Содержание к диссертации
Введение
1. Введение .4
2. Литературный обзор
2.1. Распространение, состав и структура полисахаридов бурых водорослей .6
2.2. Ферментативная трансформация полисахаридов
2.2.1. Гликозилтрансферазы 16
2.2.2. Гликозилгидролазы 17
2.3. Биологическое действие полисахаридов бурых водорослей .19
2.3.1. Иммунотропное действие 19
2.3.1.1. Действие на фагоцитирующие клетки 19
2.3.1.2. Влияние полисахаридов из бурых водорослей на клеточные иммунные реакции и миграцию иммунокомпетентных клеток 20
2.3.1.3. Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию и свойства лимфокинов и монокинов 22
2.3.1.4. Влияние на систему комплемента...
2.3.2. Противоопухолевая активность 24
2.3.3. Антивирусная, антибактериальная и антипаразитарная активность и влияние на резистентность к инфекциям 26
2.3.4. Прочие, не иммунотропные свойства, и исследования на токсичность 27
2.3.5. Действие фукоиданов на систему свертывания крови. Связь структуры и функции 28
3. Результаты и обсуждение :... 35
3.1. Водорастворимые полисахариды бурых водорослей дальнего востока 35
3.1.1 Новый метод выделения полисахаридов из бурых водорослей 35
3.1.2. Содержание и структурные характеристики водорастворимых полисахаридов бурых водорослей в зависимости от условий произрастания 39
3.1.3. Структурные характеристики фукоиданов 40
3.1.4. Структурные характеристики ламшаранов
3.2. Особенности действия эндо-1,3-р-0-глюканаз из морских моллюсков на различные p-d-глюканы 47
3.3. Некоторые свойства эндоглюканаз ЛО и ЛГУ
3.3.1. Сравнение энзиматических и структурных характеристик эндоглюканаз ЛО и Л1У... 54
3.3.2. Иммунохимическое сравнение эндоглюканаз ЛО и Л1.
3.4. Получение биологически активных веществ при ферментативном преобразовании ламинаранов. Транслам 57
3.5. Получение и использование антител к биологически активному глюкану -трансламу - 61
3.6. Действие фукоиданов и ламинаранов на систему комплемента 4. Экспериментальная часть 70
5. Выводы .78
6. Список использованных источников
- Ферментативная трансформация полисахаридов
- Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию и свойства лимфокинов и монокинов
- Содержание и структурные характеристики водорастворимых полисахаридов бурых водорослей в зависимости от условий произрастания
- Получение биологически активных веществ при ферментативном преобразовании ламинаранов. Транслам
Ферментативная трансформация полисахаридов
Среди полисахаридов наиболее известным и изученным процессом их ферментативной трансформации является процесс метаболизма крахмала, который включает как ферментативный синтез, так и ферментативный гидролиз крахмала.
Как известно, ферменты, осуществляющие синтез, т.е. катализирующие перенос остатков моносахаридов на субстрат или его фрагменты, получили название гликозилтрансфераз (КФ 2.4.). Множественные молекулярные формы (изоферменты) а-1,4-глюкозилтрансфераз обнаружены в растениях [49-52] и водорослях [53]. Они делятся на две главные группы: ферменты, ответственные за синтез а-1,4-связи (фосфорилазы КФ 2.4.1.1 и синтетазы КФ 2.4.1.11) и ветвящие ферменты, КФ 2.4.1.18, ответственные за образование а-1,6-связи.
Наиболее изучен комплекс амилаз картофеля [54]. Синтез а-1,4-глюкана (крахмала или гликогена) начинается с реакции образования ADP-глюкозы, которая катализируется ADP-глюкозпирофосфорилазой (КФ 2.7.7.23.). Далее с помощью крахмал-синтетазы ADP-глюкоза присоединяется к невосстанавливающему концу линейной а-1,4-глюкозидной цепи. Оба фермента способны использовать большое разнообразие а-1,4-глюкановых цепей в качестве акцепторов, начиная от мальтозы и кончая молекулами амилозы, а также относительно короткие участки а-1,4-глюкановых цепей, обнаруженные в "разветвленных 1,4;1,6-а-декстринах" и в наружных ветвях амилопектина. Название "разветвленный 1,4;1,6-а-декстрин" относится к олигосахаридам, построенным из a-D-глюкопиранозных остатков, соединенных главным образом гликозидными (а-1 4)-связями, но имеющими одну или более точек ветвления по С6 положению. Если акцептором служит а-1,4-глюкан, то крахмал-синтетаза катализирует образование амилозы. Однако, поскольку в -качестве акцептора могут выступать разветвленные 1,4;1,6-а-декстрины, крахмал-синтетаза может также участвовать в биосинтезе амилопектина.
Амилопектин образуется путем совместного действия крахмал-синтетазы, катализирующей присоединение a-D-глюкопиранозных остатков а-1,4-глюкозидными связями, и а-1,6-ветвящего фермента (первоначально названного Q-ферментом). Растительный ветвящий фермент или а-1,4-глюкан: а-глюкан 6-глюкозилтрансфераза был впервые обнаружен в картофеле [49]. In vitro ветвящие ферменты превращают амилозу в амилопектин-подобный полисахарид, который соответствует нативному амилопектину по длине цепи, растворимости, способности окрашиваться иодом. Этот фермент катализирует расщепление гликозидной связи и переносит олигосахаридный сегмент от невосстанавливающего конца цепи а-1,4-глюкана (например, молекулы амилозы) к неконцевому глюкозильному остатку примыкающей а-1,4-глюкановой цепи. Вставленный фрагмент прикрепляется к внутреннему глюкозильному остатку посредством а-1— 6-связи. Акцептором а-1,4-глюкановой цепи может быть другая молекула амилозы или наружная ветвь растущей молекулы амилопектина; как бы то ни было, новая невосстанавливающая концевая группа добавляется к молекуле акцептора, который может удлиняться дальше под действием крахмал-синтетазы. Удлиненная цепь может ветвиться дальше, за счет присоединения следующего фрагмента от амилозы под действием Q-фермента. Представляется вероятным, что наружная ветвь растущей молекулы амилопектина может служить как донором олигосахаридного фрагмента, так и его акцептором. Повторные ветвления и удлинения цепи в конечном счете приводят к образованию молекулы амилопектина [55].
В процессе деградации крахмала участвуют другие ферменты. В растительных тканях крахмал может расщепляться до составляющих его моносахаридов под действием нескольких ферментов. Все эти ферменты - гидролазы, за исключением крахмал-фосфорилазы (КФ 2.4.1.1.) (иногда называемой Р-ферментом), которая является глюкозилтрансферазой. К числу гидролаз, участвующих в ращеплении крахмала, относятся a-амилаза, 1,4-а-Б-глюкан глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1, 3-амилаза, 1,4-сс-0-глюкан мальтогидролаза КФ 3.2.1.2, амилопектин-6 -18-глюканогидролаза или пуллулан а-1,6-глюканогидролаза КФ 3.2.1.41, олиго-1,6-глюкозидаза или олигосахарид а-1,6-глюкогидролаза КФ 3.2.1.10 и а-глюкозидаза, a-D-глюкозид глюканогидролаза КФ 3.2.1.20. Помимо этих имеются промежуточные формы a-амилаз, одна из которых - неопуллуланаза из Bacillus stearothermohyilus IRS 40. Этот фермент на одном активном центре катализирует четыре типа реакций: гидролиз а-1,4- и а-1,6-глюкозидные связи, а также трансгликозилирование с образованием а-1,4- и а-1,6-глюкозидных связей [56]. В работе был проведен анализ первичной аминокислотной последовательности ферментов, принадлежащих к семейству а-амилаз (эндо-1,4-ос-0-глюканаз). Показано, что, несмотря на разницу в специфичности, ферменты имеют в аминокислотной последовательности четыре консервативные области.
Исходя из гомологии аминокислотной последовательности, ветвящие ферменты подразделяют на два типа. Ферменты обоих типов присутствуют в растении и отличаются сродством к длине углеводной цепи [54,57]. Ферменты, принадлежащие к типу А обладают высокой скоростью ветвления с использованием амилозы в качестве субстрата, в то время как ферменты, составляющие тип Б имеют низкий уровень ветвящей активности на амилозе. Эти различия в кинетических свойствах, позволяют предположить, что каждая из этих изоформ играет особую роль в синтезе крахмала.
Специфичность таких ферментов трудно изучать. Главное условие при очистке ветвящих ферментов - получить препарат полностью свободный от примеси ферментов, которые способны модифицировать субстраты и продукты, являющиеся результатом ветвления полисахарида.
Таким образом, ветвящие ферменты могут катализировать расщепление о 1- 4 глюкозидной связи и перенос гликоновой части субстрата на акцептор, которым может быть фрагмент амилозы или амилопектина, с образованием а-1 6 глюкозидной связи. Эти ферменты участвуют в процессе образования амилопектин-подобных полисахаридов и результатом действия именно этих ферментов является образование полисахаридов с различными физико-химическими свойствами.
Влияние сульфатированных полисахаридов бурых водорослей на продукцию и свойства лимфокинов и монокинов
Часть данной работы посвящена исследованиям по распространению и установлению структуры P-D-глюканов в различных водорослях, разработке новых методов выделения и анализа 1,3; 1,6-Р-0-глюкоолиго- и полисахаридов. Это определяется в первую очередь тем, что эти глюканы являются субстратами 1,3-(3-0-глюканаз и необходимы для изучения их специфичности и механизмов действия. Анализ известных в настоящее время способов получения водорастворимых полисахаридов бурых водорослей показывает, что процессы их выделения имеют нескольких общих стадий [108,148,149].
1. Удаление низкомолекулярных веществ экстракцией различными растворителями [148,149], эту стадию пропускают очень редко [108]. Обычно для выделения полисахаридов используют высушенную водоросль.
2. Экстракция при температуре 20-25С и 60-90С водорастворимых полисахаридов из измельченной водоросли или деионизированной и обезжиренной водоросли водой или водой с добавлением СаСЬ, или слабыми кислотами с добавлением формальдегида или без него [108,148,149].
3. Разделение ламинарана и фукоидана либо осаждением фукоидана в виде комплексов его с цетавлоном, а также анионообменными смолами, на которых фукоидан сорбируется. Ламинаран остается в растворе [148,149].
Нами разработана методика препаративного разделения водорастворимых полисахаридов бурых водорослей - фукоидана и ламинарана, отработанная на примере распространенных на Дальнем Востоке видов Laminaria cichorioides, L. japonica и Fucus evanescens и использованная для установления зависимости содержания этих полисахаридов от вида водоросли, сезона сбора, места обитания и части таллома [150,151].
Фракции фукоиданов, полученные из F. evanescens имеют в названии сокращение Fe, из L.cichoriodes - Lc, из L.japonica - Lj. Фракции, выделенные из водоросли F. evanescens, заготовленной на о. Итуруп или Парамушир, имеют в названии обозначение (И) или (П), в бухте Кратерной - (К). Фракции фукоиданов обозначены F, ламинаранов - L, нижний индекс обозначает процент этанола в водно-спиртовых растворах, использованных для элюирования фракции с гидрофобного носителя Полихрома-1.
В качестве сорбента был использован гидрофобный сорбент политетрафторэтилен (Полихром-1), свойством которого оказалась способность избирательно сорбировать 1,3;1,6-(3-0-глюкоолиго- и полисахариды [149-152]. Емкость данного сорбента по отношению к ламинаранам из вышеназванных водорослей составляла около 10 г/кг сорбента вне зависимости от их структуры. Известно, что Полихром-1 не сорбирует заряженные вещества и избирательно сорбирует вещества, обладающие гидрофобными свойствами: например, некоторые гликозиды [153], белки и пептиды [154], но примеров использования Полихрома-1 для разделения нейтральных и сульфатированных полисахаридов в литературе не имеется. Потери углеводов при хроматографии на Полихроме-1 не превышают 10-15%.
Предлагаемый нами способ включает (рис. 9):
1. Последовательную обработку сухой (50%-ным водным этанолом) или, предпочтительнее, свежей или свежезамороженной бурой водоросли этанолом (1:1, по весу), ацетоном и хлороформом, куда уходят частично полифенолы, низкомолекулярные вещества (в том числе пигменты, маннит, моно- и олигосахариды, аминокислоты, пептиды, липиды, иодсодержащие вещества, витамины А, В и т.д.). В результате извлекается около 30-40% веществ от сухого веса водоросли.
2. Последовательную экстракцию полисахаридов из остатка водоросли 0,1 N НС1 с добавлением (1 мл/л) 40%-ного формальдегида при комнатной температуре и водой при температуре 60-70С. Последовательная экстракция при различных температурах позволяет уже на стадии выделения фракционировать l,3;l,6-(3-D-глюканы по молекулярным массам, степени разветвленности [150]. При комнатной температуре экстрагируются более разветвленные ламинараны.
Полученные экстракты раздельно наносят на колонки с гидрофобным носителем Полихром-1. Ламинаран сорбируется гидрофобным носителем, тогда как высокосульфатированные фукоиданы нет. Дальнейшей элюцией сорбированных веществ градиентом любого рода (ступенчатого или линейного) вода-этанол можно добиться разделения 1,3;1,6-Р-0-глюкоолиго- и полисахаридов по степени
Содержание и структурные характеристики водорастворимых полисахаридов бурых водорослей в зависимости от условий произрастания
Для получения антисывороток была проведена иммунизация кроликов конъюгатом ЧСА-транслам. Антисыворотки были тестированы методом ИФА с использованием в качестве антигена коньюгата БГГ-транслам. Титры антисыворотки к полисахариду были равны 1/25000-1/51200.
Специфичность антисыворотки была исследована в реакции конкурентного ингибирования ИФА. В качестве ингибиторов использовали ламинараны с разными структурными характеристиками из бурых водорослей (Laminaria cichorioides, Fucus evanescens), транслам; пустулан - 1,6-Р-Б-глюкан из Umbillicaria russica, а также 1,3;1,6-Р-0-глюкоолигосахариды с различной степенью полимеризации. Длина олигосахаридной цепи последних была рассчитана из данных 13С-ЯМР по соотношению интегральных интенсивностей сигналов, соответствующих С1 гликозилированного атома углерода при 103,5 м.д. и С1 атома остатков глюкозы, находящегося на восстанавливающем конце углеводной цепи при 92,7 + 96,4 м.д. (а + р аномер). Количество Р-1,6-связанных остатков глюкозы в молекуле определяли из значений интегральных интенсивностей сигналов при 61,4 и 69,5 м.д., принадлежащих, соответственно, свободному и гликозилированному С6 атомам углерода. Эти данные позволяют считать степень разветвления во фракциях 1,3-P-D-глюкоолигосахаридов (п=10) равной нулю (отсутствие сигналов при 69,5 м.д.), в пентасахаридах равной 20%, а в октасахариде - 25%.
В конкурентном ИФА на планшеты сорбировался конъюгат БГГ-транслам, который конкурировал с ингибитором в растворе за связывание со специфическими полисахаридными антителами. Данные 50%-го ингибирования трансламом, ламииаранами, пустуланом и глюкоолигосахаридами с различной длиной цепи и степенью разветвления приведены в табл. 17 и рис. 21.
Наиболее активным ингибитором взаимодействия с полученной антисывороткой оказался исходный транслам (15о - 7 мкг/мл) (табл. 17, рис. 21 А).
Заметное ингибирование наблюдалось при использовании в качестве ингибиторов ламинаранов из L. cichorioides и F. evanescens (рис. 21 А). Хотя эти ламинараны и отличаются количеством Р-1,6-связанных остатков глюкозы, значения 15о для них одинаковы (15о - 40-45 мкг/мл) (табл. 17), что предполагает сходство пространственных структур этих глюканов. Таблица 17. Структурные характеристики Р-1,3;1,6-0-глюканов и действие их в реакции конкурентного ИФА Источник, образец полисахарида І50 , МКГ/МЛ Р-1- 3 :р-1- 6,% М.м., кДа Laminaria cichorioides Ламинаран Транслам 407 90:10 75:25 4-5 8-Ю Fucus evanescensЛаминаран 45 65:35 5 Umbillicaria russica Пустул ан 1000 0:100 30 Глюкоолигосахариды п = 5 166 80:20 -0,85 п = 8 38 75:25 -1,3 п=10 490 100:0 -1,65
Пустулан из U. russica ингибирует очень слабо, не достигая 50%-ного ингибирования даже при концентрации 1000 мкг/мл (рис. 21 А), что говорит о наличии в сыворотке лишь небольших количеств антител к блокам глюкозы, связанной между собой Р-1,6-глюкозидными связями.
Конкурентное ингибирование полисахаридами реакции связывания тра«слам-специфические антитела. Из 1,3;1,6-Р43-глюкоолигосахаридов наибольшую ингибирующую активность (15о = 38 мкг/мл) проявил разветвленный олигомер (СП = 8). Фракция пентаолигосахаридов, содержащая около 20% р-1,6-связанных остатков глюкозы, ингибировала слабее (I50 = 166 мкг/мл). Это, видимо, связано с более короткой длиной основной углеводной цепи. Линейный 1,3-р-0-глюкоолигосахарид (СП = 10), полученный формолизом пахимана, ингибировал в еще более высоких концентрациях (15о = 490 мкг/мл) (рис. 21Б). Это можно объяснить отсутствием р-1,6-связанных гликозидных остатков в этом глюкоолигосахариде.
Таким образом, при иммунизации кроликов конъюгатом ЧСА-транслам нами была получена антисыворотка, содержащая антитела, специфичные, в основном, к фрагментам 3-1,3 глюкана, содержащим р-1,6-связанные остатки глюкозы в разветвлении от основной цепи и частично к линейным Р-1,3-связанным остаткам глюкозы.
Конкурентный метод ИФА был далее использован для сравнения различных образцов трансламов и исходных ламинаранов. Эта часть работы проведена с целью исследования возможностей иммунохимического метода для стандартизации 1,3;1,6-P-D-глкжанов, что необходимо для создания лекарственных препаратов на основе этих полисахаридов. Известно, что структура ламинаранов зависит от вида, сезона сбора и места обитания водоросли. Образцы транслама могут отличаться, так как исходные ламинараны различаются структурными характеристиками, определенные трудности представляет контроль за глубиной прохождения ферментативной реакции в процессе получения. Можно предполагать, что пространственная структура этих глюканов различается значительно.
Для анализа были выбраны 4 образца транслама и 3 образца ламинарана из коллекции лаборатории. На полистироловые планшеты сорбировался конъюгат ОВА-транслам.
Как видно из данных табл. 18, ингибирующая активность трансламов проявляется в пределах концентраций 30-50 мкг/мл, а ламинаранов - более 125 мкг/мл. Данные значений 50%-го ингибирования показывают четкое различие исходных ламинаранов и получаемых в результате ферментативной реакции трансламов. Возможно, это связано с тем, что антисыворотки чувствительны не только к наличию в этих 1,3-Р-О-глюканах фрагментов 1,3-Р-О-связанных остатков глюкозы, имеющих разветвления по (5-1,6-связям, но и к особенностям пространственной структуры транслама. Проведенное исследование позволяет рекомендовать иммунохимический метод для определения биологически активных 1,3;1,6-(3-0-глюканов.
Повышенное активирование комплемента, также как и пониженное, неблагоприятно для организма. Особенно опасно его повышенное неконтролируемое активирование аутоиммунными комплексами, которые способны вызвать повреждение собственных клеток организма. Поэтому важен поиск новых физиологически активных веществ, корректирующих процессы активирования или ингибирования реакций системы комплемента, для лечения и профилактики патологии.
Известно, что фукоидан из Ascophyllum nodosum обладает антикомплементарной активностью [84,85]. В литературе кроме этого сообщения нет информации о подобном действии фукоиданов из других источников. Также известно, что 1,3;1,6-Р-0-глюканы (лентинан, шизофиллан, зимозан, ламинаран из Eisenia araborea) влияют на альтернативный путь системы комплемента [86]. Актуальность изучения 1,3;1,6-Р-Б-глюканов связана с действием этих веществ на иммунитет как животных, так и растений.
Получение биологически активных веществ при ферментативном преобразовании ламинаранов. Транслам
Получение полисахаридов из водорослей. Водорастворимые полисахариды бурых водорослей были выделены по методу [148] (рис. 6). Водоросль подвергали предварительной обработке спиртом, ацетоном, а затем хлороформом. Экстракцию полисахаридов из обезжиренной водоросли проводили последовательно 0.4% соляной кислотой с добавлением 1 мл/л 40% формальдегида (для связывания полифенольных соединений) при комнатной температуре (холодная экстракция) и водой при t 50-60С (горячая экстракция). Экстракты раздельно хроматографировали на гидрофобном носителе Полихром-1 (7 х 70 см) элюируя водой фукоиданы (F) и водно-спиртовыми растворами (5%, 15%) ламинараны (FL, L). Сахара во фракциях регистрировали фенол-сернокислотным методом. Высаждали полисахариды 80%-ным водным этанолом. Неразветвленный ламинаран получали деградацией по Смиту ламинарана из L. cichoriod.es.
Получение транслама. Ламинаран из L.cichoriodes (30 г) растворяли в Зл 0,05 М ацетатного буфера, рН 5,0, содержащего 0,1 М NaCl. Затем вносили эндоглюканазу Л0 (0,7-1,0 х 10" ед./мл) и инкубировали смесь при 25 С в течение суток. Инкубационную смесь наносили на колонку (7 х 65 см) Полихрома-1 (-2,5 кг). Несорбированные соединения удаляли промыванием колонки водой. При этом полностью вымывались соли и глюкоза. Элюируемые фракции начинают выходить после пропускания 3 л элюента. Поэтому при элюции и сборе каждой фракции первые 3 л элюата отбрасывали, а собирали остальной объем, содержащий углеводы. Низкомолекулярные глюкоолигосахариды элюировали 2,5%-ным водным этанолом. Глюкоолигосахариды с М.м. 3-5 кДа и непрореагировавший ламинаран вымывали 10%-ным водным этанолом, а транслам элюировали с колонки 15%-ным водным этанолом. На каждой стадии колонку отмывали до отрицательной реакции на углеводы. Все собранные фракции лиофилизовали после удаления этанола упариванием.
Регенерацию полихрома-1 проводили последовательно 50%-ным водным этанолом (10 л) и водой (10 л).
Синтез конъюгатов транслама с белками. Транслам (100 мг) растворяли в 10 мл карбонатного буфера и доводили рН раствора до 10,8 1М раствором NaOH при температуре 0С. К смеси добавляли раствор 50 мг BrCN в 2 мл ацетонитрила, выдерживали 10 мин при температуре 10С и 15 мин без охлаждения, при этом происходило снижение рН раствора до 10,3. К смеси добавляли раствор 100 мг ЧСА в 10 мл воды и оставляли при перемешивании в течение 50 мин; при этом рН раствора понижалось до 10,0. Добавляли 0,5 мл 0,5 N этаноламина, выдерживали 1 час и диализовали против воды при температуре 4С. Полученный раствор концентрировали до 5 мл ультрафильтрацией на мембране Рипор-2 (Владимир, Россия) и наносили на колонку с Toyopearl HW-60 (1,5 х 70 см). Элюцию проводили водой со скоростью 9 мл/ч, собирая фракции по 1,5 мл. Выход продуктов контролировали измерением адсорбции при 280 нм для белка и фенол-сернокислотным методом [192] на спектрофотометре СФ-26. Фракции, содержащие белок, объединяли и хранили при температуре -20С. Выход конъюгата по альбумину был 86 мг. Коньюгаты транслама с ОВА и БГГ были синтезированы по этой же методике (табл. 16).
Иммунизация кроликов. Для иммунизации кроликов был использован транслам, описанный в работе [184]. Два кролика были трехкратно иммунизированы эмульсией 0,5 мл конъюгата ЧСА-транслам (1 мг/мл) с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда подкожно во множество точек на спине с интервалом 14 дней и реиммунизированы 0,2 мл того же конъюгата внутривенно через 30 дней. Кровь собирали через 15 дней после последней иммунизации, сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при температуре - 4С.
Тестирование антисывороток на содержание антител к полисахариду. Титрование антисывороток проводили на полистироловых планшетах (Dynatech, Швейцария) с предварительно сорбированным конъюгатом БГТ-транслам (0,1 мл, 1 мкг/мл в 0,01М карбонатном буфере, 12 ч при температуре 4С) последовательным двукратным разведением сыворотки в 0,01М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0Д5М NaCl, с твином-20. В качестве контроля использовали сыворотку неиммунизированного животного. После инкубации (60 мин при температуре 37С) планшет отмывали 3 раза 0,01М фосфатным буфером с твином и добавляли 0,1 мл раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами барана к иммуноглобулинам кролика в 0.01М фосфатном буфере с твином-20 в разведении 1:500. После инкубации (60 мин при температуре 37С) планшет отмывали 3 раза фосфатным буфером с твином и добавляли 0,15 мл свежеприготовленного субстратного раствора (8 мг о-фенилендиамина и 10 мкл 30% перекиси водорода в 20 мл 0,1М цитратного буфера, рН 5,0). Через 15 мин реакцию останавливали добавлением в лунки планшета по 0,05 мл 6н H2SO4 и измеряли оптическую плотность при 492 нм на сканирующем спектрофотометре Multiskan Reader (Labsystem PLUS, Финляндия).
Проведение конкурентного иммуноферментного анализа. Сорбцию конъюгата БГГ-транслам (1 мкг/мл в карбонатном буфере) проводили на полистироловых планшетах (Dynatech, Швейцария) 12 ч при температуре 4С. Несвязавшийся конъюгат удаляли, промывая планшеты 3 раза фосфатным буфером с твином. В лунки планшета с сорбированным конъюгатом вносили по 0,05 мл ингибитора с последовательным четырехкратным разведением. Исходная концентрация ингибитора - 4 мг/мл. В лунки добавили 0,05 мл раствора антисыворотки против конъюгата ЧСА-транслам в разведении 1/400 в фосфатном буфере с твином. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали сыворотку неиммунизированного животного и антисыворотку без ингибитора в разведении 1/800, соответственно. Дальнейшие стадии проводили, как и при определении титра антител. Полученные результаты рассчитывали по формуле: / = (Ш "Шо) х 100%, (ОП2 ОП0) где ОПі - оптическая плотность продукта ферментативной реакции в растворе ингибитора определенной концентрации, ОПг - оптическая плотность продукта ферментативной реакции в растворе без ингибитора, ОПо - оптическая плотность продукта ферментативной реакции в случае использования сыворотки неиммунизированного животного, I - % ингибирования реакции. Значение каждой точки рассчитывали как среднее арифметическое из трех параллельных экспериментов.
Метод определения степени активирования комплемента по альтернативному пути in vitro проводили по модифицированному методу [86]. Для реакции активирования АПК использовали желатин-вероналовый буфер (ЖВБ), рН 7,4. Реакционная смесь содержала 200 мкл сыворотки, требуемой концентрации, и мкл исследуемого образца, предварительно разведенного в 0,05М ЭГТА-ЖВБ-Mg24", рН 7,4. Манипуляцию проводили, поместив пробирки в ледяную баню. Пробирки с полученной смесью инкубировали в течение часа в термостате при температуре 37С. Затем в каждую пробирку быстро добавляли по 150 мкл рабочего буфера (0,01М ЭГТА-ЖВБ-Mg+, рН 7,4) и по 100 мкл эритроцитов кролика и выдерживали в термостате при 37С до начала лизиса в пробирке с контрольным 100% гемолизом. Для блокирования дальнейшего активирования комплемента, пробирки помещали в ледяную баню и быстро добавляли по 1 мл хорошо охлажденного раствора 0,01М ЭДТА,. После центрифугирования оптическую плотность супернатанта измеряли при длине волны 414 нм на спектрофотометре "Specol ZV" (ГДР). За 100%-ный гемолиз принимали показатель оптической плотности в контрольной пробирке с полным гемолизом. Процент гемолиза в опытных пробирках вычисляли по отношению к 100% гемолизу за вычетом показателей контроля цветности вещества, контроля цветности сыворотки и контроля эритроцитов.
