Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор
1.1. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий 9
1.2. Липополисахарид (ЛПС) - структурный компонент наружной мембраны бактерий 11
1.2.1. Строение ЛПС
1.2.2. Микрогетерогенность ЛПС
1.2.3. Макромолекулярная организация ЛПС. Поведение ЛПС в растворах
1.3. Комплексы ЛПС с белками наружной мембраны 27
1.4. Взаимодействие ЛПС с растворимыми белками макроорганизма
1.4.1. Взаимодействие ЛПС с липопротеинами, с ЛПС-связывающими белками и белками, увеличивающими бактерицидную проницаемость
1.4.2. Взаимодействие ЛПС с гемоглобином, альбумином, лактоферинами, лизоцимом.
1.5. Детоксикация ЛПС.
Взаимодействие ЛПС с катионными антибиотиками 52
1.6. Связь структуры и биологической активности ЛПС
1.7. Полисахариды - хитозан и каррагинан 62
II. Обсуждение результатов.
2.1. ЛПС и ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК) из псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis 82
2.1.1. Экстракция и очистка ЛПБК
2.1.2. Сравнительная характеристика ЛПБК и ЛПС, выделенных последовательной экстракцией 90
2.1.3. Влияние условий культивирования бактерий псевдотуберкулеза на ЛПБК и ЛПС 95
2.2. Физические свойства ЛПБК и ЛПС из Yersinia pseudotuberculosis 101
2.2.1. Гомогенность ЛПС и ЛПБК
2.2.2. Молекулярно-массовое распределение ЛПС и ЛПБК 103
2.2.3. Молекулярные массы, размер, конформация и морфология ЛПБК и ЛПС 107
2.2.4. Влияние низкомолекулярных соединений на ЛПБК и ЛПС 2.2.5. Влияние температуры на макромолекулярную структуру ЛПБК и ЛПС 116
2.4. Структура и свойства полисахаридов
2.4.1. Хитозан. Получение и физико-химические свойства 132
2.4.2. Структура и свойства каррагинанов, выделенных из красных водорослей семейств: Gigartinaceae и Tichocarpaceae 139
2.5. Комплексы ЛПС с хитозаном 154
2.5.1. Влияние температуры на взаимодействие ЛПС с хитозаном. Стехиометрия комплексов ЛПС-хитозан 155
2.5.2. Влияние структурных особенностей ЛПС и степени полимеризации хитозана на процесс их взаимодействия. 165
2.5.3. Природа сил, участвующих во взаимодействии ЛПС и хитозана 175
2.5.4. Количественные параметры взаимодействия ЛПС и хитозана 182
2.5.5. Сравнительная характеристика физиологической активности ЛПС него комплекса с хитозаном. 189
2.6. Каррагинаны - ингибиторы токсического действия ЛПС 201
2.6.1. Модификация каррагинаном физиологической активности ЛПС.
2.6.2. Взаимодействие ЛПС с каррагинаном 208 Заключение
2.7. Влияние каррагинана и хитозана на неспецифическую резистентность организма при ЛПС - индуцированной эндотоксинемии. 214
2.8. Использование каррагинана в терапии пищевых токсикоинфекций, вызванных грамотрицательными бактериями. Медико-биологические испытания 217
3. Экспериментальная часть 219
3.1. Общие экспериментальные условия
3.2. Выделение, очистка и фракционирование ЛПС, ЛПБК, хитозанаи каррагинана
3.3. Гидродинамические методы
3.4. Спектроскопические методы
3.5. Электронная микроскопия и компьютерное моделирование
3.6. Физиологическая активность.
4. Выводы 235
5. Литература 237
- Взаимодействие ЛПС с липопротеинами, с ЛПС-связывающими белками и белками, увеличивающими бактерицидную проницаемость
- Сравнительная характеристика ЛПБК и ЛПС, выделенных последовательной экстракцией
- Влияние температуры на взаимодействие ЛПС с хитозаном. Стехиометрия комплексов ЛПС-хитозан
- Выделение, очистка и фракционирование ЛПС, ЛПБК, хитозанаи каррагинана
Введение к работе
В процессе своей жизнедеятельности бактериальные клетки активно взаимодействуют с окружающей средой, а патогенные бактерии - с организмом хозяина. В последнем случае это взаимодействие осуществляется, со стороны макроорганизма на уровне клеток и гуморальных факторов - компонентов иммунной системы, а со стороны бактерий - на уровне макромолекул и их комплексов, расположенных на поверхности бактериальных клеток.
Липополисахарид (ЛПС), специфический компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий, занимает около 45% ее поверхности и представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент (так называемый липид А) и ковалентно связанную с ним гидрофильную полисахаридную часть [1]. В наружной мембране клетки ЛПС специфически взаимодействуют с белками, образуя устойчивые к химическим воздействиям ЛПС-белковые комплексы (ЛПБК) [2, 3,4, 5,]. Эти комплексы играют важную роль в организации и функционировании бактериальной мембраны и в значительной степени определяют ее свойства [2, 4, 6, 7, 8, 9]. Специфическое взаимодействие ЛПС с белком обеспечивает формирование пространственной структуры последнего и закрепление его в мембране [8, 10]. Важным доказательством существования связи между белком и ЛПС является функциональная активность комплекса, которая проявляется только при наличии обоих компонентов [3, 6, 11, 12].
ЛПБК представляет собой так называемый полный О-соматический антиген Буавена [3] и является нативным иммуногеном грамотрицательных бактерий. При попадании в организм ЛПБК вызывают картину полного иммунного ответа и обеспечивают формирование иммунитета к бактериальному возбудителю.
Изучение антигена Буавена начато еще в 30-е годы [13], однако его дальнейшее исследование к середине прошлого столетия было фактически приостановлено. Это связано с появлением новых методов выделения из бактериальных клеток чистого ЛПС, в связи, с чем внимание ученых было сосредоточено на исследовании именно этого компонента антигена. Изучением структуры ЛПС были заняты десятки групп исследователей в разных странах мира, и в этом направлении достигнуты существенные успехи [1, 5, 14,15, 16], что особенно важно для практической медицины, так как полисахаридная часть ЛПС часто является характерным антигеном патогенных бактерий, узнаваемым иммунной системой макроорганизма. Долгое время считалось, что все основные свойства ЛПБК, как антигена, определяются ЛПС [17], пока не была установлена важная роль белкового компонента в модификации биологической активности ЛПС [3]. Комплекс обладает особыми биологическими свойствами, которые отсутствуют у отдельно взятых ЛПС и белка, но характерны для бактериальной клетки в целом [5, 11, 12]. ЛПС и ЛПБК играют важную роль во взаимодействии микро - и макроорганизма и являются мощными токсинами, которые получили название эндотоксины.
Способность ЛПС образовывать с белками наружной мембраны комплексы, подтверждена многими экспериментальными фактами, как in v/їго.так и in vivo, однако данные о надмолекулярной структуре и свойствах ЛПБК, их поведении в водных средах весьма ограничены. В то же время, проявление физиологической активности эндотоксинов во многом определяется их третичной структурой. Поэтому лишь располагая соответствующими данными о макромолекулярной организации ЛПС и ЛПБК, можно достаточно полно решить основную задачу биохимии эндотоксинов - установить молекулярные механизмы их биологического действия.
Взаимодействие ЛПС с белком не ограничивается только наружной мембраной бактерий. При попадании в макроорганизм ЛПС взаимодействуют с белками сыворотки и бактерицидными белками организма хозяина и являются мишенью для антибактериальных веществ поликатионной природы, используемых при лечении бактериальных инфекций [1, 9, 18, 19, 20, 22]. В этом случае комплексы ЛПБК, выделенные из бактериальной мембраны, могут служить удобной моделью для изучения ЛПС - белковых взаимодействий.
Среди широкого спектра биологической активности ЛПС и ЛПБК, особое внимание исследователей привлекает их токсичность и способность активировать клетки иммунной системы. В настоящее время механизм проявления активности эндотоксина в макроорганизме достаточно понятен. Результатом специфического взаимодействии ЛПС или ЛПБК с клетками макроорганизма является биосинтез активных медиаторов - цитокинов, которые при низкой концентрации регулируют работу иммунной системы организма, а при высокой - вызывают развитие сложной гаммы токсических эффектов, таких как пирогенность, лейкопения, септический шок, объединяемых понятием «бактериальный эндотоксикоз» [1, 13, 21, 24, 25, 26]. В связи с этим разрабатываются способы нейтрализации токсического действия ЛПС и использования его ценных свойств. Для этих целей активно исследуются антибиотики или синтезированные на их основе пептиды [27 - 31]; моно-клональные антитела к ЛПС [32]; ингибиторы цитокинов [33, 34]; малотоксичные ЛПС, обладающие свойствами антагонистов [35, 36, 37]; липосомальные вакцины [38, 39], а также вещества, нейтрализующие действие ЛПС за счет образования с ними комплексов.
Среди последних веществ наиболее перспективными являются поликатионные антибактериальные белки, пептиды и их синтетические аналоги, как новые потенциальные антисептические препараты [40, 41, 42, 43, 44, 45], для которых ЛПС является важной мишенью благодаря высокому отрицательному заряду за счет фосфатных, пирофосфатных и карбоксильных групп, локализованных во внутренней части кора и липиде А - токсическом центре ЛПС. Особый интерес вызывают липополиамины, проявляющие высокую аффиность к ЛПС и нейтрализующие in vitro его эндотоксическую активность [40,41].
Несмотря на значительные успехи, достигнутые при изучении взаимодействий ЛПС с различными белками, многие биохимические и биофизические факторы, лежащие в их основе, остаются до конца неизученными. Основные трудности, с которыми сталкиваются исследователи при решении этих вопросов, обусловлены самой природой эндотоксинов - их гетерогенностью и способностью образовывать в водных растворах полидисперсные высокомолекулярные агрегаты. В этом случае изучение физико-химических характеристик ЛПС и ЛПБК приобретает особую важность.
Таким образом, изучение комплекса ЛПС с белком, физико-химические свойства и макромолекулярная организация ЛПБК, а также и его ЛПС составляющей, до сих пор остается актуальной и важной проблемой. Это обусловлено и тем, что достаточно полно понять молекулярные механизмы биологического действия эндотоксинов и их взаимодействие с антибактериальными веществами различной природы, можно лишь располагая данными о макромолекулярной структуре ЛПС и ЛПБК.
При выборе препаратов антибактериального действия, важно отсутствие их побочных эффектов на макроорганизм. Такому требованию могут отвечать природные вещества, если они способные повышать резистентность организма к действию бактериальных эндотоксинов и восстанавливать работу его иммунной системы.
Среди веществ, способных нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов, перспективными представляются полисахариды морского происхождения благодаря их разносторонней биологической активности, в том числе бактерицидной и иммуностимулирующей, биосовместимости, безопасности и доступности. Особого внимания заслуживают два таких полисахарида: хитозан и каррагинан, первый - в силу его поликатионной природы [46], благодаря чему он может рассматриваться в качестве потенциального лиганда для ЛПС, а второй -как представитель класса пищевых волокон, играющих важную роль в гомеостазе и широко используемый в составе различных пищевых продуктов [47, 48, 49]. Механизм специфического и неспецифического взаимодействия ЛПС с полисахаридами на молекулярном уровне, как и их влияние на биологические свойства эндотоксинов, не исследованы.
Изучение взаимодействия бактериальных ЛПС с белками и полисахаридами может внести определенный вклад в понимание механизма биологического действия ЛПС, осуществляемого на уровне гуморальных и клеточных факторов макроорганизма, молекулярные основы которого еще не достаточно понятны.
В методическом плане такая работа важна для разработки методов исследования широко распространенных в природе макромолекулярных комплексов, которые лежат в основе большинства устойчивых структур живой клетки.
Прикладное значение этих исследований заключается в перспективе создания новых терапевтических препаратов при лечении септических осложнений грамотрицательных инфекций. Модификация биологических свойств ЛПС и ЛПБК предполагает их активное использование для создания вакцин и других биологически-активных препаратов биохимического и медицинского назначения.
Взаимодействие ЛПС с липопротеинами, с ЛПС-связывающими белками и белками, увеличивающими бактерицидную проницаемость
Среди огромного количества полисахаридов, выделенных из природных источников, ЛПС грамотрицательных бактерий отличаются особым разнообразием структуры и моносахаридного состава. В отличие от полисахаридов растительного и животного происхождения, построенных, как правило, из ограниченного набора наиболее распространенных моносахаридов, бактериальные полисахариды и, в частности, ЛПС содержат большое количество редко встречающихся моносахаридов, которые обнаруживаются только в этих биополимерах. Информация о тонкой структуре ЛПС необходима для понимания на молекулярном уровне сложнейших процессов, протекающих с их участием. Структурные исследования ЛПС открывают возможности создания искусственных антигенов и вакцин. В последние двадцать лет достигнуты существенные успехи в изучении химического строения и физических свойств бактериальных ЛПС, что способствует более полному пониманию взаимосвязи структуры и активности эндотоксинов [1, 5, 9, 15,16].
Наибольший вклад в изучение структуры и свойств ЛПС внесли работы немецкой школы О. Вестфаля - О. Людерица. Эти работы были начаты в Институте иммунобиологии во Фрайбурге в самом конце 40-х годов прошлого века. Интенсивное исследование структуры ЛПС началось с разработки эффективного способа выделения ЛПС, основанного на экстракции бактериальных клеток 45% -ным водным фенолом [59]. Работы этой школы успешно продолжались, и к середине 60-годов было создано современное представление об архитектонике молекул ЛПС [17]. С начала 70-годов работы по исследованию химической структуры бактериальных полисахаридов развернулись в Лаборатории химии углеводов в ИОХ РАН, возглавляемой академиком Н.К. Кочетковым, в Отделе химии иммунитета ТИБОХ ДВО РАН под руководством академика Ю.С.Оводова, в Саратове в ИБФРМ РАН (проф. Игнатов В.В.) и Киеве в ИМВ НАН (проф.Захарова И.Я.).
ЛПС различных бактериальных групп различаются по структуре, но при этом все они построены по подобному структурному принципу. Молекулы полноценного ЛПС (S -форма) включают три различные по составу и принципу построения области: липид А, "кор" и О- специфический полисахарид.Наряду с -формами даже в диких штаммах бактерий присутствуют молекулы Я-формы ЛПС, не содержащие О-специфического полисахарида. R -мутанты бактерий содержат только R- форму ЛПС, углеводные цепи которых представлены олигосахаридом кора. Известны также SR- мутанты, в которых к кору вместо полимерной цепи присоединено только одно повторяющееся звено 0-специфической цепи. Существование мутантных форм связано с определенными нарушениями биосинтеза ЛПС [14].
Обобщенные данные по структуре ЛПС грамотрицательных бактерий и ее особенностях изложены в обзорах и монографиях отечественных и зарубежных ученых [5, 14, 15,16]. В данной главе освещены основные принципы построения молекул ЛПС, с более конкретным описанием отдельных компонентов ЛПС из псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotubersulosis, являющегося предметом исследования настоящей работы.
Впервые название " липид А " (ЛА) было дано липофильному остатку, полученному Буавеном при кислотном гидролизе эндотоксина [13]. Липидный компонент является наиболее консервативным участком молекулы ЛПС. Основные структурные элементы липида А являются общими для всех биологически активных ЛПС [1,61]. Все активные молекулы липида А содержат пиранозидные остатки гексозаминов D-глюко конфигурации (глюкозамин и 2, 3-диамино-2,3-дидезоксиглюкозамин), которые присутствуют в виде рЧ,6-гомо и гетерополимеров. Дисахарид несет а-гликозидную (положение 1) и негликозидную (положение 4 ) фосфорильные группы и сложноэфирно-(положения 3,3) и амидносвязанные (положения 2,2) R-3-гидрокси- и R-3-ацилоксиаловые кислоты. Несмотря на общий тип строения молекулы, липиды А из ЛПС различных бактериальных семейств имеют существенные различия. Так, фосфатные группы липида А ряда бактерий могут быть замещены полярными группами (остатки фосфорилэтаноламина, 4-дезокси-4-амино-Ь-арабинозы и др.) [1]. Вариации в структуре липида могут быть обусловлены типом аминосахара, степенью фосфорилирования, а также типом жирных кислот, длиной их углеводородных цепей, числом и положением ацильных заместителей [62, 63, 64]. По количеству ацильных заместителей липид А подразделяют на пента-, гекса- и гептаацильные типы. В то же время липид А из Yersinia pestis представляет собой смесь тетра- и гекса- ацильных типов липида [65]. Липид А из Y. pseudotuberculosis имеет пентаацильный тип структуры и включает остатки додекановой и тетрадекановой кислот, часть которых присутствует в виде 3-додеканоилокситетрадекановой кислоты [66]. В качестве гидрофильной основы липид А псевдотуберкулезного микроба содержит (3-1,6-связанную глюкозаминобиозу [67] с двумя остатками моноэфиров фосфорной кислоты, один из которых находится на гликозидном гидроксиле, имеющем а- конфигурацию, а другой замещает 4 -положение невосстанавливающего остатка глюкозамина. Аминогруппы обоих остатков глюкозамина замещены 3-гидрокситетрадекановой кислотой, два других остатка 3-гидрокситетрадекановой кислоты имеют сложноэфирный тип связи [68]. Гидроксильная группа дисахарида при С-6 является местом присоединения 2-кето-3-дезокси-0-октул озоновой кислоты (КДО).
Присутствие в молекуле липида А гидрофильных (глюкозаминобиоза, фосфатные группы) и гидрофобных ( жирные кислоты) участков делает липид А амфотерным, амфипатическим соединением. По данным рентгеноструктурного анализа, жирные кислоты липида А ориентированны в одном направлении и находятся в плотной гексагональной упаковке. Высокая упорядоченность делает структуру липида А стабильной в конформационном отношении, что является важным условием проявления его свойств и поведения ЛПС во внешней мембране клеточной оболочки [9,69,70].
Сравнительная характеристика ЛПБК и ЛПС, выделенных последовательной экстракцией
Кривые элюции, построенные по белку, моносахариду и КДО, указывают на то, что ЛПБК элюируется в первых фракциях, обозначенных 1-6. (рис 2.3.). Эти фракции были объединены, сконцентрированы ультрафильтрацией и полученный раствор обозначен, как ЛПБК А -1. ЛПБК А -1 также анализировали в градиенте хлористого цезия. При изоплотностным центрифугировании в хлористом цезии ЛПБК А -1 был разделен на две примерно одинаковые по весу ЛПС-белковые фракции: ЛПБК-А2 и ЛПБК-А3, с плотностью гидратации 1,43 и 1,40 г/см3, соответственно (рис 2.4).
Сравнительный анализ ЛПБК-Аі, ЛПБК-А2, и ЛПБК-А3, методом ГЖХ показал, что они имеют одинаковый моносахаридный состав, характерный для ЛПС из бактерий псевдотуберкулеза серовара 1В (табл. 2.2), но по соотношению компонентов и количественному моносахаридному составу эти комплексы различаются.
Мольное отношение маннозы к гептозе, характеризующее длину 0-специфической полисахаридной цепи, составляет примерно 5,0; 6,5; и 5,3 для ЛПБК-А, А2 и А3, соответственно. Из этого соотношения и на основании химического строения ЛПС из псевдотуберкулезного микроба 1В серовара (рис. 1.1.) было рассчитано среднее число повторяющихся пентасахаридных звеньев в ЛПС трех комплексов.
Эти величины равны 12, 13, и 10 для ЛПБК - А(, А2 и Аз, соответственно. По данным электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия) белковый состав этих ЛПБК идентичен и представлен двумя полипептидами с молекулярными массами 14,5 кДа и 40 кДа, однако, содержание белка в комплексах заметно варьирует, как видно из табл. 2.2. Подобное различие в плотности ЛПС, содержащих разное количество белка, наблюдалось и в случае эндотоксина из Е. Со И [92].
Таким образом, сравнительный анализ показал, что комплексы А і - А3 отличаются стехиометрией - относительным содержанием полисахарида, белка и липида, что и обусловливает их разную плотность (табл.2.2). Повторное центрифугирование в градиенте хлористого цезия ЛПБК - А2 и А3 подтвердило гомогенность выделенных комплексов.
Следует отметить, что после лиофилизации смесь ЛПБК- А2 и Аз не удается разделить центрифугированием. При центрифугировании смеси в градиенте хлористого цезия наблюдается образование одной зоны ЛПБК с плотностью 1,41 г/см3 . По - видимому, при лиофилизации происходит гибридизация двух форм ЛПБК и образование комплекса с промежуточной плотностью. В связи с этим, ЛПБК-А[, при выделении которого используется диализ против воды и лиофилизация, можно рассматривать, как гибридную форму комплексов А2 и А3. Склонность ЛПС к спонтанной гибридизации в растворе наблюдалась и другими исследователями. Эндотоксин из E.coli. также содержит две формы комплекса, различающиеся по молекулярному весу [92]. Они были разделены гель-фильтрацией на сефарозе 2В. Однако в нашем случае ЛПБК - А не удается расфракционировать с помощью гель-фильтрации. На сефарозе 2В он ведет себя, как полидисперсный полимер, разделенный на 6 фракций (рис. 2.3). По данным изоплотностного центрифугирования каждая фракция также содержит две формы ЛПБК с плотностью 1,43 и 1,40 г/см . Вероятно, эти комплексы не разделяются на сефарозе 2В потому, что они имеют близкие значения молекулярных масс (по данным равновесной седиментации 1,1 и 1,8 МДа для ЛПБК - Аг и А3, соответственно). Кроме того, на процесс фракционирования, видимо, оказывает влияние высокая ионная сила раствора хлористого цезия, используемого при центрифугировании.
Как известно, эндотоксины, независимо от метода выделения, обычно загрязнены продуктами их деградации и сопутствующими веществами, извлекаемыми одновременно с эндотоксинами из бактериальной клетки: углеводами, липидами и белками [74]. Количество и состав этих примесей зависит как от условий выделения эндотоксинов, так и от бактериального штамма. Среди широкого набора методов выделения ЛПБК наиболее распространенными является экстракция ТХУ и ЭДТА. Как известно, ЭДТА извлекает до 50% ЛПС из клетки в виде комплекса с белком [364]. ТХУ даже при многократной исчерпывающей экстракции не может извлечь из бактериальных клеток весь ЛПС. Обычно используемый при экстракции эндотоксинов фенол разрушает комплекс между ЛПС и белком и оказывает деградирующее действие на ЛПС [148, 365]. Важно было определить, какая часть ЛПС экстрагируется в виде комплекса с белком и сравнить ЛПС входящий в состав комплекса с ЛПС, выделенным из клеточной стенки бактерий фенолом.
С этой целью клетки бактерий псевдотуберкулезного микроба (1В шт. 341) последовательно обрабатывали раствором ТХУ, NaHC03 и ЭДТА в карбонатном буфере, согласно схеме, представленной на рис 2.5. В результате были получены отдельные экстракты, содержащие ЛПБК, выходы которых представленными в таблице 2.3. Остаток бактериальной массы обрабатывали горячим фенолом по методу Вестфаля [59] и получали ЛПС-1, содержащий 1% белка. Параллельно этим же методом из исходной бактериальной массы, не обработанной вышеназванными реагентами, получали ЛПС-11.
Влияние температуры на взаимодействие ЛПС с хитозаном. Стехиометрия комплексов ЛПС-хитозан
Для большинства препаратов ЛПБК коэффициент седиментации, определенный с учетом внутрикюветных эффектов сжатия и разбавления, существенно зависит от концентрации, увеличиваясь с ее возрастанием. Значения коэффициентов седиментации, определенные для ЛПБК и ЛПС, приведены в таблице 2.6. Таким образом, характер зависимостей молекулярной массы и коэффициентов седиментации от концентрации указывает на самоассоциацию частиц ЛПБК в растворе.
В то же время обычный линейный характер концентрационной зависимости коэффициента седиментации ЛПС и прямолинейная зависимость его молекулярной массы от концентрации (рис.2.12), позволяют предположить, что в отличие от ЛПБК, частицы ЛПС слабо взаимодействуют в растворе друг с другом. Как видно из таблицы 2.6., ЛПС, по сравнению с ЛПК, образует более крупные агрегаты, что согласуется с данными ГПХ.
Хорошо известно, что агрегация ЛПС в водных растворах обусловлена в первую очередь наличием гидрофобных фрагментов в макромолекуле полимера. Превышение в 2 раза средневесовой молекулярной массы частиц ЛПС, по сравнению с ЛПБК, можно объяснить более сильным гидрофобным взаимодействием между молекулами ЛПС. Вероятно, в ЛПБК это взаимодействие ослаблено белковым компонентом, который связан с липидной частью [154] и может экранировать гидрофобные участки ЛПБК.
Конформация полимера в растворе тесно связана с его гидродинамическими параметрами, такими, как характеристическая вязкость и коэффициент трения. Эти параметры были определены для ЛПС, ЛПБК и его шести фракций.
Характеристическая вязкость ЛПБК-А і (п) в воде имеет довольно высокое значение (порядка 260 см /г) и существенно уменьшается с увеличением ионной силы раствора (до 29 см3/г в 0,1 М NaCl). Как и в случае молекулярных масс и коэффициентов седиментации, вязкость растворов ЛПБК и ЛПС сильно зависит от концентрации полимера. При низких концентрациях ЛПБК (С 0,5 мг/мл) приведенная вязкость линейно убывает с уменьшением концентрации полимера. В области высоких концентраций наблюдается аномальный ход вискозиметрической кривой, что, вероятно, объясняется способностью ЛПБК в сравнительно концентрированных растворах образовывать крупные и неустойчивые агрегаты. Кроме того, вязкость растворов ЛПБК зависит и от времени растворения - при длительном выдерживании растворов (до трех суток) вязкость уменьшается до 60-70% от первоначальной величины. Такое уменьшение вязкости, вероятно, является результатом разукрупнения агрегатов ЛПБК, происходящего при разбавлении в течение достаточно длительного времени. Подобная диссоциация агрегатов ЛПБК в процессе разбавления наблюдалась при исследовании его растворов методами светорассеяния и ультрацентрифугирования.
Полученные значения гидродинамических характеристик различных образцов ЛПБК (в том числе и шести фракций, выделенных гель-хроматографией на сефарозе 2В) также приведены в таблице 2.6. Низкие значения характеристической вязкости, при большой молекулярной массе ЛПБК характерны для компактных, близких к сферическим частицам. Из экспериментальной логарифмической зависимости характеристической вязкости, от молекулярной массы (определенных для шести фракций ЛПБК), были найдены константы уравнения Марка - Куна - Хаувинка ([ч] = Кх Ма) Полученные таким образом значения: а = 0,57 и К = 5, 5 х 104 позволяют с определенным приближением аппроксимировать форму частиц ЛПБК моделью компактного непроницаемого клубка. В пользу такой формы частиц ЛПБК в растворе говорит и близкое к единице отношение коэффициентов трения f/f0, вычисленных на основании экспериментальных данных скоростного и равновесного центрифугирования (табл. 2.6.). Кроме того, функция (3, вычисленная из уравнения Шераги-Манделькерна, исключает жесткую стержнеобразную форму частиц ЛПБК (ее значение приблизительно равно 2,12х 106). Радиусы инерции частиц ЛПБК, рассчитанные с учетом полученных значений параметров, приведены в таблице 2.6. Согласно этим данным, самоассоциация ЛПБК в растворе приводит к образованию компактных частиц, с размерами от 8 до 14 нм. В отличие от ЛПБК, ЛПС из псевдотуберкулезного микроба образует агрегаты ассиметричных форм (f/fo =6,5).
Приведенные гидродинамические параметры ЛПБК и ЛПС вполне сопоставимы с результатами электронной микроскопии этих биополимеров. Электронно-микроскопическое исследование макромолекул ЛПБК и ЛПС из псевдотуберкулезного микроба методом негативного контрастирования позволило выявить различие в их морфологии. Окрашивание препаратов проводили как водным раствором уранилацетата, так и фосфорнофольфрамовой (ФМК) кислотой, для исключения возможных артефактов, связанных с природой красителя. Как видно из рис. 2.13а, ЛПБК в воде формирует частицы в виде везикул, размеры которых находятся в пределах от 60 х 5 до 200х 10 нм. Природа растворителя также влияет на ультраструктуру эндотоксина. В растворе буфера ( 0.03 М трис-НС1 - буфер, рН 8,0) ЛПБК имеет вид сферических частиц со средним диаметром 20нм для ЛПБК А -1 и 60 нм для ЛПБК- А-3. Частицы аналогичной формы с диаметром 6-7 нм были обнаружены с помощью электронной микроскопии в негативно окрашенных препаратах ЛПБК, выделенных из клеточных стенок морских микроорганизмов и экстракцией ЕДТА из Pseudomonas aeruginosa [142].
В отличие от ЛПБК, ЛПС из псевдотуберкулезного микроба, подобно ЛПС из других бактерий, проявляет значительный полиморфизм, при этом морфология ЛПС зависит от длины углеводной специфической цепи (рис 2.13 в, г). Как видно из рис. 2.13г, ЛПС, имеющий длинную углеводную цепь, наблюдается под электронным микроскопом в виде лент, пластинчатых структур, дисков. ЛПС с более короткой углеводной цепью образует лентоподобные структуры, состоящие из длинных плотно упакованных нитей, подобно тому, что наблюдалось в случае негативно-окрашенных образцов ЛПС из других бактерий [122, 372]. .Сравнительное изучение морфологии и гидродинамических характеристик ЛПБК и ЛПС позволяет предположить, что определенная роль в образовании компактной структуры ЛПБК принадлежит белковому компоненту. Изменение морфологии ЛПС в присутствии белка наблюдалось и другими исследователями [128, 135].
Полученные нами результаты о размере и форме частиц ЛПБК несколько отличаются от литературных данных, приведенных для комплексов ЛПС с белком из Pseudomonas aeruginosa [142],: агрегаты ЛПБК из псевдотуберкулезного микроба имеют значительно большие размеры и при нормальных условиях не имеют палочкообразной формы. К сожалению, из-за ограниченной информации в литературе по этим характеристикам ЛПБК из более широкого круга бактерий невозможно сравнить.
Выделение, очистка и фракционирование ЛПС, ЛПБК, хитозанаи каррагинана
Такое различие в гидродинамических параметрах двух образцов хитозана, вероятно, связано с различной конформацией их макромолекул. Можно предположить, что Х-ВМ образует ассоциаты в растворе, чему должна способствовать склонность этого полисахарида к образованию межмолекулярных связей различных типов.
Гидродинамические свойства полимера, такие как характеристическая вязкость и фрикционные коэффициенты тесно связаны с его конформацией. Для молекул с высокими значениями характеристической вязкости и f/frp возможно существование двух структур - хаотически скрученных цепей или тонких палочек. Большинство исследователей полагают, что для описания гидродинамических свойств макромолекул хитозана наиболее подходящей служит модель червеобразной (персистентной) цепи [305,321].
Зависимость характеристической вязкости от конформации молекулы полимера и его молекулярной массы описывается уравнением Марка-Хаувинка.
Куна: ті=К х Ма, где - К и а эмпирические константы, которые определяются природой растворителя (К) и конформацией полимера (а). На основании обобщенного анализа литературных и собственных данных по гидродинамическим параметрам макромолекул хитозана, Мэгхами [378] предложил для образцов хитозана (степень ацетилирования от 0 до 40 % ) в растворе 0,1 М уксусной кислоты/0,2 М NaCl наиболее корректные параметры в уравнении М-Х-К: К=1,8Ы0"3 иа=0,93.
Эти параметры были использованы нами для определения молекулярной массы хитозанов в 0,1 М уксусной кислоте/0,2М NaCl. Их значения, рассчитанные из уравнения М-Х-К, приведены в таблице 2.15. Как видно, значения молекулярных масс Х-ВМ в обоих растворителях практически совпадают, в тоже время для Х-НМ наблюдается уменьшение молекулярной массы полисахарида со снижением рН раствора.
Далее с учетом асимметричной формы хитозановых молекул (табл.2.15) были рассчитаны коэффициенты а для исследуемых образцов хитозанов в растворе 0,01 М фосфатного буфера/0,15 М NaCl (рН 6,0). Полученные значения параметра а (для Х-ВМ а=0,96 и для Х-НМ а=0,7) позволяют предполагать, что Х-НМ водных растворах, близких к нейтральным, представляет собой гибкие линейные макромолекулы (а 0,8), а Х-ВМ образует более жесткие, но отличные от палочкообразных структуры (а 0,8). Такая жесткость может быть обусловлена межмолекулярными водородными связями, приводящими к образованию ассоциатов. Гидродинамические параметры согласуются с данными электронной микроскопии. Под электронным микроскопом в случае X-ВМ наблюдаются длинные, червеобразные структуры - ассоциаты, или тонкие длинные нити, в то же время молекулы Х-НМ имеют форму коротких стержней, изолированных друг от друга.
Различие в конформации двух образцов хитозана, различающихся по молекулярной массе, вероятно, может проявляться и при их взаимодействии с другими соединениями. Известно, что в уксуснокислом растворе хитозан образует комплексы с красителями, имеющие спектры поглощения, отличные от таковых для чистого красителя, а разница в экстинкции при определенной длине волны позволяет определить количество свободных аминогрупп в хитозане [379]. Было изучено взаимодействие исследуемых хитозанов с анионным красителем тропеолином 000-И [4-(2-окси-1-нафтилазо) бензолсульфокислоты натриевая соль] в 0,002М Na-фосфатном буфере (рН=6,0). При титровании раствора красителя хитозаном происходило уменьшение полосы поглощения при А.483 нм до достижения насыщения, что свидетельствует об образование комплексов Х-ВМ и Х-НМ с тропеолином в этих условиях [379] Согласно кривым насыщения, Х-ВММ связывает значительно больше красителя, в расчете на одно звено глюкозамина, чем Х-НМ. Рассчитаны константы связывания и определено количество мест связывания с красителем для обоих хитозанов (табл. 2.16), в расчете на остаток глюкозамина, с использованием методов графического представления данных (графики Скетчарда [380] (рис. 2.25) и Стинсона-Холбрука [381]) (рис.2.26). Эти параметры приведены в таблице 2.16. Как видно из полученных параметров Х-ВМ в 2,8 раза прочнее связывается с тропеолином и имеет в 4 раза больше мест связывания, чем X НММ. Вероятно, большая доступность аминогрупп Х-ВМ для взаимодействия с красителем по сравнению с Х-НМ объясняется более жесткой конформацией его макромолекул в растворе. Необходимо отметить, что для Х-ВМ, предварительно выдержанного при 37 С, константа связывания с тропеолином практически не меняется, то время как Х-НМ после температурной обработки взаимодействует с красителем очень слабо. Таким образом, изучение двух образцов хитозанов с молекулярной массой 130 и 30 кДа в растворах, близких к нейтральным, позволило выявить существенные различия в конформации макромолекул полисахаридов, что может отражаться при взаимодействии хитозанов с другими полимерами.
