Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1. Холецистокинип, его формы и распространение в организме 9
2. Рецепторы холецистокинина
2.1. Подтипы рецепторов холецистокинина и их распространение в организме 9
2.2. Участки ХЦК-рецепторов и молекул ХЦК, ответственные за взаимодействие 15
3. Роль ХЦК его рецепторов в организме 18
3.1 .Участие в процессах пищеварения 18
3.2. Взаимодействие холецистокинина с дофаминэргической системой 20
3.3. Роль холецистокинина в патофизиологии шизофрении 21
3.4. Взаимодействие систем холецистокинина и энкефалина при регулировании боли 22
3.5. Холецистокигош и депрессия 24
3.6. Участие системы холецистокинина в регуляции паники и тревоги 3.6.1. Исследования на животных 25
3.6.2. Клинические исследования 26
3.7. Роль холецистокинина в процессах памяти 27
4. Агонисты и антагонисты ХЦК-рецепторов 29
4.1. Агонисты ХЦКі-рецепторов 29
4.2. Антагонисты ХЦКі-рецепторов 31
4.3. Агонисты ХЦКгрецепторов 34
4.4. Антагонисты ХЦКг-рецепторов 36
4.5. Фармакологическая активность некоторых антагонистов ХЦКг-рецепторов 61
Глава 2. Обсуждение результатов 67
1. Дизайн N-ацилдипептидных аналогов ХЦК-4 с анксиолитическими свойствами...67
1.1. Предпосылки использования структуры нейропептида ХЦК-4 как основы для создания нового анксиолитика 67
1.2. Пути создания соединений с антагонистическими свойствами 68
1.3. Идеи, положенные в основу создания нового антагониста ХЦКг-рецепторов 69
1.4. Дизайн ретро-аналогов ХЦК-4 с потенциальными анксиолитическими свойствами 72
2. Синтез N-ацилдипептидов и их конформационно ограниченных аналогов 73
2.1. Синтез N-ацилдипептидных ретро-аналогов ХЦК-4 73
2.2. Синтез конформационно ограниченных аналогов 2.2.1. Синтез у-лактамного аналога, этилового эфира ЗІ?-[(фенилгексаноил)амино]-2-оксо-І-пирролидин-З-индолил і -пропионовой кислоты (соединение XIX) 77
2.2.2. Синтез дибензазепиновых аналогов 80
3. Изучение взаимосвязи структуры и активности в ряду N-ацилдипептидных ретро аналогов ХЦК-4 81
3.1. Изучение влияния длины спейсеров 82
3.2. Подтверждение важной роли индолильного фармакофорного фрагмента для проявления активности в сконструированных N-ацилдипептидных аналогах 84
3.3 Изучение влияния природы С-концевого замещения на фармакологическую активность 86
4. Изучение биологически активной конформации N-ацилдипептидных ретро-аналогов ХЦК-4 87
4.1. Выбор между линейной и поворотной конформацией 87
4.2. Исследование типа поворотной конформации, ответственной за анксиолитическую активность N-ацилдипептидных аналогов ХЦК-4 89
4.2.1. Конформационное исследование амидов глицин- и пролинсодержащих дипептидов в растворе с помощью Н-ЯМР-спектроскопии 89
4.2.2. Конформационное исследование эфиров и N-метиламидов дипептидов в растворе с помощью Н-ЯМР спектроскопии 95
4.3. Выявление типа р-поворотной конформации, ответственной за анксиолитическую
активность N-адилдипептидных аналогов ХЦК-4 99
4.3.1. Конформационный анализ в растворе методом Н-ЯМР-спектроскопии 99
4.3.2. Конформационно ограниченные аналоги 103
4.4. Фармакофорное подобие тетрапептида ХЦК-4 и его N-ацилдипептидного ретро энантио-аналога 108
5. N-Ацилдипептидный ретро-аналог ХЦК-4 ГБ-115 (соединение IV) - перспективный
селективный анксиолитик 113
5.1. Фармакологический профиль 113
5.2. Оптимизация синтеза ГБ-115 118
Глава 3. Экспериментальная часть 131
1. Синтез замещённых дииептидов 131
1.1. Синтез хлорангидридов карбоновых кислот 131
1.2. Синтез N-ациламинокислот 132
1.3. Синтез хлоргидратов эфиров триптофана 133
1.4. Синтез эфиров низкомолекулярньгх спиртов дипептидов 1 1.4.1. Эфиры триптофансодержащих дипептидов 134
1.4.2. Этиловый эфир (6-фенилгексаноил)глицил--фенилаланина 137
1.4.3. Метиловый эфир М-(6-фенилгексаноил)глицил--гистидина 1 1.5. Синтез амидов дипептидов 138
1.6. Синтез М-(5-фенилвалерил)глицил-/,-триптофана 141
1.7. Синтез метиламидов (фенилацил)глицил-Х-триптофанов 142
2. Синтез конформационно ограниченных аналогов 143
2.1. Синтез этилового эфира К-(6-фенилгексаноил)глицил-№(метил)--триптофана 143
2.1.1. Хлоргидрат этилового эфира Ма(метил)--триптофана 143
2.1.2. Этиловый эфир Н-(6-фенилгексаноил)глицил-1Ча(метил)--триптофана 143
2.2. Синтез этилового эфира ЗІ?-[фенилгексаноиламино]-2-оксо-1-пирролидин ЗЗ-индолил -пропионовой кислоты (у-лактамный аналог) 144
2.2.1. М-(6-Фенилгексаноил)-)-метионин 144
2.2.2. Этиловый эфир К-(6-фенилгексшюил)-/)-метионил-.-триптофана 145
2.2.3. Метилиодид этилового эфираМ-(6-фенилгексаноил)-/)-метионил-Z-триптофана 145
2.2.4. Этиловый эфир 3/?-[фенилгексаноиламино]-2-оксо-1-пирролидин-3 !?-индолил-2-пропионовой кислоты 146
2.3. Синтез производных дибензоазепина 147
2.3.1. Метиловый эфир 2-(10,11-дигидро-5Н-дибензо[6,/1азепин-5-илкарбониламино)-З -СШ-индол-З-ил пропионовой кислоты 147
2.3.2. Метиловый эфир 2-(3-этоксикарбониламино-10,11-дигидро-5Н-дибензо[6,/ азепин-5-илкарбониламшю)-35-(Ш-индол-3-ил)-гфопионовой кислоты 147
3. Подбор оптимальных условий синтеза этилового эфира 1Ч-(6-фенилгексаноил)
глицил--триптофана (TV) 148
3.1. Метод смешанных ангидридов 148
3.1.1. Растворитель ДМФА 148
3.1.2. Растворитель ЭА+ДМФА 149
3.1.3. Растворитель СН2С12 + ДМФА 149 3.2. Карбодиимидный метод 150
3.3. Метод активированных эфиров 150
Заключение 152
Выводы 153
Список литературы
- Рецепторы холецистокинина
- Участие системы холецистокинина в регуляции паники и тревоги 3.6.1. Исследования на животных
- Синтез конформационно ограниченных аналогов 2.2.1. Синтез у-лактамного аналога, этилового эфира ЗІ?-[(фенилгексаноил)амино]-2-оксо-І-пирролидин-З-индолил і -пропионовой кислоты (соединение XIX)
- Синтез метиламидов (фенилацил)глицил-Х-триптофанов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Состояние тревоги, чувство страха и паника возникают как у здоровых людей в результате эмоционального стресса, так и у больных при различных тревожно-фобических синдромах. К ним относятся невротические состояния с явлениями напряжения, беспокойства, повышенной раздражительности, а также тревожно-депрессивные состояния, нарушения сна, некоторые психосоматические заболевания (язвенная болезнь желудка и 12-ти перстной кишки) и др. Такое многообразие тревожных состояний, различающихся по своим механизмам, требует широкого набора средств для их лечения.
В настоящее время известно более 100 препаратов, способных в большей или меньшей степени снимать тревожные состояния [Воронина Т.А., Середенин СБ., 2002]. Они относятся к классу психотропных средств и называются анксиолитиками или транквилизаторами, принадлежат к разным химическим группам и обладают различными механизмами действия. Почти половину из них составляют препараты бензодиазепинового ряда (диазепам, феназепам, клоназепам, лоразепам, оксазепам и др.), являющиеся агонистами ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса. Некоторые другие анксиолитики (буспирон, закоприд и др.) действуют через серотониновые рецепторы [Воронина Т.А., Середенин СБ., 2002]. Для ряда анксиолитиков (мебикар, мепробамат, афобазол) механизм действия не установлен.
На сегодня наиболее широко применяемыми транквилизаторами остаются бензодиазепины, в первую очередь благодаря высокой активности. Однако данный класс анксиолитиков обладает и рядом нежелательных эффектов. Наиболее проблемными из них являются развитие привыкания и формирование зависимости. Помимо этого, бензодиазепины оказывают седативное, миорелаксирующее, снотворное, амнестическое действие. В последнее время из-за такого обширного списка побочных эффектов были введены жёсткие меры по контролю за назначением и применением транквилизаторов бензодиазепинового ряда. В результате этого число зарегистрированных в России бензодиазепинов уменьшилось более чем на 50% [Аведисова А.С, 2006]. Упомянутыми побочными эффектами обладают и некоторые транквилизаторы других классов соединений (мепробамат, оксилидин).
Таким образом, создание новых анксиолитиков, чьё противотревожное действие не будет сопровождаться нежелательными побочными действиями, актуально.
Новые анксиолитики могут быть созданы на основе нейропептидов, которые участвуют в регуляции тревожного состояния. Пожалуй, наиболее ярким из них является холецистокинин-4 (ХЦК-4), селективно взаимодействующий с ХЦКг-рецепторами. Было показано, что он оказывает выраженное анксиогенное действие на животных [Bourin М. et al., 1996] и провоцирует панические атаки у 100% пациентов с паническими расстройствами и приблизительно у 50% здоровых волонтёров [Bradwejn J. et al., 1991]. На основании этих данных учёными Великобритании, США, Испании, Италии, России было создано несколько селективных ХЦК-антагонистов, обладающих анксиолитическими свойствами [Bock M.G. et al. 1989; Horwell D.C, 1991; Ballaz S. et al., 1997; Macovec F. et al., 1999; Ursini A. et al., 2000; Проскурякова T.B. и др., 2005 и другие]. Однако ни один из полученных
потенциальных анксиолитиков не прошёл стадию клинических исследований, и на сегодня среди транквилизаторов отсутствуют лиганды ХЦК-рецепторов как пептидной, так и непептидной природы.
Наиболее перспективным направлением в создании новых лекарственных препаратов является конструирование пептидомиметиков на базе структур эндогенных пептидов. Этот подход позволяет использовать преимущества пептидных соединений, обеспечивая минимальную токсичность и отсутствие побочных эффектов у конструируемых потенциальных препаратов. Кроме того, использование структур, имитирующих пептиды, позволяет избежать свойственных эндогенным соединениям недостатков, таких, как ферментативная нестабильность и многофункциональность.
Целью настоящего исследования является создание на базе структуры ХЦК-4 нового эффективного потенциального анксиолитика, свободного от побочных эффектов, характерных для транквилизаторов бензодиазепинового ряда и не уступающего им по эффективности. Задачи исследования:
1. Конструирование на базе ХЦК-4 новых пептидомиметиков с потенциально
анксиолитическими свойствами и их синтез.
Изучение взаимосвязи структуры и активности в ряду синтезированных соединений и отбор наиболее перспективного потенциального анксиолитика.
Изучение биологически активной конформации синтезированных аналогов ХЦК-4.
Синтез ряда конформационно ограниченных соединений на базе аналогов ХЦК-4.
Разработка лабораторной прописи получения отобранного потенциального анксиолитика. Научная новизна исследования
В настоящей работе впервые получена оригинальная группа триптофансодержащих N-ацилдипептидных аналогов ХЦК-4, обладающих анксиолитическими свойствами. Впервые показана возможность получения пептидных антагонистов ХЦК-4, целиком построенных из природных аминокислот. Эти соединения сконструированы с помощью модифицированного топохимического подхода Шемякина-Овчинникова-Иванова и представляют собой замещенные дипептиды с обратным ходом пептидной цепи по отношению к ХЦК-4 (ретро-аналоги).
Проведён конформационный анализ активных N-ацилдипептидных ретро-аналогов ХЦК-4 методом Н-ЯМР-спектроскопии в растворе, который показал, что предпочтительной конформацией активных соединений является Р-поворотная конформация типа П. На основе анализа связи структуры и функции получены данные о фармакофоре ретро-аналогов ХЦК-4. Показано, что для проявления анксиолитической активности необходимо наличие гидрофобных фенильной и индолильной групп (в ХЦК-4 входят в состав радикалов фенилаланина и триптофана), находящихся на расстоянии 13-ти о-связей. Синтезированы активные конформационно ограниченные аналоги ХЦК-4, подтверждающие биологически активную ріі-поворотную конформацию дипептидных ретро-аналогов ХЦК-4.
Впервые получены пептидные агонисты ХЦК-4 на основе /^-аминокислот, являющиеся его дипептидными ретро-энантио-аналогами. С помощью компьютерного
конформационного анализа показано фармакофорное подобие ХЦК-4 и его ретро-энантио-аналогов с анксиогенной активностью. Научно-практическая ценность
На серию N-ацилзамещённых дипептидных аналогов ХЦК-4 с анксиолитической и анксиогенной активностью получен патент Российской Федерации (№ 2227144). Наиболее активное и технологичное соединение, амид ]М-(6-фенилгексаноил)глицил-Ь-триптофана (ГБ-115), отобрано для расширенных фармакологических исследований в качестве потенциального анксиолитика. Этот дипептид находится на стадии завершения доклинических исследований. Разработана лабораторная пропись получения ГБ-115. Апробация работы
Результаты работы докладывались на 27-м Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), на 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, Россия, 2003), на 18-м Американском пептидном симпозиуме (США, 2003), на 8-й Региональной конференции Европейской коллегии нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), на 4-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Москва, Россия, 2006), на Ш-м Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на Ш-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007).
Публикации
По результатам работы опубликовано 4 статьи и 8 тезисов докладов на научных конференциях. Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 11 схем и 64 рисунка. Библиографический указатель включает 18 отечественных и 370 иностранных источников.
Рецепторы холецистокинина
Холецистокинин (ХЦК) - эндогенный пептид, синтезируемый в клетках головного мозга и в некоторых отделах желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Впервые холецистокинин был обнаружен в 1928 году в ЖКТ [1], при этом его физиологическая роль была определена как участие в стимуляции сокращения желчного пузыря и секреции панкреатических ферментов. Затем, уже в 1975 году, было установлено наличие ХЦК в центральной нервной системе (ЦНС) крыс [2].
Холецистокинин, первоначально охарактеризованный как 33-членный пептид, в организме представлен рядом биологически активных молекулярных форм (рис.1), образующихся из молекулы предшественника, состоящей из 115 аминокислотных остатков (а.к.о.) (препро-ХЦК) [3]. К ним относятся ХЦК-58, ХЦК-39, ХЦК-33, ХЦК-22, сульфатированные (sulfated) ХЦК-8 (XIJK-8S, Aspyr(S03H)-Met-Gryrp-Met-Asp-Phe-NH2) и XUK-7S, несульфатированные ХЦК-8 (ХЦК-SUS, Aspyr-Met-Glyrp-Met-Asp-Phe-NH2) и XIJK-7US, ХЦК-5 и ХЦК-4 (Trp-Met-Asp-Phe-NH2).
Холецистокинин широко распространён по всему организму. Так холецистокинин-подобная иммунореактивность была выявлена в ряде периферических органов, в частности, в слизистой оболочке двенадцатиперстной и тонкой кишки человека, собаки и крысы [4], в эндокринных клетках и брюшных нервах [5], в мужской репродуктивной системе [6,7]. Холецистокинин-подобная иммунореактивность обнаружена как в различных участках спинного и костного мозга [8], так и в многочисленных отделах головного мозга животных и человека. Кроме того, выявлена ко-локализация иммуннореактивности холецистокинина с рядом других нейропептидов: веществом Р [9], энкефалином [10], кортикотропин-высвобождающим гормоном [11], окситоцином [12]. Некоторое межвидовое различие выявлено по количеству областей ко-локализации ХЦК и дофамина: их много у крыс, мышей, кошек и приматов и мало у морских свинок и здоровых людей [2].
Специфически связывающие участки для холецистокинина были обнаружены в мозге и поджелудочной железе крысы в 1980 году [13-16]. Рецепторы были фармакологически квалифицированны на основе их сродства к различным фрагментам ХЦК (ХЦК-33, XIJK-8S, XI1K-7S и XUK-7US) и 17-членному пептиду гастрину, имеющему с холецистокинином одинаковую С-концевую пентапептидную последовательность (рис.1).
Было выявлено наличие двух типов ХЦК-рецепторов (тип А и тип В). ХЦКА-рецептор впервые был обнаружен в панкреатических клетках [18,19], тогда как ХЦКв-рецептор был обнаружен в мозге [18,20]. Изначально полагали, что рецепторы гастрина, расположенные в желудке и участвующие в регуляции секреции кислоты, составляют третий тип ХЦК-рецепторов [21]. Однако клонирование гастриновых и ХЦКв-рецепторов открыло их молекулярную идентичность, а исследования подтвердили предположение, что рецепторы гастрина соответствуют ХЦКв-рецепторам, локализованным в ЖКТ [22]. Впоследствии, согласно правилам о Номенклатуре Рецепторов и Классификации лекарств, установленным Комитетом Международного Союза Фармакологов (IUPHAR) [23], первоначальная номенклатура рецепторов ХЦКд и ХЦКв/гастрин была заменена на ХЦКі и ХЦКг, соответственно, хотя предыдущая номенклатура также не потеряла своей популярности.
Первоначально считалось, что расположение типов ХЦК-рецепторов строго поделено: ХЦКі - в периферической части организма (поджелудочной железе, желчном пузыре и кишечном тракте), а ХЦК2 - в ЦНС, - что и было подтверждено многочисленными работами (в частности [15,24]). Однако последующие исследования выявили, что «периферические» ХЦКі-рецепторы присутствуют и в отдельных тканях головного и спинного мозга, а «центральные» ХЦКг-рецепторы встречаются и на периферии. При этом было показано, что в отдельных участках спинного мозга у разных видов животных преобладают разные типы рецепторов. Так, например, у крыс преобладает ХЦКг-тип рецептора, а у обезьян и человека - ХЦКі-тип [25].
Как было выяснено в результате клонирования, оба типа рецепторов имеют схожую структуру. Это белок, состоящий из семи трансмембранных доменов (ТМ). Последовательность обоих рецепторов содержит три участка для N-связанного гликозилирования [26,27] и, по крайней мере, три участка для фосфорилирования С-протеинкиназой (рис.2,3) [28]. В обоих типах рецепторов имеются а.к.о. цистеина в 1-й и 2-й внеклеточных петлях, формирующие дисульфидный мостик [29], а также цистеин в С-концевом фрагменте, выполняющий роль мембранного якоря (рис.2,3) [30,31].
ХЦКі-рецептор крысы представляет собой белок из 429 а.к.о. [32]. Сравнение ХЦКі-рецепторов различных видов животных (крысы, морской свинки, кролика) и человека показало его межвидовую консервативность: его гомологичность составила свыше 80% [17]. Исследование идентичности аминокислотной последовательности ХЦКг-рецептора выявило некоторые межвидовые различия. Так ХЦКг-рецептор крысы представляет собой последовательность из 452 а.к.о., а ХЦКг-рецептор собаки — последовательность из 453 а.к.о. [33,34]. При этом общая аминокислотная идентичность составила свыше 72%.
Оба рецептора отнесены к классу G-протеин-связанных рецепторов [17]. Каскад передачи сигнала для ХЦК-рецепторов изучен мало, однако установлено, что для обоих типов ХЦК-рецепторов их существует как минимум два и запускаются они различными G-белками. Это либо гидролиз фосфатидилинозит-4,5-дифосфата фосфолипазой С, сопровождающийся образованием вторичных мессенджеров (инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина), последующим высвобождением ионов Са2+ и активацией протеинкиназы С [35-38], либо каскад «фосфолипаза Аг-арахидоновая кислота», регулирующий содержание ионов Са2+и секрецию амилазы [35,39-42]. ХЦКі и ХЦК2 рецепторы различаются между собой не только молекулярной структурой, но и различным сродством к природным лигандам (рис.1). Так, если рассматривать наиболее распространённые формы холецистокинина: сульфатированный и несульфатированный октапептиды (XU,K-8S и XU,K-8US), а также тетрапептид (ХЦК-4), то ХЦКі-рецептор связывается с XU,K-8S формой приблизительно в 1000-раз эффективнее, чем с XUK-8US и ХЦК-4 [14,16,25], тогда как сродство данных пептидов к ХЦК2-типу рецептора приблизительно одинаково (рис.1). Также можно сказать, что тетрапептид ХЦК-4 является селективным лигандом «центральных» ХЦКг-рецепторов, несульфатированный октапептид XtpC-8US предпочтительнее связывается с этим же типом рецепторов, а сульфатированный октапептид ХЦК-88 одинаково эффективно связывается с обоими типами ХЦК-рецепторов (рис.1).
Из некоторых исследований следует, что оба типа ХЦК-рецепторов могут находиться в трех состояниях, обеспечивающих различное сродство лигандов: состояния с «высоким», «низким» и «очень низким» сродством. Так работы [43,44] посвящены сравнению связывания пептида XIJK-8S и одного из селективных ХЦКі-антагонистов (L-364,718) с «периферическими» ХЦКі-рецепторами. Было установлено, что эндогенный агонист ХЦК-88 связывается с рецепторами в состояниях «высокого» и «низкого» сродства, а антагонист L-364,718 - с рецепторами в состояниях «низкого» и «очень низкого» сродства. Процентное содержание рецепторов, находящихся в состоянии «очень низкого» сродства, составляет 60-80%. Это приводит к тому, что антагонист L-364,718 связывается с большим количеством ХЦКі -рецепторов, чем XUK-8S. В исследованиях с другим ХЦК і-антагонистом JMV-179 [45] было подтверждено, что ХЦК]-рецептор существует более чем в двух состояниях, регулируемых мембранным G-протеином.
Гетерогенность ХЦКг-рецепторов была доказана в работах с несколькими лигандами «центральных» рецепторов. Было установлено, что различные агонисты [46-48], также как и различные антагонисты [49-51], связьшаются с разным количеством ХЦКг-рецепторов, что и подтолкнуло к идее о существовании нескольких популяций «центральных» ХЦК-рецепторов.
Такое разнообразие количества связывающих сайтов может быть объяснено несколькими способами. Возможно, взаимодействие рецептора с различными G-протеинами, запускающими разные каскады реакций, формирует конформации рецептора с разным сродством к лигандам [52]. Другим объяснением является то, что молекулярное строение лиганда обуславливает большее или меньшее его взаимодействие со связывающим сайтом рецептора, что, в свою очередь, приводит к «качественному» или «неполному» взаимодействию рецептора с G-белком [53].
Участие системы холецистокинина в регуляции паники и тревоги 3.6.1. Исследования на животных
Подтверждение того, что регулирующее действие ХЦК удобно реализовать через ХЦК2-рецепторы, было получено с использованием селективных ХЦКг-антагонистов. Действительно, в результате этого взаимодействия у грызунов происходило значительное (на 200-800%) увеличение обезболивающего эффекта ингибитора RB 101 [138]. Было показано, что ХЦКг-антагонист L-365,260 увеличивает обезболивающий эффект морфина у крыс и приводит к прямому анальгетическому действию у обезьян [139-141]. Аналогичный эффект наблюдался и для антагониста CI-988 [142,143]. Таким образом, было доказано, что анальгетический эффект, связанный с взаимодействием с опиатами, характерен именно для антагонистов ХЦКг-рецепторов.
Основываясь на том, что активированные ХЦКг-рецепторы оказывают негативное влияние на работу опиатных рецепторов, было сделано предположение, что введение селективного ХЦКг-антагониста в комбинации с ингибитором ферментативного распада энкефалинов увеличит уровень эндогенных опиатов, и тем самым уменьшит дискомфорт краткосрочного синдрома "отмены" — одного из наиболее проблемных моментов лечения морфийной зависимости [137]. Известно, что в течение острого синдрома "отмены" морфина происходит выброс опиатных пептидов и что защита этих пептидов смешанными ингибиторами ферментов, метаболизирующих энкефалин, снижает остроту этого состояния [134]. Это предположение было подтверждено в опытах Maldonado и др.. [144] с применением ингибитора RB 101 в комбинации с ХЦКг-антагонистом PD-134,308. Было показано [145,146], что PD-134,308 может предотвращать и даже обращать развитие толерантности к морфину, вызванную хроническим введением последнего. Более того, другое состояние опийной зависимости - затяжной синдром абстиненции, может облегчаться благодаря антидепрессантным свойствам упомянутого ингибитора, введенного индивидуально или в комбинации с селективным ХЦКг-антагонистом. Таким образом, возможность рецидива, наиболее важной проблемы лечения опийной наркомании, может быть снижена [147].
Как уже упоминалось, холецистокинин играет роль модулятора дофаминэргических процессов. Последние, в свою очередь, выполняют ключевую роль в процессах «мотивации» и «поощрения», которые, как считается, видоизменяются при депрессии [148]. Таким образом, невозможно исключить роль ХЦК в эмоциональных расстройствах.
Так, было показано, что селективные ХЦКг-агонисты ВС 264 и ВС 197 уменьшают моторную подвижность у мышей, подвергшихся днём ранее действию электрического тока, тогда как ХЦКг-антагонист L-365,260 производит обратный эффект. Эти данные говорят в пользу селективного участия ХЦКг-рецепторов в данном процессе [149].
Было высказано предположение, что антидепрессантоподобное влияние ХЦКг-антагонистов может быть вызвано увеличением внеклеточного дофамина, поскольку их воздействие удавалось предотвратить антагонистами Di и Бг-рецепторов в исследовании с тестом «принудительное плавание» [150]. Взятые вместе, полученные данные позволили предположить, что депрессия связана со сверхактивностью системы ХЦКг-рецепторов и что ХЦКг-антагонисты могут быть полезны в лечении синдрома депрессии [151].
Более того, было сделано предположение, что в этиологию депрессии могут быть вовлечены эндогенные энкефалины и особенно их взаимодействие с 5-опиатными рецепторами [17,152], а ряд депрессивных признаков может быть устранён воздействием ингибиторов энкефалин-метаболизирующих ферментов, в частности, RB 101 [153]. Так, было показано [152], что селективные антагонисты 5-опиатных рецепторов подавляют антидепрессантоподобный эффект, возникающий в результате введения ХЦКг-антагониста L-365,260. Эти же исследования показали, что ХЦКг-антагонисты, блокируя ХЦКг-рецепторы, усиливают антидепрессивное действие, вызванное стимуляцией б-опиатных рецепторов. Соответственно, антидепрессивное действие ингибитора эндопептидаз RB 101 усиливается действием ХЦКг-антагониста L-365,260 и подавляется ХЦКг-агонистом ВС 264 [153]. Взятые вместе, эти данные допускают, что ХЦКг-антагонисты, введённые индивидуально или в комбинации с классическими антидепрессивными препаратами или ингибиторами распада энкефалинов, могут быть использованы для лечения депрессивных синдромов.
Наличие анксиогенных свойств у холецистокинина было окончательно установлено в 1984 году, когда было показано, что инъекции С-концевого тетрапептида ХЦК-4, селективного агониста ХЦКг-рецепторов, приводят к проявлениям у человека состояний беспокойства, паники и тревоги [154,155]. В последующие годы активно исследовалось влияние на тревогу как ХЦК-4, так и множества селективных агонистов и антагонистов «центральных» рецепторов на различных животных моделях тревоги. Так было выявлено анксиогенное действие ХЦК-4 в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" (ПКЛ) у крыс [156]. В результате протревожного анксиогенного воздействия ХЦКг-агонистов у крыс и мышей в тесте ПКЛ подавлялось исследовательское поведение, уменьшалась двигательная активность и время пребывания в светлой части камеры в тесте «свет-темнота». Анксиолитическое противотревожное действие ХЦКг-антагонистов (L-365,260, CI-988 и LY 262691) проявлялось у разных видов животных на различных моделях тревоги: исследовательской модели «свет-темнота» и открытом поле для мышей, в тесте социального взаимодействия у крыс, в тесте ПКЛ у крыс и мышей, в модели "угрозы мартышке человеком" и ряде других исследований с обезьянами [157-165].
Большинство тестов, используемых для оценки анксиолитических свойств антагонистов ХЦКг-рецепторов, основано на наблюдении за исследовательской активностью животного, которая является следствием противоречия между боязнью нового и физиологической потребностью исследовать. Поэтому увеличение мотивации любопытства способствует более яркому проявлению анксиолитического эффекта ХЦКг-антагонистов [166-168]. В моделях тревоги, в которых конфликтная ситуация создаётся за счёт применения прямого грубого обращения, в частности электрошока, ХЦКг-антагонисты практически неактивны [71].
Особое внимание следует уделять степени влияния социальных факторов и окружения на результаты эксперимента, так как отсутствие анксиогенного эффекта у подопытных животных в результате введения ХЦК-4 может быть вызвано и базовой тревожностью животных, и их иерархической позицией в социальной группе. Известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных, конституционных характеристик эмоционально-стрессовое воздействие по-разному влияет на отдельных особей. У одних стрессовый ответ сопровождается активацией деятельности и её продуктивности, а у других эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или пассивному отстранению от решения проблем [166,169]. Или, например, от природы беспокойные, легковозбудимые обезьяны приходят в состояние патологического страха от низких доз ХЦК-4 [170]. В связи со всем вышеперечисленным, эффективную дозу и модель поведения следует выбирать с учетом уровня тревожности и социального устройства, характерных для используемого вида животных.
Окончательный механизм паникогенного и обратного, анксиолитического, эффектов на сегодняшний день не установлен. Хотя ХЦКг-рецепторы, по-видимому, и являются ключевым компонентом в инициируемом тетрапептидом ХЦК-4 паническом синдроме, есть данные исследований, сообщающих о проявлении анксиолитических свойств селективными антагонистами «периферических» ХЦКі-рецепторов [171] и анксиогенных свойств агонистами ХЦК і -рецепторов [172,173].
Кроме того, данных, что тетрапептид ХЦК-4 оказывает своё анксиогенное воздействие через взаимодействие с системами других нейротрансмиторов, становится всё больше. Как уже упоминалось, холецистокинин ко-локализован с дофамином, поэтому он может выполнять функции нейромодулятора дофаминоэргической нейротрансмисси [174,175], а дофаминэргические пути, как известно, имеют близкое отношение к механизмам мотивации и компенсации (вознаграждения) [176]. Поэтому, возможно, именно таким образом ХЦК участвует в регуляции причинного поведения. В другом исследовании [177] было показано, что введённый в структуры мозга XUK-8S через ХЦКі-рецепторьі уменьшает стремление к исследованию, связанному с «новизной». При этом было сделано предположение, что этот эффект связан со спадом метаболизма дофамина и опосредован пресинаптическими рецепторами дофамина D2 [177]. В работах [178,179] описаны исследования на животных, подтверждающие существенную роль серотонина, опиоидов, кортиколиберина и ГАМК-бензодиазепинового комплекса в создании состояния тревожности холецистокинином. В частности, в результате клинических исследований было обнаружено, что формирование паникоподобного поведения и соответствующих физиологических симптомов осуществляется совместным действием систем холецистокинина, серотонина [180] и ГАМК- бензодиазепинового комплекса [181].
Синтез конформационно ограниченных аналогов 2.2.1. Синтез у-лактамного аналога, этилового эфира ЗІ?-[(фенилгексаноил)амино]-2-оксо-І-пирролидин-З-индолил і -пропионовой кислоты (соединение XIX)
Большинство из новых лигандов ХЦКг-рецепторов сохраняло активность исходных соединений. Первое соединение данной группы RP69758 (рис.14,а) было достаточно активным, но малоселективным (КірШКг) 9,0 нМ, К;(ХЦКІ)/КІ(ХЦК2) 139, [248]), однако дальнейшие исследования [249] выявили его низкую способность проникать в ЦНС (биодоступность ниже 0,01%). Замена ацетильной группы на этилсульфонатную и введение метокси-группы в фенильное кольцо привело к 10-кратному возрастанию сродства к ХЦКг рецепторам, увеличив при этом селективность на порядок (ДІ(ХЦКІ)/КІ(ХЦК2) 3404) [250]. Дальнейшая модификация привела к строго селективному антагонисту ХЦКг-рецепторов RPR1011367 (рис.14,6) с К;(ХЦК2) 3,0 нМ. В экспериментах на крысах в тесте ПКЛ антагонист RPR1011367 проявил анксиолитические свойства [251]. о
Исследователями Glaxo Wellcome Medicines Research Centre была разработана группа ХЦКг-антагонистов, основанная на 1,5-бензодиазепиновом ядре, содержащем различные заместители. При этом в структуре новых лигандов «центральных» рецепторов прослеживалось некоторое сходство с их 1,4-бензодиазепиновыми предшественниками — это наличие -конфигурации по СЗ-атому и объемных заместителей в N1 и N5 положениях бензодиазепинового кольца (рис.15). Изначально предложенные 1,5-бензодиазепиновые структуры обладали свойствами селективных ХЦКі-агонистов, которые, в свою очередь, были обнаружены в результате направленного скрининга, проводившегося с целью выявить структуру, способную влиять на процесс сжатия желчного пузыря [252]. ХЦКг-антагонистом данной группы соединений, отобранным для фармакологических исследований, был GV150013 (рис.15, рК;(ХЦК2) 8,64 , К,(ХЩІ)/КІ(ХЦК2) 309 [253]). Это соединение в экспериментах с животными, в частности с крысами, показавшее анксиолитическую активность, в настоящее время находится на стадии клинических "исследований [254,255].
Сравнение структур 1,4-бензодиазепинового антагониста L-365,260 и 1,5-бензодиазепиновых антагонистов GV150013 и GV191869 Замена ІУ5-фенильной группы в соединении GV150013 на морфолиноэтильную привела к новому 1,5-бензодиазепиновому производному, получившему шифр GV191869 (рис.15). Это соединение показало себя как более мощный и селективный ХЦКг-антагонист по сравнению со своим предшественником (рКі(ХЦКг) 9,40, КІРЩКІ)/КІ(ХЦК2) 4988 [256]).
Наряду с бензодиазепиновым каркасом в качестве основы для структурного ядра использовали соединения, содержащие бензазепин. В работе Lowe и др. [257] (Central Research Division (Pfizer Inc.)) описано соединение CP212,454 (рис.16,а), содержащее бензазепиновую структуру и проявившее большее сродство к ХЦКг-рецепторам, чем 1,4-бензодиазепиновый лиганд L-365,260 (1С50(ХЦК2) 0,48 нМ; ІС5о(ХЩі)/ІС5о(ХЦК2) 367). Однако данное соединение обладало плохой водорастворимостью, что, по мнению исследователей, говорило о низкой оральной биодоступности. Модификация имеющейся структуры через замену М5-фенильной группы на циклогексильную и введение ионизируемой карбоксильной группы привело к созданию бензазепинового соединения СРЗ 10,713 (рис. 16,6), показавшего лучшую водорастворимость. Новое вещество оказалось гораздо активнее своего предшественника (ІСбоРЩКг) ОД нМ, ІС5о(ХЦКі)ЛС5о(ХЦК2) 14000 [258]). Тем не менее, согласно литературным данным, дальнейшего развития данная группа соединений не получила [251].
В исследованиях компании James Black Foundation, описанных в работе McDonald I.M и др. [259], в качестве базовой структуры было использовано замещенное 2,7-диоксо 2,3,4,5,6,7-гексагидро-1//-бензо[/г]-[1,4]диазониновое кольцо (рис.17). Авторы предположили, что этот гомолог бензодиазепина сохраїшт высокую степень активности и селективности исходных соединений и позволит создать новый тип селективных ХІДК2-лигандов.
Впоследствии было установлено, что увеличению силы связывания с ХЦКг-рецепторами способствует замена гидроксигруппы данного соединения (заместитель R2, рис.18) на следующие а.к.о.: глицин, L- или D-аланин, Р-аланин. Оптимальным заместителем в СЗ положении является объёмная гидрофобная 1-адамантилметильная группа, так как замена этой группы на менее объёмную значительно уменьшает степень связывания с ХЦКг-рецепторами. Большую роль во взаимодействии с ХЦКг-рецептором играет наличие фенильной группы в NJ-положении кольца, поскольку её удаление (Ri=H, рис.18) приводит к резкому уменьшению сродства к ХЦКг-рецепторам (рК; 5). Кроме того, существенным оказалось введение электроотрицательных галоидных заместителей в данную фенильнуго группу и их положение в ней. Так введение галоидов в мета- или пара-положение приводит к понижению сродства к ХЦКг-рецепторам. Возможно, это связано с изменением электронной плотности ІУУ-атома азота диазонинового кольца. Введение же атома фтора или хлора в opmo-положение существенно повьппает эффективность связывания с «центральными» рецепторами (pKj 6,99, Ri = o-Cl-Ph, рис.18).
Наиболее высокоаффинным представителем этого класса соединений оказалось соединение (1), представленное на рисунке 19: рК, 7,33 [259]. Рис.19. Диазониновое производное - соединение (1)
Структура асперлицина (рис.6) содержит несколько гетероциклических систем. Один из способов использования его структуры для создания лигандов ХЦК-рецепторов уже описан выше [219,229]. Другой подход был разработан исследователями Lilly Research Laboratories компании Lilly Corporate Center Yu M.J. с сотр. [260,261]. Он также основан на выделении некоего ядра из общей структуры асперлицина для получения новой группы непептидных лигандов ХЦК-рецепторов. В данном случае это 3-фенил-4(5//)-хиназолинон асперлицин 3-фенил-4(ЗЯ)-хиназолиноновое ядро
В работе [260] было изучено влияние различных заместителей в полученной структуре на сродство к ХЦК-рецепторам. В частности, на примере различных заместителей в отдельно стоящем фенильном кольце (Х0і Хи, Х„, рис.21) бьшо показано, что введение алкильнои или алкоксильнои группы в мета- или пора-положение на порядок увеличивает силу связывания соединения с ХЦК-рецепторами. Причем предпочтение отдается ХЦКг-рецепторам. Наибольшая аффинность наблюдалась в случае с изопропоксильной группой в л е/ио-положении (Хи = /-РЮ, рис.21): IC50 26нМ, - и этильной группой в пора-положении (Х„= С2Н5, Y = Вг, рис.21): 1С5028нМ. Хм
Одновременное введение изопропоксильной группы в л/ета-положение фенильного кольца и заместителя в С5 положение индолилыгого кольца (Y) привело к получению наиболее мощного ХЦКг-лиганда из этой серии соединений, получившего шифр LY-202,769 (рис.22, ІС509,ЗнМ, ЮзоСХЦКОЯСзоРЩКг) 1075) [260].
Большой вклад в эффективность связывания соединения LY-202,769 с «центральными» ХЦК-рецепторами, по-видимому, вносит спейсер между индолильным и хиназолиноновым кольцами, поскольку было показано, что любые конформационные ограничения, например: введение метильного заместителя в этиленовый мостик спейсера или введение двойной связи, - приводят к снижению силы связывания с ХЦК2-рецепторами до микромолярных значений [261].
В этой же лаборатории {Lilly Corporate Center) был сконструирован ещё один селективный ХЦКг-лиганд на основе структуры пиразолидинонового кольца (рис.23), показавший субнаномолярное сродство к «центральным» рецепторам (Kj=19 НМ) И прекрасную селективность, равную 1080. Этот антагонист в дальнейшем получил шифр LY-288,513 [262]. Вг-ГИ /?
Синтез метиламидов (фенилацил)глицил-Х-триптофанов
Первая стадия синтеза - получение хлорангидридов фенилзамещенных насыщенных карбоновых кислот - осуществлялась путем взаимодействия карбоновой кислоты с хлорсо держащим соединением, в данном случае с хлористым тионилом [337-339], с образованием в качестве побочных продуктов газообразных двуокиси серы (S02) и хлористого водорода. Согласно имеющимся данным, методики получения хлорангидридов карбоновых кислот посредством взаимодействия с SOCl2 различаются между собой по температурному режиму. По одной из изначальных методик, опубликованной в 1944 году и описывающей получение хлорангидрида фенилвалерьяновой кислоты [340], реакционную смесь кипятят в течение трёх часов. Согласно другим данным, относящимся к получению хлорангидрида фенилуксусной кислоты [341], повышение температуры реакционной смеси выше 55-60С приводит к потемнению и окрашиванию реакционной смеси. Получение всех хлорангидридов проводилось нами в мягких условиях, аналогично последнему варианту: в ходе синтеза реакционную смесь перемешивали 1 час при комнатной температуре и два часа при 55-60С. Непрореагировавший тионилхлорид отгоняли с толуолом. Хлорангидриды карбоновых кислот выделяли перегонкой в вакууме в виде прозрачных жидкостей с выходами около 80% и охарактеризовывали температурой кипения, сравнивая её с литературными данными.
Стадию ацилирования в-(амино)карбоновых кислот (Gly, p-Ala, GABA) полученными хлорангидридами проводили в условиях Шоттен-Баумана [342,343]. Данный метод является одним из основных, используемых для защиты NH-групп в пептидном синтезе, так как протекает в мягких условиях, а ацильные производные образуются, как правило, с высокими выходами [344]. Дополнительным реагентом реакции является водный раствор едкого натра, необходимый для образования натриевой соли Gly, р-А1а или GABA, а также для связывания образующегося хлористого водорода. По окончании реакции непрореагировавший хлорангидрид удаляли экстракцией этилацетатом. N-Ацильные производные Gly, Р-А1а или GABA, образующиеся в ходе реакции в виде натриевых солей, переводили в соответствующие кислоты IN НС1, выделяя при этом конечный продукт в виде кристаллов с выходом около 70%. Структуру и чистоту продукта подтверждали сравнением температуры плавления выделенных кристаллов с литературными данными (в случае их наличия) или элементным анализом, а также методом Н-ЯМР. Кроме того, индивидуальность соединений подтверждали ТСХ.
Гидрохлориды алкиловых эфиров Lrp получали с помощью хлористого тионила по методике M.Brenner и W.Huber [345], модернизированной для триптофана S.Guttmann и R.A.Boissonnas [346]. В последнем случае максимальная температура, предусмотренная в ходе реакции, была понижена с 40С до комнатной, а общее время реакции увеличилось с четырёх часов до двух суток. Продукт получали с выходом около 85%, идентифицируя его по температуре плавления, которую сравнивали с литературными данными, а также с помощью метода Н-ЯМР. Гомогенность эфира показывали с помощью тонкослойной хроматографии и охарактеризовывали эфир величиной удельного оптического вращения.
На следующей стадии синтеза получали эфир дипептида. Для образования пептидной связи во всех случаях, кроме эфира соединения VII, использовали метод смешанных ангидридов. Эфир дипептида, содержащего остаток Z-гистидина, получали методом активированных эфиров с использованием N-гидроксисукцинимида с целью избежать возможных осложнений и образования побочных продуктов, связанных с активным азотом имидазольного кольца остатка гистидина. В качестве конденсирующего агента использовали ДЦГК. После фильтрации выпавшей дициклогексилмочевины промежуточный продукт, сукцинимидный эфир ї\[-(6-фенилгексаноил)глицина, выделяли из раствора упариванием в вакууме с последующей кристаллизацией из изопропилового спирта. Охарактеризовывали данный промежуточный продукт температурой плавления, данными ТСХ и Н-ЯМР. Структуру и чистоту эфира дипептида подтверждали методом Н-ЯМР, элементным анализом и хроматографией в тонких слоях. Кроме того, конечный продукт был охарактеризован величиной удельного оптического вращения и температурой плавления.
Метод смешанных ангидридов был выбран в связи с рядом его преимуществ. Это высокие скорости реакции при низких температурах, сравнительно высокая чистота получаемых продуктов, препаративные выходы и доступность реагентов, а, кроме того, летучесть сопутствующих продуктов реакции: диоксида углерода и низко углеродного спирта [347]. Основным общепризнанным недостатком метода смешанных ангидридов является возможность рацемизации аминокислоты, входящей в состав карбоксильной компоненты, так как смещение электронной плотности с Са-углеродного атома благодаря образованию смешанного ангидрида провоцирует отрыв СаН-протона с образованием плоского аниона. Однако в нашем случае такой аминокислотой являются оптически неактивные глицин, (3-аланин и у-аминомасляная кислота, а также пространственно затруднённый остаток пролина, благодаря чему риск рацемизации в синтезе наших замещённых дипептидов отсутствует либо максимально снижен.
Посредством подбора реагентов для синтеза и контроля условий реакции также можно избежать и других побочных реакций, известных для данного метода (диспропорционирование, образование уридинового производного). Поэтому в настоящей работе в качестве реагента для образования смешанного ангидрида использовался изобутилхлорформиат, в качестве третичного амина - N-этилморфолин. Время активации составило 1-2 мин при температуре -10С. Для поддержания оптимального температурного режима на стадии конденсации данная температура поддерживалась ещё полчаса после добавления всех компонентов реакции в реакционную массу. Из-за низкой растворимости этилового/метилового эфира триптофана реакцию проводили в диметилформамиде. Полученный эфир дипептида очищали хроматографированием на колонке, при этом средний выход реакции составил 65%. В случае соединения XX эфир дипептида выделяли с помощью ВЭЖХ из маслообразной субстанции, полученной после вьшивания в воду реакционной смеси. Эфир дипептида, содержащего остаток L-фенилаланина, не очищали с помощью хроматографических методов, так как выделение его из реакционной массы посредством выливания в холодную воду позволяло получить конечный продукт в виде кристаллов, не содержащих каких-либо примесей. Структуру и чистоту полученных эфиров дипептидов во всех случаях определяли методом Н-ЯМР, элементным анализом и хроматографией в тонких слоях. Кроме того, каждый эфир дипептида был охарактеризован величиной удельного оптического вращения и температурой плавления в случае кристаллического продукта.
Последняя стадия синтеза — получение амидов/метиламидов дипептидов — заключалась в аммонолизе/аминолизе эфиров дипептидов. При этом соответствующий эфир фенилалканоилдипептида растворяли в 10-20 кратном объеме метанола, предварительно уже насыщенном аммиаком/метиламином при температуре от -5 до 0С, после чего реакционную смесь оставляли в закрытом сосуде при комнатной температуре на несколько дней [348,349]. Окончание реакции контролировали хроматографированием в тонких слоях. Кристаллические амиды дипептидов выделяли, затирая полученное после удаления метанола масло с диэтиловым эфиром. Средний выход продукта составил 80%. Структуру и чистоту продукта подтверждали методом Н-ЯМР, элементным анализом и методом тонкослойной хроматографии, дополнительно охарактеризовывая каждый амид температурой плавления и величиной удельного оптического вращения.
Дипептид XV с открытой карбоксильной группой получали омылением этилового эфира соответствующего дипептида IN раствором NaOH. В качестве исходного соединения для гидролиза был выбран эфир дипептида, поскольку сложные эфиры кислот гораздо легче подвергаются гидролизу, чем амиды. В щелочных же условиях данная реакция протекает быстрее и легче чем в кислых из-за меньшего объема гидроксильной группы по сравнению с ионом аксония, образующегося в кислой водной среде [352]. Полученную натриевую соль замещённого дипептида переводили в соответствующую кислоту мягким подкислением лимонной кислотой, которая более безопасна для триптофана чем соляная кислота [353,354].
