольку наличие отрицательно заряженных участков в полисахаридной цепи способствует ионному взаимодействию с катионами двухвалентных металлов. Эти ионные мостики делают более компактной общую упаковку мембраны, обеспечивая тем самым большую устойчивость бактериальной клетки к внешним факторам морской среды [6, 7].
В настоящем литературном обзоре обобщены сведения о структурных исследованиях ОПС морских бактерий, принадлежащих к родам Vibrio, Alivibrio, Listonella, Pseudoalteromonas, Shewanella, Alteromonas, Microbulbifer, Marinomonas, Idiomarina и Psychrobacter класса Gammaproteobacteria, Arenibacter, Cellulophaga, Tenacibaculum класса Flavobacteriia и Sulfitobacter класса Alphaproteobactera.
Представители семейства Vibrionaceae образуют одну из доминирующих групп морской среды и составляют значительную часть морских гетеротрофных бактериальных популяций. Некоторые их виды патогенны для человека, рыб, отдельных беспозвоночных и их личинок. Существующие на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что морские представители семейства Vibrionaceae продуцируют ЛПС с очень необычными и интересными структурами полисахаридных цепей.
Галофильные морские грамотрицательные бактерии Vibrio vulnificus являются патогенными микроорганизмами для некоторых видов рыб и вызывают ряд серьезных заболеваний у человека. На основании фенотипических характеристик, изоляты бактерий V. vulnificus подразделяются на три биотипа, которые все являются условно патогенными для человека. Штаммы биотипа 1 наиболее часто изолируют из клинических образцов, штаммы биотипа 2 являются патогенными в основном для угрей [22-24]. Заболевания людей в большинстве случаев связывают с употреблением в пищу зараженных данным микроорганизмом морепродуктов.
Отличием является ацетилирование остатка L-GalNAmA в третье положение, другая абсолютная конфигурация остатка яблочной кислоты и замена остатка 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-0-глюкозы (D-QuiNAc) его биосинтетическим предшественником - 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-0-ксшо гексоз-4-улозой (D-6dxylHexN-4-ulo) (Таблица 3).
Главной особенностью полисахарида V. vulnificus СЕСТ 4602 [28] является наличие необычного компонента - 2-ацетиламино-(3-гидроксибутаноил)-амино-2,3,6-тридезокси-Ь-маннозы (P-L-Rha/?NAc3NHb). Ранее N-диацетилированное производное этого моносахарида было найдено в составе ОПС Proteus penneri 066 [29] и капсульного полисахарида (КПС) Escherichia coli К48 [ЗО].
Бактерии Vibrio ordalii и Listonella anguillarum (ранее Vibrio anguillarum) являются одними из важнейших патогенных микроорганизмов для некоторых промысловых видов рыб семейств лососевых и тресковых [31]. Среди множества штаммов бактерий L. anguillarum, заболевания рыб в большинстве случаев вызывают микроорганизмы, отнесенные к серогруппам 0:1 и 0:2. На основании данных реакции агглютинации с кроличьей сывороткой, полученной против L. anguillarum 0:2, некоторые штаммы V. ordalii были классифицированы как патогены серогруппы 0:2 [32].
В состав ОПС (Таблица 2) этих бактерий входят остатки редко встречающихся производных моносахаридов: 2-формиламино-2-дезокси-0 галактуроновой кислоты (D-GalNFoA), 2-ацетиламино-3-(М-формил-Ь-аланил) амино-2,3-дидезокси-0-глюкуронамида (D-GlcNAc3N(L-Ala2Fo)AN), 2 ацетиламино-3-(М-ацетил-Ь-аланил)-амино-2,3-дидезокси-0-глюкуронамида (D GlcNAc3N(L-Ala2Ac)AN), 3-ацетимидоил-2-ацетиламино-2,3-дидезокси-0 глюкуроновой кислоты (D-GlcNAc3NAmA), 2,3-диацетиламино-2,3-дидезокси-Ь-гулуроновой кислоты (L-GulNAc3NAcA), 3-ацетимидоил-2-ацетиламино-2,3-дидезокси-О-маннуроновой кислоты (D-ManNAc3NAmA), 2,4-диацетиламино-2,4,6-тридезокси-0-галактозы (D-FucNAc4NAc), 3-ацетиламино-3,6-дезокси-Ь-глюкозы (L-Qui3NAc). Кроме того, они содержат остатки 4-амино-4,6-дидезокси-D-глюкозы (D-Qui4N), амидированной остатком 2,4-дигидрокси-3,3,4-триметил-5-оксопролина (2,4НОЗ,3,4МеРго-5-охо) и 2-ацетиламино-2,6-дидезокси-0-глюкозы (D-QuiNAc) этерефицированной остатком пропионовой кислоты (Рр).
Двумерная спектроскопия ЯМР
Химические сдвиги ядер !Н расположены в значительно более узком диапазоне по сравнению с таковыми для ядер С. На величину химического сдвига протона оказывают влияние те же факторы, что и на величину химического сдвига атомов углерода, но, в отличие от химических сдвигов атомов углерода, влияние протон-протонных взаимодействий через пространство мало сказывается на химических сдвигах самих протонов, однако возрастает влияние анизотропии ближайших химических связей. В результате этого, выделение четких диапазонов химических сдвигов в протонном спектре полисахарида затруднительно и часто условно. Протоны при атомах углерода с электроотрицательным заместителем резонируют в диапазоне 8Н 3.0-5.5 м.д., протоны метальных групп N- и О-ацетатов - при 8н 2.0-2.2 м.д., метиленовые протоны дезоксисахаров - при 8н 1.7-2.5 м.д., а метальные протоны 6-дезоксисахаров - при 8н 1.2-1.5 м.д. На величину химического сдвига протонов влияет О- или N-ацилирование соседних функциональных групп. Оно приводит к значительному сдвигу их сигналов в слабое поле и позволяет определить положение ацилирования в остатках моносахаридов[ 121-123, 128, 129].
Данные спектра -ЯМР можно упростить путем редактирования в набор простых подспектров с помощью одномерной селективной спектроскопии ID TOCSY. Эксперимент ID TOCSY является одномерным аналогом 2D TOCSY (см. ниже) эксперимента и имеет значительное преимущество по сравнению с ним из-за более короткого времени измерения и лучшего цифрового разрешения.
Полезной для анализа состава, в частности для выявления кетосахаров и ацеталей пировиноградной кислоты, является возможность различать сигналы первичных, вторичных, третичных и четвертичных атомов углерода, предоставляемая спектроскопией С-ЯМР. С этой целью обычно используют эксперимент DEPT-135, основанный на спин-спиновых взаимодействиях ядер !Н и 13С [121, 123]. Размеры моносахаридных циклов в повторяющемся звене полисахарида определяются на основании существенного различия спектров моносахаридов в пиранозной и фуранозной формах. Для фуранозидов с Tw/адноориентацией заместителей при С-1 и С-2 атомах, сигнал С-1 атома находится в более слабом поле (8С 106-112 м.д.), чем сигнал С-1 атома любых Сахаров в пиранозной форме и остатков в фуранозной форме, имеющих г/иоориентированые заместители при С 1 и С-2 атомах. При г/иоориентации заместителей при С-1 и С-2 атомах область резонанса С-1 атома фуранозидов перекрывается с областью резонанса С-1 атома некоторых пиранозидов (главным образом с экваториально ориентированной OR группой). Однако, в спектре С-ЯМР, снятом без подавления спин-спинового взаимодействия углеродов с протонами (GD спектр), КССВ 1тсі-ні фуранозидов, при любой конфигурации гликозидного центра, составляют 1тсі-ні 170-175 Гц, а для пиранозидов с экваториально ориентированной OR-группой у С-1 атома, КССВ Jci-ні существенно меньше (158-163 Гц). Кроме того, для фуранозидов характерны слабопольные сигналы кольцевых С-4 атомов в области резонанса 8с 83-88 м.д. В этой же области могут находиться сигналы неаномерных атомов углерода, участвующих в образовании гликозидных связей, но их число не может превышать число остатков в повторяющемся звене полисахарида [122, 123]. Конфигурацию гликозидных связей в спектроскопии ЯМР углеводов можно определить несколькими способами. Во-первых, по значению КССВ JHI-Ш. ДЛЯ Р пиранозидов с глюко- и галакто- конфигурацией с аксиальным Н-2 атомом, величина КССВ 3JHI-Ш составляет 7-8 Гц, а для а-аномеров - не превышает 4 Гц. Для пиранозидов с лшнноконфигурацией (Н-2 атом имеет экваториальную ориентацию) этот подход неприменим - вне зависимости от аномерной конфигурации КССВ JHI-Ш не превышает 2 Гц (1.6 Гц в случае диэкваториальных протонов и 0.8 Гц в случае аксиально-экваториальной ориентации протонов) [121, 122, 128]. Во-вторых, по КССВ аномерного углерода с ближайшим протоном в GD спектре. Для альдопиранозидов с экваториальной OR-группой у С-1 атома КССВ %і-ні составляет 158-163 Гц, с аксиальной - 169-175 Гц [121, 122, 130]. В третьих, по положению сигналов С-5 атома в пиранозах или С-1 атома в фуранозах в спектрах С-ЯМР полисахаридов. Пиранозы не могут быть гликозилированы в положение 5, а разница между химическими сдвигами а- и Р-аномеров наибольшая именно для этого атома углерода [126], что особенно важно для маннопираноз.
Для установления положений замещения моносахаридных остатков используют эффекты гликозилирования - смещение сигналов а-атомов углерода, участвующих в образовании гликозидной связи, и соседних с ними Р-атомов по отношению к их положению в спектрах незамещённых моносахаридов. ос-Эффекты всегда положительны, могут достигать 11 м.д., а Р-эффекты могут быть как положительными, так и отрицательными, и их абсолютная величина не превышает 4 м.д. Величины у- и 8-эффектов значительно меньше и обычно не учитываются [131]. Аналогичным образом по эффектам замещения устанавливают места присоединения большинства неуглеводных групп, причем для этой цели используются данные спектров как Н-, так и С-ЯМР. Например, положение О-ацетильной группы легко определить по ее сильному дезэкранирующему эффекту, вызывающему значительное (на 0.5-1.5 м.д.) смещение в слабое поле сигнала протона при ацетоксильной группе. Величина влияния на химические сдвиги С-ЯМР молочной и пировиноградной кислот близка по величине к эффектам гликозилирования. Для фосфатных групп этот подход имеет меньшее значение в связи с возможностью использования для определения их локализации двумерной корреляционной спектроскопии (см. ниже). О наличии фосфатных групп свидетельствует сигнал (или сигналы) в спектре Р-ЯМР, в котором монофосфатные группы резонируют в области от -5 до +5 м.д., а дифосфатные группы - от -7 до -12 м.д. Наиболее удобным способом определения положения неуглеводных заместителей является сравнение спектров ЯМР исходного и модифицированного (О-дезацетилированного, дефосфорилированного, дезацилированного) полисахаридов [123].
Структурное исследование О-специфического полисахарида Cobetia pacifica КММ 3878
ЛПС /. abyssalis КММ 227 был получен из сухих бактериальных клеток экстракцией горячим водным фенолом. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС 1% уксусной кислотой привел к частичной деградации полисахарида. Поэтому ОПС был получен в условиях мягкого щелочного гидролиза ЛПС 0.1М раствором NaOH и последующей гель-хромотографии углеводной компоненты.
Моносахаридный анализ ОПС методами ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных метилгликозидов привел к идентификации остатков Rha, GlcNA, QuiN4N, Qui3N в соотношении спинового взаимодействия углеродов с протонами, показал, что все моносахаридные остатки находились в пиранозной форме, остатки с С-1 атомом углерода при 8с 101.8, 102.5, 103.4 и 104.2 м.д., имели Р-конфигурацию гликозидной связи (КССВ 1тсі-ні 160.0 - 166.4 Гц), а остаток с С-1 атомом углерода при 8С 99.6 м.д. - а-конфигурацию (КССВ 1тСі-ні 175.5).
Данные спектров !Н, -COSY и !Н, OCSY ОПС позволили выделить спиновые системы для пяти моносахаридных остатков. Две спиновые системы для моносахаридов с глюкоконфигурацией, обозначенные как А и С, были выделены на основании корреляционных кросс-пиков от Н-1 до Н-5 атомов. На основании корреляционных кросс-пиков от Н-1 до Н-6 атомов, (Н-6 атомы принадлежали метальным группам 6-дезоксисахаров), были выделены еще две спиновые системы для моносахаридов с глюкоконфигурацией, обозначенные как В и Е. Корреляции, наблюдаемые между сигналами Н-1 и Н-2 атомов и от Н-2 до Н-6 атома (Н-6 атомы этого остатка также принадлежали метильной группе 6-дезоксисахара), выявили наличие спиновой системы, соответствующей моносахаридному остатку с лшнноконфигурацией (D).
Анализ спектра !Н, 13C-HSQC (Рисунок 15, Таблица 12) позволил соотнести сигналы протонов с соответствующими им атомами углерода для всех моносахаридных остатков. Было показано, что С-2 атомы остатков А, В и С при 8с 56.1, 57.3 и 56.3 м.д., соответственно, также как С-4 атом остатка В и С-3 атом остатка Е при 8С 56.9 и 56.7 м.д., соответственно, связаны с атомами азота. Корреляционные кросс-пики Н-2/С-2 при 5н/5с 3.55/56.1 м.д. и наличие дальнего спин-спинового взаимодействия между сигналом Н-5 атома и карбоксильной группой при 5н/5с 3.65/173.6 м.д. (данные спектра !Н, 13С-НМВС) позволило идентифицировать остаток А как производное P-GlcpNA. В связи с плохим разрешением сигналов Н-3 и Н-4 атомов точное соотнесение сигналов его С-3 и С-4 атомов было проведено с использованием !H, 13С-Н2ВС эксперимента. Присутствие в спектре !Н, 13С-Н2ВС ОПС корреляционных кросс-пиков Н-2/С-3 при 5Н/5С 3.55/72.4 м.д. и Н-5/С-4 при 5Н/5С 3.65/82.7 м.д. указывало на то, что сигнал С-3 атома находился при 8С 72.4 м.д., а сигнал С-4 атома - при 8С 82.7 м.д.
Корреляционные кросс-пики Н-2/С-2 при 5н/5с 3.83/56.3 м.д. (данные спектра !Н, 13C-HSQC) и Н-5/С-6 при 5Н/5С 3.86/174.6 м.д. (данные спектра !Н, 13С-НМВС) свидетельствовали о том, что остаток С также являлся производным р-Glc NA11. Кросс-пики между Н-2/С-2, Н-4/С-4 и Н-6/С-6 при 5Н/5С 3.61/57.3, 3.50/56.9 и 1.23/18.2 м.д., соответственно, в спектре H, 13C-HSQC, позволили идентифицоравать остаток В как производное P-Qui/?N4N. Корреляционные кросс-пики Н-З/С-3 и Н-6/С-6 при 5н/5с 3.99/56.7 и 1.32/18.2 м.д., соответственно, указывали на то, что моносахаридный остаток Е являлся производным P-Qui/?3N. Последний моносахаридный остаток D с лшнноконфигурацией был идентифицирован как a-Rhap. Присутствие остатка 4-гидроксибутановой кислоты было показано на основании наличия спин-спинового взаимодействия между атомами Н-2 и Н-3 этого остатка с сигналом углерода его карбоксильной группы при 5н/5с 2.34, 1.84/178.1 м.д.
Значительное смещение в слабое поле химических сдвигов сигналов С-4 атома остатка P-GlcpNA1, С-3 атома остатка P-Qui/?N4N, С-3 и С-4 атомов остатка p-Glc/?NAcAn и С-2 атома остатка a-L-Rhap при 5С 82.7, 79.4, 76.5, 77.8 и 83.1 м.д., соответственно, в спектре С-ЯМР ОПС, по сравнению с их значениями в незамещенных моносахаридах (8с 73.1, 72.8, 74.5 и 73.1, 72.1 м.д., соответственно) [131, 170-172], указывало на порядок замещения моносахаридных остатков в полисахариде. Наличие 3,4-дизамещенного остатка Р-GlcpNAcA означало, что полисахарид имел разветвленную структуру, с точкой разветвления на данном моносахариде.
Микроорганизмы и условия их культивирования, удаление капсульного материала и обезжиривание бактериальной биомассы
В работе были использованы микроорганизмы С. pacifica 3879 , С. pacifica 3878, R. pacifica КММ 1406т, /. abyssalis КММ 227т, L. taeanensis G5T, и Е. vietnamensis КММ 6221Т из Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН.
Все микроорганизмы культивировали на жидкой среде следующего состава, (г/л): бактопептон - 5.0; гидролизат казеина - 2.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; К2НРО4 - 0.2; MgSC 4 - 0.05; NaCl - 15.0; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды. Культивирование проводили в течение двух суток при комнатной температуре при перемешивании (120 об/мин).
Биомассу бактерий отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течении 60 мин при 3000 об/мин.
Для отмывания капсульного материала с поверхности бактериальных клеток культуру суспендировали в 0.9 % растворе NaCl в течение 2 ч при механическом перемешивании, каждые 30 мин заменяя отмывающий раствор.
Обезжиривание клеток проводили, последовательно обрабатывая влажные клетки гексаном (1 х 200 мл), смесью СНС13:ЕЮН (2:1, по объему; 2 х 200 мл) и ацетоном (3 х 200 мл), проводя после каждой стадии центрифугирование в течении 30 мин при 4000 об/мин.
Бескапсульные обезжиренные клетки растирали до мелкодисперсного состояния. ЛПС экстрагировали из сухой биомассы по методу Вестфаля [177] 45% водным фенолом. Клетки суспендировали в воде (300 мл), затем при перемешивании добавляли 90 % водный фенол (300 мл) и выдерживали 30 мин на водяной бане при 67-68 С при постоянном перемешивании. Смесь охлаждали приблизительно до 10 С в бане со льдом. Эмульсию центрифугировали 40 мин при 4000 об/мин, при этом образовывалось три слоя: водный, фенольный и нерастворимый остаток клеток. Водный слой, содержащий ЛПС, отделяли, а фенольный слой и нерастворимый остаток обрабатывали новой порцией воды (500 мл) как описано выше. Экстракцию проводили три раза. Водные экстракты объединяли и осаждали нуклеиновые кислоты трихлоруксусной кислотой при рН = 2. Осадок отделяли центрифугированием, супернатант диализовали против дистиллированной воды трое суток для удаления фенола и небольших количеств бактериальных веществ низкого молекулярного веса. После диализа раствор концентрировали и лиофильно сушили.
Электрофорез ЛПС проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН ПААГ) [178] в течение 4 ч при постоянном токе 30 мА. Содержание акриламида в концентрирующем геле составляло 5%, в разделяющем 14%. Перед внесением в лунки, образцы ЛПС кипятили на водяной бане 5 мин. Содержание углеводных фракций визуализировали окрашиванием геля красителем на основе AgN03 [179]. ЛПС, содержащие отрицательно заряженные компоненты, визуализировали окрашиванием геля 0,01% раствором
Деградацию ЛПС для каждого микроорганизма проводили при различных условиях. ЛПС L. taeanensis G5 гидролизовали 1%-ной уксусной кислотой при 100 С в течение 2 ч. ЛПС С. pacifica 3879т и R. pacifica КММ 1406т гидролизовали 2%-ной уксусной кислотой в течение 3 ч. ЛПС С. pacifica 3878 и Е. vietnamensis КММ 6221Т гидролизовали ацетатным буфером (рН=4.5) при 100 С в течение 2 и 3 ч, соответственно. ЛПС /. abyssalis КММ 227 обрабатывали раствором 0.1 N NaOH при 37 С в течение 16 ч.
Далее для всех ЛПС осадок липида А удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 13000 об/мин и супернатанты последовательно фракционировали гель-хроматографией на колонках с гелем TSK HW-50 (S) и TSK HW-40 (S). ОПС С. pacifica 3879т дополнительно очищали от сопутствующих минорных компонентов ионообменной хроматографией на колонке с гелем DEAESK 650М.
Выход ОПС от сухой массы ЛПС составлял: 26,7 % для L. taeanensis G5 , 34 % для С. pacifica 3879т, 40% для R. pacifica КММ 1406т, 36% для С. pacifica 3878, 29% для /. abyssalis КММ 227ти 32% для Е. vietnamensis КММ 6221Т.
Гидролиз ОПС. ОПС (1-20 мг) гидролизовали 1-2М ТФУ в запаянной ампуле в течение 3 ч при 100 С. Трифторуксусную кислоту удаляли четырёхкратным упариванием с метанолом. Гидролизаты использовали для получения ацетилированных полиолов и для препаративного выделения моносахаридов с помощью метода хроматографии на бумаге.
Идентификация моносахаридов в виде ацетилированных полиолов. Смесь моносахаридов, полученную при гидролизе, растворяли в воде (1 мл), добавляли боргидрид натрия (3 мг) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Избыток боргидрида разрушали разбавленной уксусной кислотой, упаривали с метанолом (4 раза). Полученную смесь полиолов растворяли в безводном пиридине (0.2 мл), добавляли перегнанный уксусный ангидрид (0.2 мл) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли водой (3-5 мл), ацетилированные полиолы экстрагировали хлороформом. Экстракты трижды промывали водой, сушили над безводным сернокислым натрием и концентрировали. Полученные ацетилированные полиолы использовали для идентификации моносахаридов с помощью методов ГЖХ и ГЖХ-МС.
Идентификация моносахаридов в виде ацетилированных метилгликозидов. ОПС (1-2 мг) нагревали в метанолизной смеси (хлористый ацетил-метанол, 1:10 по объему, 0.1 мл) в запаянной ампуле при 100 С в течение 3 ч. Полученную смесь упаривали несколько раз с метанолом и ацетилировали уксусным ангидридом в пиридине в течение ночи при комнатной температуре. Полученные ацетилированные метилгликозиды использовали для идентификации моносахаридов с помощью методов ГЖХ и ГЖХ-МС.
Турбидиметрический метод. Образец ОПС 5 мг гидролизовали 2М трифторуксусной кислотой в запаянной ампуле в течение 2 ч при 100 С. В пробу, содержащую 20 мкл раствора гидролизованного образца, добавляли 380 мкл 1М НС1 и 100 мкл 0,5 % раствора хлорида бария в желатине. Смесь выдерживали 15 минут при комнатной температуре и количественно оценивали содержание сульфатных групп, измеряя мутность раствора смеси на спектрофотометре при длине волны 630 нм. Контрольные пробы содержали 400 мкл ЇМ НС1 и 100 мкл 0,5 % раствора хлорида бария в желатине.
Удельное оптическое вращение остатка D-Glc [а]578 +43.5 (с 0,4, вода), по литературным данным [а]578 +52.7. Удельное оптическое вращение остатка D-Gal [а]578 +71 (с 0,4, вода), по литературным данным [а]578 +80.5. Выделенная L-рамноза (С pacifica 3879т и /. abyssalis КММ 227т) была обработана ЇМ НС1 в 2 мл метанола в течение 2 ч при 100 С и таким образом превращена в метил L-рамнопиранозид. Абсолютная конфигурация остатков L-Rha была определена на основании удельного оптического вращения полученных метил-Ь-рамнозидов: [а]578 -65.4 (С. pacifica 3879т), [а]578 -64.7 (/. abyssalis КММ 227т) по литературным данным удельное оптическое вращение а-метил-L-рамнопиранозида [ос]578-67.2, вода [180]. Удельное оптическое вращение остатка Ala [a]D20 -10 (с 0,5, IN НС1) свидетельствовало о его D-конфигурации, литературные данные для D- Ala [a]D20 -14,2, IN НС1 [169].
Абсолютную конфигурацию остатков D-Gal (С pacifica 3878) и D-GalN {R. pacifica КММ 1406 и Е. vietnamensis КММ 6221 ) определяли методом ГЖХ и ГЖХ-МС в виде ацетилированных 2-(8)-октилгликозидов. Смесь моносахаридов, полученную при гидролизе полисахарида, нагревали с 2-(8)-октанолом в присутствие ТФУ (16 ч). Реакционную смесь упаривали досуха и ацетилировали уксусным ангидридом в безводном пиридине в течение ночи при комнатной температуре.
Свободный моносахарид L-QuiNAc (L. taeanensis G5 ) был выделен в результате сольволиза полисахарида (смотри ниже). Удельное оптическое вращение выделенного QuiNAc [а]578 -15 (с 0,4, вода) свидетельствовало о его L-конфигурации, по литературным данным удельное оптическое вращение для L-QuiNAc [а]578-540 -14(вода) [181].
