Содержание к диссертации
Введение
1: Литературный обзор 7
1.Масс-спектры соединений со скелетом хиназолина 9
2. Масс-спектры соединений со скелетом хиназолона-4 12
3.Масс-спектры соединений ряда 2,3-полиметилен-З, 4-дигидрохиназолина и -хиназолона-4 22
2. Обсуждение результатов исследований
1.Масс-спектры соединений-ряда 2,3-триметилен-3,4-дигидрохиназолина с заместителями в ароматической части молекулы 36
2. Масс-спектры соединений ряда 2,3-триметилен-3,4-дигидрохиназолона-4 с заместителями в ароматической части молекулы 41
3.Масс-спектры 2,3-полиметилен-З,4-дигидрохиназолонов-4 с различными заместителями у СС<) 48
4.Фрагментация 2,З-полиметилен-1,2,3,4- тетрагидрохиназолина, -хиназолона-4 и их производных 59
3 Изучение пгодуктов биотрансшрмащи ангихолинэстеразного препарата дезоксипеганина и его аналога - дезоксивазицйнона в организме животных
1.Применение различных физико-химических методов при изучении биотрансформации лекарственных препаратов 71
2. Биотрансформация некоторых хиназолоновых препаратов в организме животных и человека 80
4: Обсуждение результатов исследований 91
1.Качественный состав сумм метаболитов дезоксипеганина и дезоксивазицинона 93
а) Строение метаболита с ^"214 95
б)Строение метаболита с 1^202 97
в)Строение метаболита с М+246 105
2. Количественный анализ сумм метаболитов дезоксипеганина и дезоксивазицинона 110
а)Жалибровка прибора 113
б)Жоличественное определение метаболитов 117
Экспериментальная часть 122
Выводы 130
- Масс-спектры соединений со скелетом хиназолона-4
- Масс-спектры соединений ряда 2,3-триметилен-3,4-дигидрохиназолона-4 с заместителями в ароматической части молекулы
- Биотрансформация некоторых хиназолоновых препаратов в организме животных и человека
- Количественный анализ сумм метаболитов дезоксипеганина и дезоксивазицинона
Масс-спектры соединений со скелетом хиназолона-4
В отличии от соответствующих метоксихиназолинов в спектрах 5-,6- и 7-метоксихинолинов имеют место процессы последовательного распада метоксигруппы, о чем свидетельствуют пики ионов (М -0Н3)+ и (М - GHg - С0)+ (табл.3). Масс-спектры соединений со скелетом хиназолона-4. В обзоре Армарего [б] отмечено, что 2- и 4-гидроксихиназо-лины (Пд,е) могут находиться в трех таутомерных формах: Лактамная форма (Пе) является наиболее предпочтительной, и данные соединения в отсутствии особых условий, сдвигающих равновесие, находятся в форме соответствующих 2- и 4-хиназолонов (Пд и Пе). Отсюда резкое отличие в масс-спектрометрическом поведении последних от других гидроксихиназолинов. Основным путем распада молекулярных ионов Цц и Пе является конкурентный выброс СО и HCN в первой стадии фрагментации (табл.4), причем, если ЛҐ" хиназолона-2 элиминирует предпочтительно СО, то в спектре хиназолона-4 первичные акты фрагментации с альтернативным элиминированием СО и HCN равновероятны /ilj. Далее, ион (М - С0)+ последовательно теряет 2 молекулы HCN (схема 3). Масс-спектр продукта обменного дейтерирования Пе показан, что дейтерометка теряется в последнем шаге распада. Авторы [Ї.4] среди продуктов термического расщепления цик-лопенина и циклопенона обнаружили небольшое количество 3-метил-3,4-дигидрохиназолона-4 (У). Авторы опубликовали спектр и схему фрагментации У без подробного обсуждения, указав только на аналогию с тропановими алкалоидами при образовании фрагмента с т/2 42 (схема 4): Из схемы 4 видно, что наряду с направлением распада,характерным для хиназолона-4, имеет место распад хиназолонового скелета с элиминированием атомов С(2) иМ(3) вместе с заместителем с образованием иона при m/2 119. Однако удаление осколка HNGO во второй стадии распада по данному пути должно предполагать циклическую, а не разомкнутую форму этого иона: Хашимов и др. /Ї6] сообщили о выделении из растения PjLQCL-ПІШІ hazmaia алкалоида пегамина - 2-Су-0ксипропил)-3,4-дигид-рохиназолона-4 (УІ). Фрагментация М4" пегамина (схема 5) затрагивает в основном оксипропильный заместитель, и максимальным пиком является пик иона cm/Z 160. Образование последнего из М4" подтверждается наличием соответствующего метастабильного перехода. Масс-спектры некоторых групп соединений этого ряда представляют интерес в связи с различными перегруппировочными процессами, протекающими при участии заместителей и влиянии различных заместителей на распад хиназолонового скелета. Авторы [iTj на примере 2-метил-3(4-карбоксифенил)-3,4-ди-гидрохиназолона-4 (УШ) показали, что основным процессом распада М4" служит элиминирование заместителя от С( 2).
Наряду с этим имеет место процесс распада гетероциклического ядра с элиминированием 4-карбоксифенил-изоцианата: Элиминирование кетена подтверждено измерением элементного состава ионов. Замена заместителя при С(2) на водород или этильную группу, а также замена 2-гидроксигруппы на метоксиль-нуго функцию исключает возможность перегруппировки. Пакраши с coaBT.[22j описали фрагментацию четырех алкалоидов ряда 1,4-дигидрохиназолона-4: гликозмицина (Х1а),гликорина (XI6), гликозминина (Х1в) и арборинаСXIr). Более подробно этот распад рассмотрен в / 23], однако и там авторы отмечают, что направления вторичных процессов распада необходимо подтвердить измерением элементных составов фрагмент-ных ионов. Выброс 28 а.е.м. из иона с ttl/z 132 в спектре Х1а не обязательно должен представлять элиминирование СО. Альтернативой может служить отщепление CH N либо (Н + HCN). В случае бензильного заместителя при С(2) в спектрах соеди-нений Х1в,г наиболее интенсивным является пик иона (М - Н) , который, вероятно, имеет форму замещенного иона тропилия: Изучение спектров 2,3-замещенных 1,2,3,4-тетрагидрохина-золонов показало, что фрагментация этих соединений характеризуется в основном процессами утраты заместителя от С(2) и рет-родиеновым распадом гетероциклического кольца (схема 10); йнтенсивность процессов фрагментации в этой группе соединений зависит от характера заместителей 5]« Основным пиком в спектрах всех изомеров, за исключением ХШг, выступает пик иона (М - g)4"» причем склонность к элиминированию 1 2 уменьшается в ряду 2 = 6 5» %» Процессы ретродиенового распада, которым подвержены ионы М в спектрах соединений ХШа-е протекают с различной интенсивностью в зависимости от расположения заместителей. Наиболее благоприятствует ретродиеновому распаду М (ион CL) наличие фенильного заместителя при N (I).
Процесс распада ионов (М - і + с образованием иона I требует переноса водорода в заряженный фрагмент и наиболее отчетливо проявляется при наличии такового у атома N(3) в соединениях ХШа,в. Масс-спектры соединений ряда 2,3-полиметилен-3,4-дигид-рохиназолина и -хиназолона-4. К настоящему времени в литературе описано уже более 20 алкалоидов, в основе которых лежит трициклическая система пе- Распространенность этих объектов в растительном мире, а также химические и отчасти физические свойства обсуждены в обзорах f9,I0]. Масс-спектрометрия широко использовалась для доказательства строения большинства из них. Принятая нами система нумерации алициклического кольца в скелете пегана отличается от общепринятых систем (Ї0], однако необходима для соблюдения единообразия при описании фрагментации соединений ряда 2,3-полиметиленхиназолина. Подобная система нумерации используется авторами [2б]. Бхатнагар и Попли [27] изучали масс-спектры пеганина (ХІУа), б-гидроксипеганина (ХІУ6) и метилового эфира 6-гидроксипега-нина (ХІУв). Авторы считают, что распад пеганина ХІУа под ЗУ протекает по схеме II. Элиминирование водорода от С(4) пеганового скелета приводит к иону . Дальнейший распад алициклического кольца вместе с JL-гидроксигруппой состоит в последовательном выбросе GgH и СО с образованием иона протонированного хиназолина с ГП/? 131. Последний распадается с двустадийным элиминированием НС N аналогично хиназолину I jfllj. Менее характерное направление распада иона I состоит в удалении воды. Распад соединений ХІУ6 и ХІУв по данным авторов [27] проходит по аналогичному пути. Однако в опубликованном там же спектре метилового эфира б-гидроксипеганина ХІУв наблюдаются процессы распада с участием б-метоксигруппы, что авторами не обсуждается. Факт образования интенсивного пика иона С в масс-спектре пеганина позже был использован Хашимовым, Тележенецкой, Жаре-кеевым и Юнусовым в серии работ [28,29,30,31] по установлению строения ряда алкалоидов РіШШШП ШіггпаІй(ХУ-ХУПа,б). Хашимов [32J обратил внимание на то, что в спектре пегани-дина ХУПа наблюдаются пики фрагментных ионов, соответствующих распаду иона Z по схеме 10. Во всех остапьных работах пути распада этого иона не обсуждаются из-за незначительной интенсивности таковых. Жарекеев и Хашимов с соавт. [33J выделили из PfcJdiUUR (Ш21ТЮ!й бимолекулярный алкалоид дипегин, которому приписано строение ХУШ: Спектр дипегина ХУШ характеризуется наличием М4" 365 и иона с m/z 171 (ЮО %). Авторы /33J не приводят интенсивности М дипегина. Очевидно, последняя крайне низка (менее 190. Наличие второй, карбонилсодержащей части молекулы подтверждается присутствием в спектре ХУШ пика иона слабой интенсивности с щ/2 185 (3 96). В работе J34J изучены спектры вазиколина (ХІХа) и адхатоди-на(ХІХб), выделенных из ІІЛсЛоІй UUSlC(L HUS.
Масс-спектры соединений ряда 2,3-триметилен-3,4-дигидрохиназолона-4 с заместителями в ароматической части молекулы
Появление карбонильной функции при С(4) дигидрохиназоли-нового скелета должно было бы существенно изменить характер фрагментации, однако спектры дезоксивазицинона (2,3-тримети-лен-3,4-дигидрохиназолона-4) ХХП и его 5-,6-,7- и 8-гидрокси-аналогов (ХХХШа-в,ХХПа) не показывают существенных пиков ионов помимо М+ и (М - Н)+ (табл.7) Наличие карбонильного заместителя при С(4) исключает возможность стабилизации иона (М - І)+ в форме хиназолинового иона 1. В этом случае отрыв водорода (как будет показано далее) вероятнее всего происходит из алициклического кольца с образованием иона :
При анализе спектров группы гидроксиизомеров дезоксивази-цинона ХХХШа-в, ХШа (табл.7) было установлено нерезкое отличие последних между собой и сходство в направлениях фрагментации с незамещенным образцом ХХП. Как и в случае дезоксипегани-на и его гидроксианалогов, в этой группе соединений первоначальные акты фрагментации затрагивают алициклическое кольцо. Так, измерение элементных составов ионов (М - 26)+ показало, что они соответствуют удалению 02 из + Необходимо отметить, также процессы элиминирования СО и НСО, которым соответствуют пики ионов (М - 28)+ и (М - 29)+. Так как эти ионы наблюдаются не только в спектрах гидроксисоединений ХХХШа-в, ХХПа, но и собственно в дезоксивазициноне ХХП, то вклады процессов отрыва этих осколков из разных положений М+ трудно учитывать без специальных опытов с введением изотопных меток. Исключение составляет выброс СО из М 8-гидроксиизомера, в спектре которого пик иона (М - 28)+ имеет заметно большую интенсивность. Аналогичный процесс рассматривался в масс-спектре 8-гидроксихинолина [12]. Выброс СО с участием 8-гидроксигруппы облегчен, по мнению авторов [12], акцептированием гидроксильно-го водорода атомом азота N (I). Однако в спектре 8-гидроксихина-золина Пг этот процесс проявляется слабо, вероятно, вследствие сильной конкуренции процесса элиминирования HCN. Пики ионов этой группы соединений в области средних и низких масс носят мультиплетный характер (см. Приложение I), что свидетельствует о многообразии вторичных процессов распада. Введение метоксигруппы в различные положения ароматического кольца А дигидрохиназолоновой системы (соединения ХХХШг-ж) приводит к появлению процессов фрагментации с участием заместителя. Как и в предыдущих сериях веществ, спектры этой группы соединений характеризуются интенсивными пиками ионов М и СМ - Н) .
В целом же характер фрагментации всех четырех изомеров различен (табл.8). Спектр 5-метоксиизомера ХХХШг показывает утрату метоксильно-го радикала, либо, через перегруппировочный процесс, включающий миграцию водородов метоксильной группы, потерю НСО из М+ с образованием соответствующих ионов ciTl/2 185 и 187 (табл.8). Эти конкурентные процессы протекают настолько легко, что, в отличии от других изомеров, интенсивность М и (М - Н)+ в спектре ХХХШг заметно понижена. Перегруппировочный процесс проходит через переходное состояние с участием С( 4)-карбонильной группы по схеме 20. Методом метастабильной дефокусировки (ВД) иона с т/2 170 и измерением элементных составов ионов с т/2 199, 187 и 170 удалось показать, что при распаде М+ ХХХШг имеют место процессы последоватеяьного элиминирования формияьного и гидроксильно- го радикалов (схема 20). Менее характерным является выброс HgCO и образование иона с ГП/2 185. Спектр 6-метоксипроизводного ХХХЩц показывает в первых ак-тах фрагментации последовательную утрату СНд и СО, образуя соответственно ионы с m/j? 201 и 173. Интенсивность (М - 1)+ пика по сравнению с другими изомерами относительно слабая (табл.8). Дальнейший распад иона с т/г 173 происходит путем альтернативного удаления СО либо с образованием ионов с т/2 145. Последние распадаются по множественным путям, элиминируя в различных вариантах частицы С2Н3, HCNjHgCNjCO и CgH и образуя триплеты ионов с т/В 117,118 (схема 21). Все предложенные направления фрагментации ХХХЩц подтверждаются наличием соответствующих метастабильных пиков ионов. Спектр 7-метоксидезоксивазицинона во многом напоминает спектр незамещенного соединения ХХП, прежде всего интенсивностью пиков ионов М+ и (М - 1)+ (табл.8). Процессы распада метокси-группы в этом соединении в значительной степени подавлены. Измерение элементного состава фрагментных ионов подтвердило, что несвойственные другим изомерам ионы с т/2 190,160,134 и 106 об- разованы при распаде колец В и С. Ввиду того, что схема образования данных фрагментов, в особенности иона с т/2 160 не была вполне очевидной, был использован метод ВД. При этом выяснили, что предшественником ионов с m/z 160 и 134 является ион с т/2 188, пик которого в спектре ХХХШе малоинтенсивен. Измерение элементного состава показало, что последний образуется из М+ путем альтернативной утраты частиц CgH и CHgN и далее подвержен распаду с образованием дублета ионов с т/2 160 С схема 22), Пик иона (М - 26)+ соответствует утрате части алицикличес-кого кольца в виде молекулы ацетилена и наблюдается также в спектре незамещенного соединения ХХЇЇ.
Направления распада, свойственные другим изомерам, имеют место и в спектре ХХХШе, но вклад их невелик, так как распад или отрыв заместителя в спектре 7-метоксиизомера приводит к энергетически менее выгодным фрагментам (сравните ионы і М - СНд)+ в схемах 21 и 22). Масс-спектр 8-метоксидезоксивазицинона ХХХШж характеризуется сильными процессами распада с участием метоксигруппы (табл.8). Существенное влияние на ход фрагментации М+ ХХХШж оказывает соседний атом азота N ( I), вследствие чего пути фрагментации 8-метоксиизомера анаяогичны таковым в 8-метоксихина-золине [II] и в 8-метоксихинолине [12] (стр. II). Сильный (М - 1)+ пик иона обусловлен в случае 8-метоксизамещения удалением водорода из метоксильной группы (схема 23). Далее, (М - 1)+ ион может элиминировать еще 2 атома водорода также из метоксигруппы. Утверждение авторов [12] о характеристичности (М - 3)+ пика иона для 8-метоксизамещения в хинолиновых системах можно распространить и на 3,4-дигидрохиназолоновые системы, но нельзя распространять на дигидрохиназолиновые объекты. Так, в масс-спектрах дезоксипеганина ХУ и его гидрокси-и метоксианалогов (табл. 5,6) тоже наблюдается пик иона (М - 3)+, однако в этом случае последний может быть обусловлен удалением двух атомов водорода из кольца С хиназолинового иона е. Происходящая при этом ароматизация кольца С направляет данный процесс. В 5-метоксиизомере ХХХШг также отмечено наличие (М - 3)+ иона. Вероятно, поскольку наблюдается определенное сходство между спектрами ХХХШг и ХХХШж, механизм образования иона (M - 3)+ для этих двух соединений может быть аналогичен. Вторым основным направлением распада ХХХШж является элими-нирование НСО (схема 23). Механизм этого процесса детально рассмотрен на примере 8-метоксихинолина [12j. Наличие метастабиль-ного пика позволяет утверждать, что далее ион с ні /г 187 теряет водород, образуя ион с т/г 186. Измерение элементного состава иона с т/2 158 показывает, что последний образуется из иона с m /Z 186 утратой СО. Таким образом, метоксиизомеры ХХХШг-ж, в отличие от меток-сихиназолинов ХХХПг-ж, показали качественно различную фрагментацию. Синтезы соединений ХХХПа-в,д-ж, ХХХШа-в,д-ж и ХХПа опубликованы в работе 44], ХХХПг и ХХХШг - в [43]. Масс-спектры 2,З-полиметилен-3,4-дигидрохиназолонов-4 с различными заместителями у С( ). Изучаемая серия объектов представлена соединениями с различной величиной алициклического кольца - производными 2,3-триметилен-3,4-дигицрохиназолона-4 (дезоксивазицинона,ХХП), 2,3-тетраметилен-3,4-дигицрохиназолона-4 XXX и 2,3-пентамети-
Биотрансформация некоторых хиназолоновых препаратов в организме животных и человека
Одним из наиболее изученных с точки зрения биотрансформации медицинских препаратов является 2-метил-3-о-толил-3,4-дигидрохи-назолон-4 УП (торговое название метоквалон, реванол). В настоящее время он является одним из самых распространенных снотворных небарбитурового ряда [4]. Впервые метаболизм метаквалона исследовал Акаги с сотр.[80j. Авторы спектрофотометрическим определением УП показали, что ме-таквалон практически не выделяется в неизмененной форме у человека. Впоследствии [8І] был вьщелен метаболит, которому на основании данных Ж,УФ и ЯМР-спектроскопии и различных химических превращений приписано строение 2-метил-3-(2 -оксиметилфенил)-3,4-дигидрохиназолона-4 (УПа) Байер J82j изучал возможности применения различных способов гидролиза коньюгированных продуктов метаболизма метаквалона: I)гидролиз ft-глюкуронидазой ; 2)гидролиз смесью Ь-глюкуронидазы и сульфатазы ; 3)гидролиз соляной кислотой при слабом нагревании. Количественно метаболиты определялись по выходу связанного азота. Больше всего азота показали опыты с кислым гидролизом. Тот факт, что при гидролизе по первому способу выход азота меньше, чем по второму, указывает, вероятнее всего, на наличие нескольких форм коньюгации метаболитов метаквалона. Подробное исследование метаболитов метаквалона, выделенных из мочи крыс, мышей, собак и обезьян, было осуществлено Новаком с соавт./вЗ/. Наряду с небольшими количествами неизмененного препарата было вццелено б различных гидроксилсодержащих метаболитов. Авторы 1&3/ применяли три различные методики гидролиза продуктов конъюгации: I)кислотный гидролиз соляной кислотой (3 час, 80С); 2)два последовательных ферментативных гидролиза JJ-глюкуро- нидазой (2x12 час, 37С); 3)перколирование мочи на ионообменной колонке, элюирование метаболитов 2% mm раствором аммиака, затем ферментативный гидролиз по п.2. Метаболиты из гидролизатов экстрагировали етилацетатом. Количество продуктов биотрансформации примерно одинаково по всем трем методикам, однако сумма метаболитов, полученная по I), более загрязнена биогенными компонентами, чем по 2) и 3).
Суммы метаболитов подвергали препаративному разделению методом тонкослойной хроматографии, индивидуатьные метаболиты идентифицировали по R-f с синтетическими гидроксипроизводными метаквалона, а также по УФ-спектрам. Качественно картина метаболизма оказалась сходной у крыс и мышей с одной стороны, и у собак и обезьян - с другой. В сумме метаболитов, полученных из мочи собак и обезьян, не было найдено метаболита УПе. Авторы [&3] проверили токсичность выделенных метаболитов. ВеличинаLI Q ДЛЯ всех соединений, исключая УПб, оказалась ниже, чем у исходного препарата. Одновременно с этим Прайс с соавт. опубликовали серию работ 84-8б] о метаболизме метаквалона в организме человека. В первой работе /84] была описана аналитическая методика выделения метаболитов. Мочу при рН 8,0-9,0 экстрагировали эфиром (экстракт I). Оставшийся водный раствор подвергали гидролизу в течение 12 час, с 5%-ной соляной кислотой, затем вновь экстрагировали эфиром при рН 8,0-9,0 (экстракт 2). Экстракты I и 2 раздельно хровяато-графировали на колонке с силикагелем изопропиловым эфиром и его смесями с петролейним эфиром в различных соотношениях. Таким образом, было выделено 13 соединений. На основе ИК-спектров и Rf при сравнении с синтетическтш образцами четыре из них идентифицированы с метаболитами УПа [81/» УПб,УПг,УЦц /83] и установлено строение метаболита УПж - 6-гидрокси-2-метил-3(3 -гидрокси-2 -ме-тилфенил-3,4-дигидрохиназолона-4: Строение еще двух метаболитов метаквалона, выделенных из мочи человека, установлено авторами J87J. Один из метаболитов, выделенный из негидролизованной мочи, оказался идентичным метаболиту УПа, ранее найденному авторами /81,83 в экстрактах после гидролиза (ИК,ПМР и масс-спектры), для второго предложено строение 2-метил-3-(2-метил-4-гидрокси-5-метоксифенил)-3,4-дигидрохи-назолона-4 (УПз) Для доказательства строения метаболита УПз использовали данные ПМР-спектров всех шести гидроксиметоксиизомеров УПа. В этой же работе [87] изучены масс-спектры метаквалона УП и метаболита УПа. Спектры соединений, изомерных УПз, не обсуждаются вследствие их малой информативности. Направления фрагментации УПа-подтверждены изучением спектра дейтероаналога и измерением элементного состава основных ионов. В работе (88] изучены метаболические превращения 2-метил-3(2 -хлорфенил)-3,4-дигидрохиназолона-4 (ХХКУП) в организме человека. Методика выделения метаболитов несколько отличалась от описанных вше. мочу добровольцев, получивших препарат ХХХУП (меклоквалон), доводили до рН 3 и экстрагировали эфиром (экстракт до гидролиза,I). Оставшуюся водную фазу подвергали гидролизу с соляной кислотой (экстракт после гидролиза,2). Экстракты I и 2 подвергали препаративному раздечению методом ТСХ и колоночной хроматографии. Помимо четырех продуктов гидроксилирования исходного препарата ХХХШа-г ( 95%введенной дозы) были обнаружены три минорных продукта ХХХУПд-ж биотрансформации меклоквалона (схема 40). Направления фрагментации УПа-подтверждены изучением спектра дейтероаналога и измерением элементного состава основных ионов. В работе (88] изучены метаболические превращения 2-метил-3(2 -хлорфенил)-3,4-дигидрохиназолона-4 (ХХКУП) в организме человека.
Методика выделения метаболитов несколько отличалась от описанных вше. мочу добровольцев, получивших препарат ХХХУП (меклоквалон), доводили до рН 3 и экстрагировали эфиром (экстракт до гидролиза,I). Оставшуюся водную фазу подвергали гидролизу с соляной кислотой (экстракт после гидролиза,2). Экстракты I и 2 подвергали препаративному раздечению методом ТСХ и колоночной хроматографии. Помимо четырех продуктов гидроксилирования исходного препарата ХХХШа-г ( 95%введенной дозы) были обнаружены три минорных продукта ХХХУПд-ж биотрансформации меклоквалона (схема 40). В работе (92] авторы определяли УЇІ флюорометрическим методом в форме 1,2,3,4-тетрагидропроизводного в пределах концентраций 0,01-100Jir/мл. Предел детектирования составил 2нг. в 0,2 мл, Барри [93] провел газ-хровдатографическое определение метак-валона в плазме человека. В качестве внутреннего стандарта был использован бутобарбитон. Калибровочный график показал линейную зависимость в пределах 0,1-1,0у г метаквалона. Аналогичная ра- бота была позже опубликована Митчардом и Вильямсоном J94J . Авторы сообщили об определении метаквалона в плазме, эритроцитах и моче человека. Нижний предел определения составил 0,02 яг/мл. Комплексное исследование свободных и связанных метаболитов метаквалона УП методом ГХ-МС опубликовано в серии работ скандинавских исследователей /95-97/. Авторы рассматривали случай терапевтического приема препаратов, содержащих УП, а также ряд криминальных случаев, когда последний послужил причиной летального исхода. Среди свободных и связанных метаболитов метаквалона, выделенных из крови, печени и мочи человека, помимо доказанных ранее (84-8 , авторами [9б] было зарегистрировано еще три метаболита неустановленного строения. Методика выделения метаболитов мало отличается от предыдущих работ. Для повышения летучести гидроксилированных продуктов метаболизма в системе ГХ-МС последние подвергали силилированию. Отмечено также, что при гидролизе НС исходный препарат может подвергаться хлорированию по метипьной группе толильного заместителя, /96]. Количественный анализ метаболитов в форме их силильных производных проводили методом масс-фрагментографии по характеристичным фрагментным ионам. В работе J97] показана возможность использования ЭВМ для обработки информации и идентификации метаболитов метаквалона. Мак Рейнольде с соавт. J&8/ провели количественное масс-спектрометрическое определение метаквалона УП и его б-гидрокси-метаболита УПд в моче человека. Авторы использовали масс-спектрометр полевой десорбции и полидейтеромеченый стандарт Ш -метаква-лон). Количественно метаквалон и его метаболит определили по соотношению интенсивностей М+ ионов к таковым Df-аналога, взятого в качестве внутреннего стандарта.Нижний предел определения составил 200 нг/мя.
Количественный анализ сумм метаболитов дезоксипеганина и дезоксивазицинона
Как показали наши исследования [і02,103], суммы свободных метаболитов ДОП и ДОВ характеризуются наличием исходных препаратов ХУ, ХХП, вазицинона ХХШ, изовазицинона XLI и метаболита XL. Суммы связанных метаболитов содержат дезоксивазицинон ХХП, вазицинон ХХШ и метаболит ХІЛІ. Количественное определение дезоксипеганина ХУ методами ГЯХ и ГХ-МС невозможно в силу лабильности последнего С стр. 92). Совместное определение дезоксивазицинона ХХП, вазицинона ХХШ и изовазицинона XLI теми же методами осложняется необходимостью силилирования гидроксилсодержащих метаболитов. УФ-спектроскопи-ческий метод может быть применен для приближенного суммарного определения метаболитов изучаемых препаратов, так как основные полосы поглощения соединений ХХП и ХХШ близки и по частотам и по коэффициентам экстинции (ХХП -,= 6918 при 267 нм, ХХШ -= 8912 при 269 нм). Кроме того, низкое значение коэффициента экстинции дезоксипеганина ХУ (стр.129) ограничивает УФ-метод по чувствительности и предъявляет повышенные требования к чистоте сумм метаболитов от биогенных примесей. Для: проведения количественного анализа сумм метаболитов ДОП и ДОВ мы выбрали метод ИИТ, так как последний позволяет определять компоненты любой сложной смеси соединений при соблюдении следующих условий: I)Возможность выбора в спектре смеси аналитических пиков для независимого определения каждого из компонентов. 2)йспользование прибора высокого разрешения для отделения аналитических пиков от изобарных ионов биогенных примесей. 3)Температурный режим, обеспечивающий потное испарение всех анализируемых компонентов смеси. 4)Наличие образцов определяемых компонентов для калибровки прибора. Все указанные требования были выполнены для решаемой задачи. В качестве стандартов служили исходные препараты ХУ и ХХУЇЇ, а для суммарного определения вазицинона ХХШ и изовазицинона XLI - вазицинон. Для определения минорного компонента XL был выбран его аналог - б-метоксидезоксивазицинон ХХХШб. В качестве аналитических пиков использовали пики М метаболитов. Спектры модельных соединений показывают, что ни в одном случае не наблюдается перекрывания аналитических пиков пиками фрагментных ионов остальных метаболитов. Кроме того, аналитические пики метаболитов обладают максимальной интенсивностью в спектрах индивидуальных соединений, что обеспечивает высокую чувствительность прибора при проведении анализа.
Отсутствие подходящего стандарта для определения метаболита ХЬПб не позволило провести количественное определение последнего. Для проверки взаимного влияния определяемых компонентов сумм метаболитов были записаны кривые ионного тока (ЙТ) М+ модельных соединений дезоксипеганина ХУ, дезоксивазицинона ХХП и вазицинона ХХШ (рис.10), а также кривые ионного тока М+ указанных соединений при введении в прибор модельной смеси с заведомо известным количественным составом. Формы кривых мало отли- чаются от таковых индивидуальных соецинений, а пяощади под кривыми ионного тока воспроизводятся с ошибкой 3-5 & Необходимо отметить, что для сопоставимых количеств веществ форма кривой ИТ является характеристичной. Так, в случае соединений ХХП и ХХХЩд время испарения пробы меньше, чем для соединений ХХШ и ХУ, что обуславливает наличие более четкого максимума на кривой ИТ в первых двух случаях. Причиной этого явления может служить различие в полярности указанных соединений. (R-IOOOO) оптимальным является диапазон навесок определяемых компонентов в пределах 2 10 - 2 10 г. Увеличение верхней границы приводит к появлению "эффекта памяти" прибора и существенно повышает время записи. Навеска порядка 10" г практически является пределом чувствительности прибора к определяемым веществам в режиме R— 10000. Температура испарения пробы была подобрана опытным путем и составила 100-120. Повышение температуры приводит к быстрому испарению пробы и соответственно увеличивает ошибку определения, понижение вызывает"размывание"кривой, что осложняет измерение площади под ней. Калибровка прибора. Калибровочные графики для индивидуальных веществ строили как функцию логарифма измеряемой площади под кривой ионного тока от логарифма навески пробы, введенной в масс-спектрометр.
Площадь Сі] рассчитывали по формуле (2). Вследствие малых значений интенсивностей пиков У о и y (начало и конец испарения пробы) последние не учитывались и формула приобретала вид: где h - расстояние на диаграммной ленте между соседними пиками (мм), Уі - интенсивность соответствующего пика (мм). Поскольку развертка магнитного поля прибора производится в прямом и обратном направлении, величина. : записывается дважды. Площади, измеренные для соответствующих направлений раз вертки, различаяись на 5-8%, вследствие чего все расчеты прово дили только для прямой развертки. Результаты каяибровки прибо ра в системе координат (нг) для каждого вещества обрабатывали методом регрессивного анаяиза LI04J в логарифми- Трудность проведения количественного анализа на масс-спектрометре обусловлена изменениями чувствительности прибора во времени, имеющими по большей части случайный характер. Авторы [70] отмечали, что это явление служит одной из причин, снижающих точность анализа. В табл. 20 для примера приведено сопоставление результатов анализа одной и той же пробы в течение смены и в разные дни работы прибора. Из таблицы 20 видно, что при проведении коррекции воспроизводимость определений значительно повышается. Количественный анализ без учета изменения чувствительности прибора приводил бы к значительным ошибкам. С другой стороны, известны и другие причины, согласно которым юстировка прибора не всегда возвращает первоначальное значение чувствительности. Принимая во внимание эти факторы, мы разработали следующую методику определения метаболитов с учетом изменения чувствительности прибора во времени. Уравнение калибровочной зависимости имеет вид (6). Изменение чувствительности приводит к изменению коэффициента CL, а коэффициент о (тангенс угла наклона калибровочного графика) остается неизмененным (рис. II). Уравнение (7) может служить для расчета содержания метаболита с учетом изменившейся чувствительности прибора. Для контроля следует анализировать станцарт, сумму метаболитов и вновь стандарт. В этом случае, если изменение чувствительности прибора значительно, будет наблюдаться заметное различие в величинах площадей двух определений стандартной навески и анализ следует повторить до получения воспроизводимых результатов. Для определения относительной чувствительности прибора к анализируемым веществам (табл. 21) мы воспользовались формулой (5) (стр.77 ). В качестве эталона, чувствительность к которому принята за 1,000, был взят 6-метоксидезоксивазицинон ХХХЩц.
