Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор (создание антибиотиков двойного действия как путь поиска новых перспективных лекарственных препаратов) 21
1. Введение 21
2. Теоретические основы создания антибиотиков двойного действия. преодоление резистентности 28
3. Антибиотики двойного действия, содержащие нерасщепляемый ковалентный спейсер 31
3.1. Антибиотики двойного действия, содержащие хинолоны 31
3.1.1. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и оксазолидинонов 32
3.1.2. Антибиотики двойного действия на основе хинолонов и макролидов 38
3.1.3. Антибиотики двойного действия на основе хинолонов и рифамицина 48
3.1.4. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и тетрациклинов. 51
3.1.5. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и бензилпиримидина. 54
3.1.6. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и анилиноурацилов. 55
3.1.7. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и цефалоспоринов 59
3.1.8. Антибиотики двойного действия на основе фторхинолонов и аминогликозидов 3.2. Антибиотики двойного действия, содержащие аминохинолины 62
3.3. Антибиотики двойного действия, содержащие аминогликозиды 69
3.4. Антибиотики двойного действия, содержащие гликопептиды 3.4.1. Антибиотики двойного действия на основе гликопептидов и низина 72
3.4.2. Антибиотики двойного действия на основе гликопептидов и -лактамов 74
3.4.3. Антибиотики двойного действия на основе гликопептидов и бензоксаборолов 77
4. Антибиотики двойного действия, содержащие расщепляемый спейсер, или антибиотики двойного действия – пролекарства 80
4.1. Антибиотики – пролекарства двойного действия на основе -лактамов 81
4.1.1. Антибиотики - пролекарства двойного действия на основе -лактамов и фторхинолонов 82
4.1.2. Другие примеры антибиотиков двойного действия – пролекарств, содержащих -лактамы 89
4.2. Другие примеры антибиотиков двойного действия – пролекарств 92
5. Другие примеры антибиотиков двойного действия, получаемых на основе слияния фармакофоров двух антибактериальных агентов 93
6. Терапевтические агенты двойного действия на основе противоопухолевых антибиотиков 99
7. Заключение 104
III. Обсуждение результатов (разработка направленной модификации и установление связи структура – активность полифункциональных антибиотиков-гликозидов) 107
1. Химическая модификация противоопухолевых антибиотиков-гликозидов 110
1.1. Химическая модификация оливомицина А 111
1.1.1. Модификация боковой цепи агликона оливомицина А (направления 1 и 2) 115
1.1.2. Модификация ароматической части агликона оливомицина А (направление 3) 123
1.1.3. Получение производных оливомицина, отличающихся набором ацильных групп в углеводных
цепях 133
1.1.4. Анализ биологической активности новых производных оливомицина А 137
1.1.5. Изучение механизмов действия оливомицина А и его производных 153
1.1.6. Анализ связи структура-активность для оливомицина А и его аналогов 172
1.2. Химическая модификация антрациклиновых антибиотиков 174
1.2.1. Синтез производных доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих по 3 -аминогруппе полигидроксилированные фрагменты и изучение биологической активности новых производных 178
1.2.2. Анализ связи структура-активность для антрациклиновых антибиотиков и их полусинтетических производных 185
1.2.3. Разработка метода синтеза конъюгатов доксорубицина с DAVANAT и изучение биологической активности новых производных 186
2. Химическая модификация антимикробных макроциклических антибиотиков-гликозидов 194
2.1. Химическая модификация генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В 195
2.1.1. Синтез моно-модифицированных производных полиеновых антибиотиков 201
A. Синтез амидов полиеновых антибиотиков 201
B. Синтез 3 -N-замещенных производных полиеновых антибиотиков 204
2.1.2. Синтез производных S44HP, модифицированных по С(16)-карбоксильной и 3 -аминогруппе микозамина (дважды модифицированные производные) 211
2.1.3. Анализ данных противогрибковой активности полусинтетических производных полиеновых антибиотиков in vitro 214
A. Анализ влияния строения области С7-С10 на противогрибковую активность полиеновых
антибиотиков 215
B. Анализ влияния заместителей при С16 и 3 -аминогруппе микозамина на противогрибковую
активность полиеновых антибиотиков 219
C. Анализ противогрибковой активности дважды модифицированных производных S44HP in vitro 222
2.2.4. Анализ связи структура-активность для полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В и их полусинтетических производных 224
2.2.5. Анализ данных противогрибковой активности и острой токсичности новых полусинтетических производных полиеновых антибиотиков в экспериментах in vivo 226
2.2. Синтез и анализ данных противогрибковой активности химерных антибиотиков на основе
амфотерицина В и бензоксаборолов 229
2.2.1. Синтез химерных антибиотиков на основе амфотерицина В и бензоксаборолов 229
2.2.2. Анализ связи структура-противогрибковая активность для химерных антибиотиков на основе амфотерицина В и бензоксаборолов 247
2.3. Синтез и анализ данных антибактериальной активности химерных антибиотиков на
основе азитромицина и гликопептидов 248
IV. Экспериментальная часть 262
V. Выводы: 308
VI. Благодарности: 311
VII. Список литературы: 312
- Теоретические основы создания антибиотиков двойного действия. преодоление резистентности
- Другие примеры антибиотиков двойного действия – пролекарств, содержащих -лактамы
- Модификация ароматической части агликона оливомицина А (направление 3)
- Анализ связи структура-активность для полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В и их полусинтетических производных
Теоретические основы создания антибиотиков двойного действия. преодоление резистентности
Основой терапевтического действия антибиотиков является угнетение жизнедеятельности клетки в результате ингибирования более или менее специфичного для микроба метаболического процесса (Таблица 1).
Антибиотики занимают на мировом рынке лекарственных средств один из крупных сегментов, в разных странах доля антибиотиков на рынке лекарственных препаратов составляет от 6% до 25%. Огромную долю на рынке антибиотиков занимают цефалоспорины, далее по объему продаж идут антибиотики ряда пенициллинов, хинолоны и макролиды [9].
В течение многих лет антибиотики используют как стимуляторы роста сельскохозяйственных животных и птицы, как средства борьбы с заболеваниями растений и посторонней микрофлорой в ряде бродильных производств, как консерванты пищевых продуктов [10, 11].
Несмотря на высокую эффективность в лечении многих инфекционных болезней, сфера применения антибиотиков значительно ограничивается побочными реакциями, возникающими на фоне лечения с использованием этих препаратов. Побочные эффекты антибиотиков, в основном, сводятся к аллергическим, токсическим реакциям (неврит слухового нерва при приеме аминогликозидов [12], гепатотоксическое действие при приеме тетрациклинов, рифампицина, эритромицина [13], гемато- и нефротоксичность при приеме полиеновых антибиотиков [14]), или связаны с побочным химиотерапевтическим эффектом приема антибиотиков: реакция бактериолиза [15], дисбактериоз [16], суперинфекции и др. Особенно сильно выражены токсические эффекты противоопухолевых антибиотиков, в частности, антрациклиновые антибиотики проявляют высокую кардиотоксичность, мутагенность и канцерогенность [17, 18].
Однако одной из наиболее насущных проблем современной антибактериальной терапии стала ежегодно растущая устойчивость болезнетворных бактерий к применяемым антибиотикам [19, 20]. Резистентность микроорганизмов к антибиотикам может быть природной и приобретённой. Истинная природная устойчивость представляет собой крайне редкий феномен и характеризуется отсутствием у микроорганизмов мишени действия антибиотика, на сегодняшний день единственным примером ее является отсутствие мишеней к -лактамам у микоплазм [21]. В остальных случаях природная резистентность проявляется снижением сродства к антибиотикам у определенных микроорганизмов и может быть преодолена повышением концентрации препарата. Так, например, большинство грамотрицательных бактерий мало восприимчивы к пенициллину и ряду других антибиотиков, поскольку их клеточная стенка защищена дополнительной мембраной [22, 23]. Под приобретённой устойчивостью понимают свойство отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при тех концентрациях антибиотиков, которые подавляют основную часть микробной популяции. Основными механизмами развития резистентности бактерий к антибактериальным препаратам являются: снижение аффинности мишени антибиотика к препарату; инактивация антибиотика в клетке; активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс) и изменение проницаемости внешних структур микробной клетки [24, 25].
Механизмы формирования устойчивости заложены в природе самих микроорганизмов. Однако ряд факторов (нарастающее неадекватное и/или неконтролируемое применение антибиотиков в здравоохранении, распространение необоснованного самолечения, широкое применение антибиотиков в животноводстве и птицеводстве) ускоряют естественные процессы и поднимают угрозу роста резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам на новый уровень [25]. Распространение устойчивости к антибиотикам приводит к снижению эффективности лечения и, следовательно, более тяжелому и длительному течению заболеваний, увеличению частоты госпитализации пациентов, росту количества смертельных исходов и увеличению экономического ущерба для общества. Последствием распространения болезнетворных бактерий, резистентных к антибиотикам, стал неуклонный рост числа заболеваний бактериальной природы, которые еще недавно успешно лечились. Резко возросла летальность при сепсисе, при туберкулезе и пневмониях, поскольку их возбудители приобрели резистентность к применяемым антибактериальным препаратам, так ежегодно в США более 23 000 человек умирают от инфекций, обусловленных антибиотикорезистентными бактериями [26].
Наличие побочных эффектов применения антибиотиков и, в особенности, появление и распространение антибиотикорезистентности среди возбудителей заболеваний привело (и будет приводить) к утрате клинической значимости некоторых антибиотиков и стимулировало поиск путей преодоления возникших трудностей. Решение проблемы лечения инфекций, вызванных полирезистентными бактериями, связано как с разработкой и внедрением решительных и адекватных мер по сдерживанию распространения антибиотикорезистентности [27], так и с поиском новых антимикробных препаратов, активных в отношении резистентных микроорганизмов. В 2001 году ВОЗ выпустила «Глобальную стратегию сдерживания устойчивости к противомикробным препаратам», содержащую рекомендации для замедления возникновения и снижения распространения микроорганизмов, стойких к противомикробным препаратам. Одной из ключевых рекомендаций, наряду с такими директивами, как снижение заболеваемости и распространения инфекции, улучшение доступа к соответствующим противомикробным препаратам, улучшение применения противомикробных препаратов, укрепление регулирования и законодательства, является поддержка создания новых антибактериальных препаратов. Так, в соответствии с этой рекомендацией начиная с 2009 г. руководство 23 стран, в которых зарегистрирована наибольшая частота выделения полирезистентных штаммов, практически удвоили выделяемые средства на борьбу с антибиотикорезистентностью, а в 2013 году правительство США приняло решение о выделении компании GlaxoSmithKline 200 миллионов долларов на проведение исследований, направленных на поиск и разработку новых антибиотиков, активных в отношении резистентных микроорганизмов.
Другие примеры антибиотиков двойного действия – пролекарств, содержащих -лактамы
Вторым этапом исследования химической модификации оливомицина А стала трансформация ароматической части агликона антибиотика. Поскольку оливомицин А содержит электрондонорные фенольные группы, мы исследовали возможность введения заместителей в ароматическую часть агликона реакцией азосочетания, т.е., взаимодействием с солями диазония. Синтезированные соли (хлориды) диазония переведены в соответствующие тетрафторбораты, что позволило осуществить их выделение. Оливомицин А (1) вводили в реакции с тетрафторборатами арил диазония в щелочных условиях (2 экв. NaOH) при охлаждении до 5C, реакция протекала практически мгновенно с образованием веществ ярко-красного цвета (Схема 3). После выделения продуктов реакции и анализа данных масс-спектрометрии и ЯМР спектроскопии установлено, что реакция азосочетания сопровождалась отщеплением 6-О-дисахаридной вести. Реакцией азосочетания получена серия 5-арилдиазенил-6-О-дегликозил производных: 5-фенилдиазенил-6-O дегликозилоливомицин А (17), 5-(4-сульфамоилфенил)диазенил-6-O дегликозилоливомицин А (18), 5-(4-метоксифенил)диазенил-6-O дегликозилоливомицин А (19), 5-(3,4-дихлорфенил)диазенил-6-O дегликозилоливомицин А (20), 5-(4-метилфенил)диазенил-6-O дегликозилоливомицин А (21) (Схема 3). Очистку производных 17-21 осуществляли методом колоночной хроматографии на силикагеле, конечные выходы составили 35-65%.
Данные 1H ЯМР-спектроскопии для ароматической части соединений 17, 19, 21 представлены в Таблице 2, полный спектр для соединения 21 представлен в Приложении 1.
Концентрации соединений в образцах для ЯМР были 6 мг/мл, поскольку при больших концентрациях соединений 17, 19, 21 наблюдалось значительное уширение сигналов в 1H ЯМР-спектрах. Анализ данных 1Н ЯМР-спектроскопии однозначно подтвердил отсутствие дисахаридной ветви в соединениях 17, 19, 21.
В спектрах отсутствовал сигнал ацетильной группы, содержащейся в дисахаридной ветви соединения 1 (сигнал при 2.14 м.д. в 1). В спектрах соединений 17, 19, 21 уменьшилось число сигналов метокси и метильных групп по сравнению со спектром 1: в спектре 1 наблюдалось два сигнала метокси групп и девять сигналов метильных групп, тогда как спектры соединений 17, 19, 21 содержали только по одному сигналу метокси групп и по семь сигналов метильных групп. Кроме того, в спектрах соединений 17, 19, 21 помимо сигналов 9-ОН и 8-ОН групп при 14.9-15.1 м.д. и 9.9-10.1 м.д., соответственно, ( 15.62 м.д. и 9.59 м.д. в 1), появлялся сигнал 6-OH при 16.8-17.0 м.д.
Положение сигнала протона 6-OH группы в слабом поле предполагает участие этой группы в образовании сильной водородной связи, которая может быть образована с атомом N только в случае расположения заместителей при двойной связи N=N в E-конфигурации. Это возможно при протекании реакции замещения как по 5-ому, так и по 7-ому положении ароматического кольца оливомицина А.
Для того чтобы точно установить место присоединения диазенильного фрагмента, изучены ЯМР-спектры модельных соединений – 6-бромнафталин-2 ола (22) и его диазенильного производного 6-бром-1-((4 метоксифенил)диазенил)нафталин-2-ола (23) (Таблица 3). Соединение 23 получено взаимодействием 22 с тетрафторборатом (4-метоксифенил)диазония с
Сравнение данных 1H ЯМР-спектра для соединения 23 со спектрами соединений 17, 19, 21 показало, что химические сдвиги атомов водорода в peri-положении в соединениях 17, 19, 21 и модельного производного 23 очень близки. Кроме того, изменение химического сдвига сигнала атома водорода в 8-ом положении (8-Н) соединений 22 и 23 составляло -1.04 м.д. (=7 – 8 = -1.04), что соответствовало разнице в химических сдвигах сигнала атома водорода в 10-ом положении оливомицина А (1) по сравнению с химическим сдвигом сигнала этого атома в спектрах арилдиазенильных производных 17, 19, 21 (= -0.99 для 17, = -1.02 для 19, = -1.02 для 21). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что арилдиазенильные заместители в производном 23 и в соединениях 17, 19, 21 расположены на одинаковом удалении от атома водорода в peri-положении, а значит, заместители в соединениях 17, 19, 21 находятся в 5-ом положении ароматического кольца оливомицина А.
Модификация ароматической части агликона оливомицина А (направление 3)
Альдегид 92 получен, исходя из 3-аминопропанола (90) в 2 стадии: защита аминогруппы с помощью Fmoc-группы и дальнейшее окисление с количественным выходом первичной гидроксильной группы до альдегидной под действием реагента Десс-Мартина (DMP) (Схема 21). Аналогично синтезу N-аминоалкильных производных 96-98 реакцией восстановительного алкилирования S44HP (60) или BSG005 (61) 2-сульфобензальдегидом или 4 207 (N,N-диметиламино)бензальдегидом в присутствии NaBH3CN получены соответствующие N-2-сульфобензил- (99) или N-(4-(N,N диметиламино)бензил- (100, 101) аналоги полиеновых антибиотиков (Схема 21). Чистота полученных производных 99-101 подтверждена данными ВЭЖХ, а структура – данными масс-спектрометрии (Таблица 20).
Описание систем для ТСХ и ВЭЖХ см. в экспериментальной части bв виде гидрохлорида
При взаимодействия полиенов AmB (58) или S44HP (60) или BSG005 (61) с сахарами (D-глюкозой, D-галактозой или лактозой) в DMF при 37С в результате перегруппировки Амадори получены соответствующие N-углевод-содержащие производные 102-106 (Схема 22). Чистота соединений 102-106 подтверждена методами ТСХ и ВЭЖХ, структура доказана методами УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии (Таблица 20).
Взаимодействие остатка микозамина полиенового антибиотика с моносахаридом может приводить к образованию структур пяти типов: основания Шиффа (а), N-гликозида (b), N-углевод-содержащего производного в линейной кето-форме (с), в циклической ,-пиранозной форме (d) или ,-фуранозной форме (е) (Схема 23).
Возможные варианты структуры N-углевод-содержащего производного 103а.
На рис. 27 представлен «тест на присоединенные протоны» (13С ЯМР-спектр в режиме APT) искусственной смеси 1-13С-102а и 1-13С-D-глюкозы. Поскольку в спектре присутствуют сигналы, относящиеся к вторичному или четвертичному углеродному атому (направленные «вверх» 51.61 и 50.47 м.д.), можно сделать вывод об образовании равновесной смеси структур «c», «d» или/и «е» (Схема 21). Если бы произошло образование структур «a» и/или «b», то в спектре наблюдались бы только сигналы, характерные для третичных или первичных атомов углеродов, (направленные «вниз»). Сигналы при 96.63 и 91.96 м.д. принадлежат 1-13С-D-глюкозе.
С монорезонансный ЯМР-спектр искусственной смеси 1-13С-N-(1-дезокси-D-фруктоз-1-ил)-S44HP (103а) и 1-13С-D-глюкозы в DMSO-d6 при 35С.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что производное 103а (продукт перегруппировки Амадори) существует в виде равновесной смеси структур «c», «d» или/и «е» (Схема 23). 1Н- и 13-С-ЯМР-спектры продукта перегруппировки Амадори 103 приведены в Приложении 3, 4.
Таким образом, нами разработаны способы химической модификации генно-инженерных полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В по С(16)-карбоксильной группе и по 3 -аминогруппе. Подобраны последовательности реакций и/или способы очистки антибиотиков, позволяющие получать целевые соединения высокой степени чистоты. Синтезированы серии новых полусинтетических производных амфотерицина В и генно-инженерных антибиотиков S44HP, BSG005, BSG022, BSG003.
Синтез производных S44HP, модифицированных по С(16)-карбоксильной и 3 -аминогруппе микозамина (дважды модифицированные производные) [363] Продолжением работы по разработке методов химической трансформации генно-инженерных полиенов стало изучение двойной модификации антибиотика S44HP (60), т.е. получение производных S44HP, замещенных одновременно по С(16)-карбоксильной группе и 3-аминогруппе остатка микозамина. Выбор антибиотика S44HP (60) обусловлен данными испытаний 60 in vitro и in vivo, свидетельствующих о его преимуществах перед амфотерицином В и другими полиенами близкого строения – BSG022 и BSG003 [358] (см. ниже).
Определяющими факторами при выборе последовательности синтетических превращений S44HP (60) послужили удобство и эффективность процесса очистки промежуточных или целевых соединений. Оптимальным вариантом являлась хроматографическая очистка антибиотиков в виде гидрофобных Fmoc-защищенных производных.
Для модификации использовали два синтетических подхода. Первый подход заключался в получении Fmoc-защищенных С(16) карбоксамидов (83, 107, 108), их очистке хроматографическими методами, удалении защитной Fmoc-группы (Схема 19) и последующим превращении 83, 107, 108 в соответствующие 3-N-ацильные или 3-N-алкильные производные 109-111, 113, 114-121 (Схема 24). Второй подход заключался в синтезе гидрофобных 3-N-ацильных производных S44HP (86, 126), содержащих Fmoc-группу во вводимом ацильном радикале, хроматографической очистке полученных соединений и проведении реакции амидирования с получением дважды модифицированных производных 122, 125, 128, 130, 132 (Схема 25). XHN
AmB (58) и его производные имеют две гидроксильные группы в положениях С8 и С9, в то время как в S44HP (60) и его производных гидроксильные группы располагаются в положениях С7 и С10. Как видно из Таблицы 22, антибиотики AmB и S44HP и их соответствующие производные имеют близкую противогрибковую активность in vitro на различных моделях. Например, МПК N-(2-адамантил)амидов амфотерицина В (67) и S44НР (75) в отношении C. albicans, C. humicolus и А. niger составляет 4 мкг/мл, а МПК в отношении F. оxysporum несколько выше и составляет 8-16 мкг/мл. Аналогично и для других соответствующих производных AmB и S44HP можно наблюдать схожие тенденции изменения противогрибковой активности в отношении исследованных штаммов дрожжей и грибков. Таким образом, можно предположить, что различия в структуре полиольной части 58 и 60 не оказывают значительного влияния на противогрибковые свойства этих антибиотиков и их полусинтетических производных. Однако химическая модификация может изменять фармакологические свойства. Ранее показано, что антибиотик S44HP (60) достоверно обладает преимуществами перед AmB (58) в опытах in vivo [358].
Анализ связи структура-активность для полиеновых антибиотиков группы амфотерицина В и их полусинтетических производных
Препаративное выделение и очистку соединений осуществляли на колонках с силикагелем (Kieselgel G60, 0.040-0.063 мм, Merck, Германия) или силанизированным силикагелем (Kieselgel 60 silanisiert, 0.063-0.200 мм, Merck, Германия). Гель-хроматографию осуществляли на колонках с сефадексом G-25 (Pharmacia Fine Chemicals АВ Uppsala, Швеция) или сефадексом G-200 (Pharmacia Fine Chemicals АВ Uppsala, Швеция). Полупрепаративную ВЭЖХ осуществляли на хроматографе SPD-M20A (Shimadzu, Япония) на колонке Diasorb-130-C16T (16250 мм, БиоХимМак, Москва, Россия) при скорости потока 2.5 - 3 мл/мин в системе H20-MeCN при 20С. Объем пробы составлял 100 мкл, концентрация образцов не превышала 20 мг/мл.
Для обессоливания использовали смолу Амберлит XAD-2 (Serva, Германия). Для нейтрализации использовали ионообменную смолу анионит ЭДЭ-10 (ОН" форма), (аналог Doulite А 30), (Нижний Тагил, Россия). Оптическое вращение [а]о изучали на поляриметре "Perkin-Elmer-241" в кювете длиной 1 дм. Температуры плавления получены на приборе Buchi SMP-20. ИК-спектры регистрировали с использованием ИК-Фурье-спектрометра «Nicolet-iS10» (детектор DTGS, светоделитель КВг) с приставкой «Smart Реггогтег»(метод однократного НПВО), оснащенный ZnSe-кристаллом. Измерение проводили при разрешении 4 см-1; зона спектра 3000—650 см-1. Спектры обрабатывали с использованием программы OMNIC-7.0.
ЯМР спектры конъюгатов амфотерицина В с бензоксаборолами регистрировали на спектрометре Bruker Avance 600 с частотой резонанса 1Я 600 МГц при температуре 298К. Для установления протон-протонных корреляций регистрировались спектры DQF-COSY, для этого собирались 1024 инкремента вдоль непрямой размерности (F1). При обработке применялась взвешивающая функция смещенный синус-колокол вдоль обеих размерностей. Спектры гетероядерных корреляций -"С (HSQC) регистрировали по схеме Эхо-Антиэхо. Для установления пространственных взаимодействий по механизму эффекта Оверхаузера для некоторых образцов регистрировались спектры ROESY.
Масс-спектры при ионизации электрораспылением (ESI) получали на приборе Finnigan MAT 900S (Германия), масс-спектры, полученные при ионизации методом MALDI (матричная лазерная десорбционная ионизация), получены на приборе Brucker BIFLEX III. Масс-спектры высокого разрешения (FIR MS) получали при ионизации электрораспылением на приборе «micrOTOF-Q II» («Bruker Daltonics GmbH», Германия).
Спектры абсорбции, флуоресценции и кругового дихроизма регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-3101 PC spectrophotometer (Киото, Япония), спектрофлюорофотометре Shimadzu RF-5301 PC (Киото, Япония) и дихрометре SKD-2M (Москва, Россия), соответственно.
Химическая модификация оливомицина А 2 -(Карбоксиметоксим)-оливомицин А (2) К раствору оливомицина А (100 мг, 0.084 ммоль) в МеОН (3 мл) добавляли карбоксиметоксиламин гидрохлорид (4.5 мг, 0.42 ммоль). Реакционную смесь выдерживали при 37С в течение 50 ч. Реакционную смесь упаривали и остаток наносили на колонку с силикагелем, элюцию осуществляли смесью СНС13-МеОН-НСООН (9:1:0.05). Фракции, содержащие целевое вещество, объединяли и упаривали до небольшого объема. Добавление петролейного эфира привело к выпадению осадка, который отфильтровывали, промывали петролейным эфиром и высушивали в вакууме, получая 2 в виде аморфного желтого порошка (53 мг, 50%). Rf 0.42 (система А1), Rt (система В1) 12.38 мин, т.пл. 140 142С
Н ЯМР-спектр (DMSO-d6) соединения 2 полностью соответствовал Н ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением наличия сигнала при 4.63 м.д. (с, 2Н, -ОСН2). 13С ЯМР-спектр (DMSO-d6) соединения 2 полностью соответствовал 13С ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением отсутствия сигнала при 211.81 м.д. (2 -карбонильная группа), и присутствия сигналов при 171.203 м.д. (-СООН), 158.815 м.д. (-C=N-), 70.45 м.д. (-ОСН2).
N-(2-AdctMaHmwi)ctMud Т-(карбоксиметоксим)-оливомицина А (5)
К раствору 2 -(карбоксиметоксим)-оливомицина А (50 мг, 0.039 ммоль) в МеОН (3 мл) добавляли гидрохлорид 2-адамантиламина (14.6 мг, 0.078 ммоль). К реакционной смеси добавляли Et3N до рН 8-8.5, а затем порциями добавляли РуВОР (30 мг, 0.058 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 22С в течение 2 ч, затем упаривали и остаток наносили на колонку с силикагелем, элюцию осуществляли сначала CHCl3j затем смесью СНС13-МеОН-НСООН (9:1:0.05). Фракции, содержащие целевое вещество, объединяли и упаривали до небольшого объема. Добавление петролейного эфира привело к выпадению осадка, который отфильтровывали, промывали петролейным эфиром и высушивали в вакууме, получая 5 в виде аморфного желтого порошка (30 мг, 55%). Rf 0.27 (система Al), Rt (система В1) 19.46 мин, т.пл. 155 157С (разл.). MW вычислено для C7oHio2N2027 1402.67, найдено MALDI-MS 1425.47 [М+Na]+.
Н ЯМР-спектр (DMSO-d6) соединения 5 полностью соответствовал Н ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением наличия сигналов адамантильного фрагмента при 1.0-2.43 м.д. (15 Н), 4.49 м.д (м, Ш) и сигнала при 4.63 м.д. (с, 2Н, -ОСН2). Амид 2 -(карбоксиметоксим)-оливомицина А (3) Соединение 3 получено, как описано для соединения 5, исходя из 2 (50 мг, 0.039 ммоль), NH4CI (6.3 мг, 0.12 ммоль) и РуВОР (30 мг, 0.058 ммоль). Выход: 19 мг (38%). Rf 0.44 (система Al), Rt (система В1) 10.15 мин, т.пл. 162 167С (разл.). MW вычислено для C6oH88N2027 1268.56, найдено ESI-MS 1291.34 [М+Na]+.
Соединение 4 получено, как описано для соединения 5, исходя из 2 (30 мг, 0.024 ммоль), гидрохлорида этаноламина (6.9 мг, 0.071 ммоль) и РуВОР (18.4 мг, 0.035 ммоль). Выход: 16 мг (51%). Rf 0.51 (система Al), Rt (система В1) 9.71 мин, т.пл. 140 142С (разл.). MW вычислено для СегН Огв 1312.58, найдено ESI-MS 1313.39 [М+Н]+.
Н ЯМР-спектр (DMSO-d6) соединения 4 полностью соответствовал Н ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением наличия сигналов при 3.40 - 3.80 (4Н, -OCH2CH2N) и при 4.63 м.д. (с, 2Н, -ОСН2).
Соединение 6 получено, как описано для соединения 5, исходя из 2 (60 мг, 0.047 ммоль), гидрохлорида ґегґ-бутиламина (15.2 мг, 0.142 ммоль) и РуВОР (36.8 мг, 0.071 ммоль). Выход: 26 мг (42%). Rf 0.66 (система Al), Rt (система В1) 15.26 мин, т.пл. 145 147С (разл.). MW вычислено для СеД гОгу 1324.62, найдено ESI-MS 1347.29 [М+Na]+. ХЯ ЯМР-спектр (DMSO-d6) соединения 6 полностью соответствовал ХЯ ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением наличия сигналов при 1.30 м.д. (с, 9Н, -С(СНз)з) и при 4.63 м.д. (с, 2Н, -ОСН2).
Соединение 7 получено, как описано для соединения 5, исходя из 2 (30 мг, 0.024 ммоль), гидрохлорида 2-амино-2-метилпропан-1,3-диола (10 мг, 0.071 ммоль) и РуВОР (18.4 мг, 0.071 ммоль). Выход: 10 мг (30%). Rf 0.56 (система А1), Rt (система В1) 8.11 мин, т.пл. 141 143С (разл.). MW вычислено для C64H96N2O29 1356.61, найдено MALDI-MS 1379.97 [М+Na]+.
Н ЯМР-спектру (DMSO-d6) соединения 7 полностью соответствовал Н ЯМР-спектру оливомицина А (1) [280], за исключением наличия сигналов при 1.30 м.д. (с, ЗН, -С(СН2ОН)2СН3), при 4.5 - 4.78 м.д. (4Н, -С(СН20Н)2СН3) и при 4.63 м.д. (с, 2Н, -ОСН2).
К раствору оливомицина А (1) (500 мг, 0.418 ммоль) в МеОН (5 мл) добавляли раствор периодата натрия (200 мг, 0.935 ммоль) в Н2О (0.5 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (50 мл), промывали водой (330 мл), высушивали над Na2SC 4 и упаривали. Остаток наносили на колонку с силикагелем, элюировали смесью СНС13-МеОН-СН3СООН (15:1:0.1). Фракции, содержащие целевое вещество объединяли, удаляли растворитель на роторном вакуумном испарителе до минимального объема и добавляли гексан. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали гексаном, высушивали. Выход: 410 мг (86%). Rf (система А1) 0.58, Rt (система С1) 25.7 мин. ИК-спектр (см"1): 1738, 1637, 1582, 1515, 1445, 1064. MW вычислено для С55Н78025 1138.4832, найдено HR ESI MS 1137.3487 [М-Н]"1.
