Введение к работе
Актуальность проблемы. Полисахариды — одни из наиболее распространенных на Земле биополимеров. Они разнообразны по составу и физико-химическим свойствам, что проявляется в многообразии их свойств и функций. Полисахариды могут выполнять структурные функции (целлюлоза, глюканы клеточных стенок), функции резервных веществ (амилоза, парамилон, ламинараны), водосохраняющие функции, присущие гелеобразующим полисахаридам (гликозаминогликаны и полисахариды водорослей), функции химического узнавания гликопротеинов, связанных с разными клетками.
Водорастворимые полисахариды бурых водорослей (фукоиданы, ламинараны) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фукоиданы -сульфатированные гетерополисахариды - проявляют иммуномодулирующее, антивирусное, противоопухолевое и антикоагулянтное действие, и в настоящее время на их основе разрабатываются биологически активные добавки и лекарственные средства. Интерес к (1—+3);(1—>6)-Р-Б-глюканам, к которым относятся ламинараны, связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных.
Несмотря на широкую известность всех этих полисахаридов, имеются трудности с установлением их структуры, которые связаны с тем, что состав и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д. Кроме того, строение этих полисахаридов, особенно фукоидаиов, отличается отсутствием регулярности и большим разнообразием.
Успешно применяемый в настоящее время подход к установлению структуры фукоидаиов с помощью ЯМР-спектроскопии предполагает использование химической модификации исходного полисахарида с целью упрощения его структуры. Из-за высокой лабильности молекул фукоидана выходы модифицированных препаратов часто невелики, откуда следует, что значительная часть информации о структуре полисахарида, включая информацию о минорных элементах, теряется.
Современные методы масс-спектрометрии позволяют получать надежные и точные результаты, благодаря аналитической гибкости, высокой чувствительности и селективности. Использование тандемной масс-спектрометрии и ферментов (О-гликозилгидролаз, лиаз, сульфатаз) с установленной специфичностью и механизмом действия позволяет устанавливать строение полисахаридов с уточнением положений минорных элементов. Ферментативная трансформация полисахаридов представляет большой интерес, так как позволяет с высоким выходом получать новые препараты с более разнообразной биологической активностью.
Цели и задачи исследования. Целью работы является использование современных методов масс-спектрометрии для установления структурных особенностей водорастворимых полисахаридов бурых водорослей (фукоидаиов и ламииаранов) и продуктов их ферментативной трансформации, а также для изучения механизма действия и специфичности ферментов, участвующих в их трансформации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) используя сочетание масс-спектрометрических методов, исследовать структурные особенности фукоидаиов из бурых водорослей Laminaria gurjanovae, Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, Costaria costata и ламииаранов из L.
gurjanovae и L. cichorioides; 2) изучить продукты гидролиза ламинарана из L. cichorioides глюканазамц из Mbuhopecten yessoyensis и Littorina kurila; 3) изучить траисгликозшшрующую способность глюканаз из М. yessoyensis и L. kurila.
Положения, выносимые на зашиту.
~Y. Фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галактофукан блочного строения, остатки L-фукозы в котором соединены (1-»3)-гликозидными связями и сульфатированы, равно как и остатки галактозы, по С-2 и С-4.
-
Фукоидан из F. evanescens имеет протяженные участки, построенные из (1-»3)-, чередующихся (1->3)- и (1-Несвязанных остатков a-L-Fuc, а также фрагменты, содержащие минорные моносахариды Xyl, Gal, GIcA, входящие в его состав. Остатки Fuc, Xyl и Gal в основном 2-О-сульфатированы и частично сульфатированы при С-4.
-
Фукоидан изL. cichorioides является высокосульфатированным (1-»3)-а-Ь-фуканом.
-
Разветвления в фукоидане из С. costata, который имеет основную цепь в виде манноглгокуронофукана, представлены присоединенными к GlcA (1->4)-гликозидными связями олигосахаридами, построенными из 2- или 4-0-сульфатированных остатков фукозы или галактозы.
-
Истинное молекулярно-массовое распределение ламинаранов из L. gurjanovae и L. cichorioides находится в интервалах GIC21-GIC36 и GIC23-GIC33, соответственно.
-
Ферменты LV из М. yessoensis и G-I из L. kurila являются эндо-(1->3)-Р-0-глгаканазами. Они проявляют трансгликозилирующую активность в присутствии метилглюко- и ксилозидов, а также метанола. Метилгликозиды наиболее предпочтительны в качестве акцепторов.
Научная новизна и практическая иенность работы. Из 4 видов бурых водорослей в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН были вьщелены 4 образца фукоиданов и 2 образца ламинаранов. Впервые сочетанием масс-спектрометрических методов были исследованы особенности структур новых фукоиданов из бурых водорослей L. gurjanovae и С. costata, определен структурный статус минорных моносахаридов в фукоидане из F. evanescens; изучены ламинараны из L. gurjanovae и L. cichorioides и продукты их ферментативной трансформации новыми ламинаринззами. Показано, что ферменты проявляют трансгликозилирующую активность в присутствии метанола, метилглюко- и ксилозидов.
В настоящей работе впервые с целью получения доступных для МС-анализа олигосахарвдов для деградации фукоиданов были применены сольволитическое десульфатирование и автогидролиз. С помощью МАЛДИ и тандемной ИЭР МС показано, что в условиях сольволиза фукоиданы деполимеризуются до моносульфатированных олигомеров с сохранением минорных включений, МС-методы позволили установить типы гликозидных связей в олигомерах и положение сульфатных групп. Применение автогидролиза привело к получению мультисульфатированных фукоолигомеров, но при этом терялась информация о структуре минорных включений. Показано, что эти методы деградации не приемлемы для шгзкосульфатированных фукоиданов.
Впервые был применен метод МАЛДИ МС для анализа сульфатированных олигосахаридов с использованием фенилшазона D-э/штиро-пентозы в качестве матрицы. Установлено, что фукоидан из L. gurjanovae представляет собой галакгофукан блочного строения, поскольку в продуктах его деградации обнаружены фуко-, галакто- и смешанные фукогалактоолигосахариды.
Полученная информация о масс-спектрометрической фрагментации сульфатированных олигосахаридов носит фундаментальный характер и важна для дальнейших исследований связи структуры и биологической активности фукоиданов и других отрицательно заряженных полисахаридов.
Апробация работы Материалы работы были представлены на 4th European Conference on Marine Natural Products, Paris, France, 2005.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 1 тезисы доклада. Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 152 цитируемые работы.
