Содержание к диссертации
Введение
1. Влияние структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую активность в реакциях расщепления и лигирования РНК 9
1.1 Строение и свойства шпилечных рибозимов 11
1.1.1 Минимальный шпилечный рибозим 11
1.1.1.1 Происхождение минимального шпилечного рибозима 11
1.1.1.2 Первичная, вторичная и третичная структура минимального шпилечного рибозима 13
1.1.1.3 Сворачивание рибозим-субстратного комплекса 19
1.1.1.4 Каталитический механизм действия шпилечных рибозимов 26
1.1.2 Обращенный шпилечный рибозим, его происхождение и свойства 31
1.2 Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК 35
1.2.1 Природные рибозимы 36
1.2.1.1 Кинетика и термодинамика реакций расщепления и лигирования РНК 36
1.2.1.2 Влияние стабильности и структуры рибозим-субстратного комплекса на активность рибозима 41
1.2.2 Искусственные рибозимы 46
1.2.2.1 Вилочный шпилечный рибозим 46
1.2.2.2 Обращенный шпилечный рибозим 48
2. Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-иаправленного изменения последовательности РНК 53
2.1 Дизайн двойного рибозима как инструмента молекулярного воздействия 54
2.1.1 Стратегия сайт-направленного изменения последовательности РНК 54
2.1.2 Двойной рибозим R-DRBV 60
2.1.2.1 Предполагаемый способ синтеза рибозима R-DRBV 60
2.1.2.2 Синтез РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7 62
2.1.2.3 Разветвленный рибозим R-RB 67
2.1.2.3.1 Строение рибозима R-RB 67
2.1.2.3.2 Химический синтез рибозима R-RB 69
2.1.2.3.3 Каталитические свойства рибозима R-RB 75
2.2 Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях расщепления и лигирования РНК 81
2.2.1 Влияние природы нуклеотида в месте соединения доменов рибозима на его активность 81
2.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера на активность рибозима 87
2.3 Двойной обращенный рибозим R-DRV в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК 90
2.3.1 Модельная реакция изменения последовательности субстрата S40F3F5 90
2.3.2 Синтез двойного рибозима R-DRV 94
2.3.3 Свойства рибозима R-DRV в реакции расщепления РНК 96
2.3.4 Изменение последовательности РНК при помощи рибозима R-DRV 103
2.3.5 Оптимизация условий реакции изменения последовательности РНК 105
2.3.6 Каталитическая активность рибозима R-DRV 109
2.3.7 Внутреннее мечение РНК остатком молекулы-красителя Су5 112
3. Экспериментальная часть 116
3.1 Реактивы и материалы 116
3.1.1 Реагенты и растворители 116
3.1.2 Ферменты 116
3.1.3 Буферные растворы 116
3.1.4 Разделяющие материалы 117
3.1.5 Приборы 117
2.2 Методы и методики 119
3.2.1 Физико-химические методы анализа 119
3.2.1.1 Анализ РНК при помощи A.L.F. секвенатора ДНК 119
3.2.1.2 Анализ РНК при помощи LiCor 4200 секвенатора ДНК 119
3.2.1.3 Методы при получении РНК и ДНК 120
3.2.2 Синтезы 121
3.2.2.1 Синтез амидофосфита 1Ч4-(6-гидроксигексил-0-левулинил)-5-метил-5'-0-(4,4'-ДИметокситрифенил-метил)-1 -p-D-2-дезоксицитидина (8) 121
3.2.2.2 Синтез субстратных РНК 127
3.2.2.3 Мечение субстратных РНК 129
3.2.2.4 Синтез разветвленного рибозима R-RB 130
3.2.2.5 Синтез немодифицированных рибозимов 131
3.2.2.6 Синтез РНК-фрагментов, содержащих 2',3'-циклическую фосфатную группу 134
3.2.3 Определение нуклеотидного состава рибозима R-RB 135
3.2.4 Получение РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7 136
3.2.5 Расщепление РНК-субстратов 137
3.2.6 Лигирование РНК-фрагментов 139
3.2.7 Изменение последовательности РНК 140
3.2.8 УФ плавление дуплексов 141
3.2.9 Определение периода полураспада 2.3-циклической фосфатной группы в составе РНК 141
Выводы 143
- Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК
- Обращенный шпилечный рибозим
- Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях расщепления и лигирования РНК
- Изменение последовательности РНК при помощи рибозима R-DRV
Введение к работе
В настоящее время в молекулярной биологии и смежных областях науки много внимания уделяется изучению клеточных процессов с участием рибонуклеиновых кислот - трансляции и функционированию рибосомы {мРНК, тРНК, рибосомальные РНК), регуляции экспрессии генов (малые интерферирующие РНК, siRNA), процессингу РНК, - а также каталитически активным РНК (интроны I и II группы, рибозимы различных видов). При установлении роли рибонуклеиновых кислот в этих процессах часто стоит задача сайт-направленного изменения их нуклеотидной последовательности или введения модификаций. Модификация может вводиться как на 5- или З'-конец РНК, так и в ее центральную часть и представлять собой измененный по углеводному остатку, фосфатной группе или гетероциклическому основанию нуклеотид, флуоресцентный краситель, остаток какой-либо реакционно-способной или репортерной молекулы и т. п. В случае природных мутаций, вставок или делеций изменение последовательности РНК может быть произведено методом сайт-направленного мутагенеза [1, 2]. Задача изменения центральной части цепи РНК за счет введения неприродного фрагмента более трудна, так как синтезировать рибонуклеиновую кислоту, содержащую модификацию в заданной позиции цепи, при помощи ферментативного подхода невозможно. Для сайт-направленного введения модифицированного фрагмента в цепь РНК существует несколько подходов. Наиболее общий из них основан на методе твердофазного синтеза олигонуклеотидов. Однако с его помощью сегодня нельзя успешно получать молекулы РНК длиной более 100 звеньев [3]. Альтернативный подход заключается в сборке целевой РНК из олигорибонуклеотидных фрагментов, один из которых содержит модифицированное звено, методом ферментативного или химического лигирования. В работах Уленбекэ и сотр. [4, 5] по ферментативному лигированию РНК при помощи РНК-лигазы фага Т4 было показано, что эффективность такого процесса невысока (5 - 25 %) и зависит от нуклеотидного состава и длины соединяемых фрагментов. Невысокие выходы продуктов (4-16 %) наблюдали также З.А. Шабарова и сотр. а экспериментах по химическому лигированию РНК [6]. Очевидно, что при сборке молекулы РНК из нескольких фрагментов методом ферментативного или химического лигирования выход целевого продукта будет незначителен. Интересный способ получения модифицированных
рибонуклеиновых кислот недавно был предложен Салленгером и сотр. [7]. Он основан на способности интрона группы I катализировать in trans сплайсинг РНК. Неприродный фрагмент вводится в З'-концевой экзон, соединенный с нитроном -каталитическим мотивом. В процессе сплайсинга 3'- и 5'-концевой экзоны соединяются, образуя полноразмерную РНК. Однако этот подход не позволяет ввести модифицированный фрагмент в 5'-концевую часть рибонуклеиновой кислоты. Более того, чтобы им воспользоваться, необходимо сначала модифицировать З'-концевой экзон.
Из приведенных данных следует, что проблема сайт-направленного изменения центральной части протяженной РНК на настоящий момент полностью не решена. Поэтому разработка действенного метода, позволяющего направленно вводить во внутренний участок цепи РНК неприродный модифицированный фрагмент с требуемым функциональным свойством, является актуальной и важной задачей. Решение ее приблизит нас не только к пониманию механизмов протекания клеточных процессов с участием РНК, но и позволит получать рибонуклеиновые кислоты с заданными биологическими и физико-химическими свойствами. В связи с этим настоящая работа посвящена созданию инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение первичной структуры РНК, т.е. замещение внутреннего участка цепи РНК на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Такой инструмент предполагалось создать на основе шпилечных рибозимов.
Результатом проделанной работы было создание на основе обращенного и вилочного шпилечных рибозимов двойного обращенного рибозима -инструмента молекулярного воздействия, с помощью которого возможно сайт-направленное изменение нуклеотидной последовательности внутренней части молекулы РНК. Изменение первичной структуры РНК достигается путем замещения участка ее цепи на олигорибонуклеотид, содержащий в требуемой позиции природный или модифицированный фрагмент. Процесс состоит из двойного расщепления изменяемой РНК, замещении вырезанного участка цепи на новый, содержащий требуемую модификацию, и соединения модифицированного олигорибонуклеотида с полученными при расщеплении РНК 5'- и З'-концевыми фрагментами. В целях повышения эффективности лигирования оптимизирована структура обращенного рибозима, входящего в состав двойного рибозима. Показано, что выход продукта лигирования зависит
как от природы нуклеотида в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов обращенного рибозима, так и длины полинуклеотидного линкера между ними. Рибозим, содержащий в месте соединения доменов аденозин и гептааденилатный линкер обладал наивысшей активностью. Найдены оптимальные условия проведения процесса изменения последовательности РНК: продолжительность этапов расщепления и лигирования РНК и концентрация кофакторов (ионов Мд2+ и полиамина спермина) и модифицированного олигорибонуклеотида. Даны рекомендации по выбору температуры проведения реакции.
Работа включает литературный обзор, посвященный влиянию структуры шпилечных рибоэимов на их каталитическую активность в реакциях расщепления и лигирования РНК.
Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК
Процессы расщепления и лигирования РНК состоят из нескольких стадий, которые заключаются в связывании рибозимом субстратной РНК, сворачивании рибозим-субстратного комплекса, преобразовании субстрата в продукты расщепления или лигирования, разворачивании пост-реакционного комплекса и, если это возможно, диссоциации продуктов из него (схема II), В условиях однооборотных реакций, когда пре-реакционный комплекс уже сформирован и молекулы рибозима находятся в избытке по отношению к субстрату, скорость протекания реакции определяется временем, затрачиваемым на сворачивание комплекса и разрыв или образование связи в зависимости от процесса. В более сложном случае - в условиях многооборотных реакций - на скорость протекания реакции также влияет время, затрачиваемое на связывание субстратной РНК, разворачивание пост-реакционного комплекса и диссоциацию продуктов из него. Для того чтобы полностью охарактеризовать процессы расщепления и лигирования РНК, необходимо рассмотреть их от стадии связывания РНК-субстрата или РНК-фрагментов до стадии высвобождения продуктов(а) реакции из пост-реакционного комплекса, а также определить соответствующие каждой стадии кинетические параметры. Исторически оправдано то, что первым полностью охарактеризованным шпилечным рибозимом был минимальный шпилечный рибозим из f-J-цепи РНК вируса Tobacco Ringspot [10]. Впоследствии были получены различные производные природного рибозима, отличающиеся от него как одиночными нуклеотидными заменами, так и строением всей структуры. Модифицированные рибозимы были охарактеризованы в реакциях расщепления и лигирования РНК. Полученные кинетические параметры реакций, катализируемые природным рибозимом и его производными, были проанализированы. На основании экспериментальных данных стало возможным понять закономерности, лежащие в основе расщепления и лигирования РНК, знание которых позволяет направленно влиять на каталитическую активность рибозима. Изменяя структуру рибозима и, следовательно, структуру его комплекса с субстратом, можно сдвигать равновесие между процессом расщепления и лигирования РНК в требуемую сторону. В настоящей части литературного обзора анализируется зависимость каталитической активности шпилечных рибозимов в реакциях расщепления и лигирования РНК от их структуры и структуры образуемых ими с РНК комплексов.
Процессы расщепления и лигирования рассматриваются как с кинетической, так и термодинамической точки зрения. Обсуждаются способы воздействия на нуклеазную и лигазную активность шпилечного рибозима. Подробное исследование каталитической активности минимального шпилечного рибозима было проведено в 1995 г. в буферном растворе, содержащем 10 мМ MgCI2 и 50 мМ Трис-НСІ или HEPES-NaOH (рН 7,5), при 25 С [69]. Аналогичные условия использовались ранее для изучения реакций, катализируемых рибозимом вида «головка молотка». Они впоследствии были выбраны в качестве стандартных при определении влияния различных кофакторов на активность минимального шпилечного рибозима [95, 96], а также при исследовании его рибозимов-производных [42]. Каталитическую активность минимального шпилечного рибозима изучали на примере двух его аналогов (рис. 8 б). Цепи модифицированных рибозимов содержали на 5 -конце динуклеотид GC, который был введен с целью связать с ними лигируемый фрагмент Р2. Для минимального шпилечного рибозима в одно- и многооборотных реакциях было показано J55], что после расщепления РНК-субстрата продукты реакции Р1 и Р2 легко диссоциируют из пост-реакционного комплекса Е-Р1-Р2 (схема III). При этом высвобождение продуктов из комплекса Е-Р1-Р2 протекает намного быстрее, чем расщепление субстрата. После диссоциации продукты Р1 и Р2 не могут вновь образовывать комплекс Е-Р1-Р2, так как концентрация рибозима намного больше, чем субстрата. Следовательно, вероятность того, что оба продукта реакции расщепления будут одновременно связаны с одной и той же молекулой рибозима чрезвычайно мала. Ввиду быстрой диссоциации продуктов реакции расщепления Р1 и Р2 из пост-реакционного комплекса и их неспособности образовать пре-лигационный комплекс EPVP2, обратимым расщеплению процессом лигирования можно пренебречь, Тогда измеряемая константа скорости реакции расщепления субстрата kcteav,obs будет выражаться как kcieav,0bS = Kdock kchav и зависеть главным образом от наиболее медленной стадии. В случае лигирования РНК-фрагментов при существенном избытке комплекса Е-Р2 над фрагментом Р1 измеряемая скорость реакции лигирования отражает скорость достижения равновесия между процессом лигирования и расщепления. Следовательно, измеряемая константа скорости реакции лигирования /fj,a0bs выражается как кцд,оы = kdeav.ots + (K dock х кпд). Для шпилечных рибозимов было найдено, что катализируемые ими реакции расщепления РНК-субстратов характеризуются константой скорости kcieav равной 0,2 - 0,5 мин"1 [69]. Лигирование РНК-фрагментов протекало быстрее, и значение кцд было 2-3 мин 1. Анализ процессов сворачивания и разворачивания минимального рибозим-субстратного комплекса методом флуоресцентной спектроскопии показал, что измеряемая константа скорости сворачивания комплекса ES kd0CkiObSl которая выражается как kdock,obs - kdQCk + kunciock, в 3,5 раза выше константы скорости kcn?av [63]. Наоборот, для процесса лигирования значение той же константы для комплекса ЕР1-Р2 /c docA.obs - k dock + k uridoct( было равно значению кцд (2,5 мин"1). Эти данные позволяют сделать важное заключение о том, что в реакциях расщепления РНК-субстрата и лигирования РНК-фрагментов стадии, определяющие экспериментально измеряемую скорость реакции, различны.
При расщеплении более быстрая стадия сворачивания комплекса ES предшествует химической реакции, и скорость всего процесса зависит главным образом от скорости разрыва фосфодиэфирной связи. Напротив, в процессе лигирования сворачивание комплекса ЕР1-Р2 протекает одновременно с реакцией образования химической связи. Равновесие между расщеплением и лигированием РНК характеризуется константой равновесия Keq = кцд I kc/e3v, которая отражает разницу свободной энергии между реакционными комплексами в процессе расщепления ES и лигирования ЕР1 Р2 [21]. Значение константы равновесия Keq для реакций расщепления и лигирования РНК шпилечными рибозимами больше единицы и в среднем равно 7 - 10 . Это означает, что равновесие «расщепление -лигирование» сдвинуто в сторону процесса лигирования. По сравнению с рибозимом вида «головка молотка», который расщепляет РНК в 200 раз быстрее, чем лигирует, шпилечный рибозим ведет себя скорее как лигаза, чем нуклеаза [981. Исходя из значения константы Keq, можно заключить, что стабильность комплексов ES и Е-Р1-Р2, образованных с участием шпилечного рибозима, примерно одинакова. Действительно, на основании данных об энергии связывания субстрата и лигируемых фрагментов с рибозимом было найдено, что разница свободной энергии между обоими комплексами составляет всего 0,4 Согласно последним данным [97], полученным методом флуоресцентной спектроскопии іш молекулярном уровне для крестообразного шпилечного рибозима. лигирование протекает в 34 раза быстрее, чем расщепление. ккал/моль при значении общей энергии связывания субстратной РНК -12,4 ккал/моль. Для объяснения высокой лигазной активности шпилечного рибозима было предположено, что эффективность и скорость реакции лигирования РНК зависят от стабильности третичной структуры рибозим-субстратного комплекса [98]. Жесткая структура комплекса, образованного шпилечным рибозимом и субстратом, благоприятствует фиксированию нукпеофильной 5 -ОН группы и атакуемой 2 ,3 -циклической фосфатной группы в активном центре. Чрезмерная подвижность функционально-значимых групп комплекса в результате нарушения его стабильности неизменно сопровождается сдвигом равновесия между расщеплением и лигированием в сторону образования РНК-фрагментов. Например, проведение реакции в стандартном буфере в температурном интервале от 10 до 45 С показало, что при повышении температуры константа скорости реакции расщепления увеличилась в 30 раз, тогда как скорость лигирования увеличилась лишь в 12 раз [95].
Обращенный шпилечный рибозим
Разделение цепи минимального шпилечного рибозима между спиральными участками Н2 и НЗ с последующим соединением ее между Н1 и Н4 посредством олигонуклеотидного линкера позволило создать искусственный рибозим с «обращенным» расположением субстрат-связывающего и каталитического доменов - обращенный шпилечный рибозим (разд. 1.1.2, рис, 7 a) [34J, В предложенной структуре обращенного рибозима оба домена соединялись непосредственно или при помощи линкера, состоящего из 3, 6, 9, 12 или 18 остатков цитидина. Исследование в многооборотных реакциях расщепления РНК-субстрата каталитической активности производных обращенного рибозима, имеющих линкер различной длины, показало, что, в целом, скорость реакции расщепления РНК обращенными рибозимамисравнима со скоростью реакции, катализируемой исходным природным рибозимом (рис. 7 б). Значение константы скорости реакции возрастало в два раза при увеличении длины линкера от трех до восемнадцати остатков цитидина. Обращенный рибозим без линкера был неактивен. Можно предположить, что введение линкера, во-первых, препятствует повышенному движению обеих цепей рибозим-субстратного комплекса относительно друг друга, делая его структуру более жесткой. Во-вторых, наличие линкера необходимо, чтобы обеспечить пространственную близость петель А и В комплекса и, следовательно, сохранить каталитическую активность рибозима. Увеличение длины линкера повышает гибкость цепи рибозима в месте соединения его доменов, в результате чего сворачивание рибозим-субстратного комплекса в правильную пространственную структуру становится более легким. Действительна, положительное влияние гибкости структуры комплекса в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов рибозима на процесс сворачивания наблюдали также для крестообразного и вилочного шпилечных рибозимов [29, 42, 106], Отсутствие каталитической активности у обращенного рибозима, не содержащего линкер, может быть обусловлено отсутствием или неблагоприятным пространственным перекрыванием петель А и В. Также вероятно, что отсутствие «шарнира» между цепями комплекса приводит к возникновению коаксиального стекинга между участками Н1 и Н4. Например, его наличие между участками Н2 и НЗ в минимальном рибозиме отрицательно влияет на сворачивание комплекса и активность рибозима [63]. Для гексацитидилатного линкера было показано, что замещение в нем остатков цитидина на остатки аденозина приводит к увеличению константы скорости реакции расщепления в 1,5 раза. Объяснение этому эффекту найдено не было.
В настоящем литературном обзоре было продемонстрировано, что шпилечные рибозимы, несмотря на их общность с другими видами природных РНК-катализаторов, обладают некоторыми особенностями строения и функционирования. Подобно рибозимам вида «головка молотка» или вируса гепатита дельта, шпилечные рибозимы катализируют реакцию сайт-направленного расщепления последовательности РНК-субстрата и обратный ей процесс соединения двух РНК-фрагментов - лигирование. После расщепления цепи РНК образуются два продукта. Один из них содержит 5 -концевую ОН-группу, а другой - 2 ,3 -циклическую фосфатную группу. Лигирование протекает в обратном направлении и приводит к образованию только 5 ,3"-межнуклеотиднай фосфодиэфирной связи. Реакция трансэтерификации подчиняется механизму бимолекулярного нуклеофильного замещения (SN 2) и происходит в активном центре рибозим-субстратного комплекса. Комплекс состоит из двух цепей, одна из которых образована субстрат-связывающим доменом рибозима и субстратной РНК (цепь I), а другая представляет собой каталитический домен рибозима (цепь II). Цепи I и II содержат по одной внутренней петле (А или В, соответственно), фланкированной спиральными участками. Расщепление или лигирование РНК происходит в составе петли А и возможно только в случае сворачивания рибозим-субстратного комплекса в каталитически активную пространственную структуру. В активной конформации цепи комплекса плотно контактируют и повернуты друг относительно друга на угол примерно 70. Сближение цепей сопровождается перекрыванием петель А и В, в результате чего формируется активный центр комплекса. Его структура стабилизирована за счет обширной сети водородных взаимодействий между нуклеотидами субстрата вблизи места расщепления/лигирования и нуклеотидами как петли А, так и петли В каталитического домена. Правильное и фиксированное положение функционально-значимых групп рибозим-субстратного комплекса в пре-реакционном комплексе и переходном состоянии обеспечивают быстрое и эффективное протекание процесса расщепления или лигирования РНК. Успех реакции определяется, в частности, наличием нескольких консервативных нуклеотидов в составе субстратной РНК и цепи рибозима, выполняющих в катализе структурную или каталитическую функцию. Так, была показана исключительная консервативность нуклеотида G+i, близлежащего к месту расщепления/лигирования, а также ряда других нуклеотидов в составе обеих петель. Уникальность каталитического действия шпилечного рибозима заключается в том, что реакция расщепления и образования межнуклеотидной фосфодиэфирной связи протекает без участия ионов двухвалентных металлов. В отличие от белковых катализаторов и других видов рибозимов шпилечные рибозимы в процессе катализа не требуют ни прямого, ни опосредованного координирования ионов Мдг+ ни на одной из стадий реакции. Роль кислотно-основных катализаторов выполняют функциональные группы оснований нуклеотидов, входящих в состав петель А и В. Координирование в переходном состоянии этих групп расщепляемым мотивом 3 -ApG-5 в составе субстрата было подтверждено данными рентгеновского структурного анализа. Как было показано в экспериментах по изучению процесса сворачивания рибозим-субстратного комплекса, ионы двухвалентных металлов выполняют лишь структурную роль в функционировании шпилечного рибозима.
Наличие ионов Мд2 необходимо для сворачивания комплекса в каталитически активную пространственную конформацию, и их действие не может быть компенсировано ионами одновалентных металлов при физиологической концентрации. Расщепление и лигирование субстратной РНК шпилечным рибозимом возможно только в свернутом рибозим-субстратном комплексе, и реакция лигирования РНК-фрагментов протекает в 7 - 10 раз быстрее, чем расщепление РНК-субстрата. Повышенная лигазная активность шпилечного рибозима обусловлена особенностями строения образуемого им с РНК пре- и пост-реакционного комплекса, а также энергетической выгодностью процесса образования межнуклеотидной б .З -фосфодиэфирной связи по сравнению с 2 ,3 -циклической фосфатной группы. Несмотря на доминирование процесса лигирования над расщеплением, существуют действенные способы воздействия на положение равновесия «расщепление - лигирование». С помощью применения различных производных минимального шпилечного рибозима было показано, что скорость и эффективность протекания реакции расщепления и лигирования зависят от жесткости структуры рибозим-субстратного комплекса. При постоянном солевом составе реакционной смеси жесткость комплекса определяется стабильностью дуплекса, образуемого субстратной РНК и субстрат-связывающим доменом рибозима, и способом соединения его обеих цепей. Скорость расщепления достигает своего максимального значения тогда, когда рибозим способен связывать РНК-субстрат и формировать с ним комплекс, структура которого достаточно прочна для того, чтобы образовать активную конформацию, но не на столько жестка, чтобы продукты расщепления, будучи связанными с рибозимом, подвергались ре-лигированию. Стабилизация продуктов расщепления или, что равносильно, соединяемых фрагментов в комплексе с рибозимом способствует протеканию реакции лигирования. Прочность связывания лигируемых фрагментов с рибозимом можно повысить путем удлинения длины дуплекса, образуемого ими с рибозимом, и/или замещения неконсервативных нуклеотидных пар A/U на более стабильные G/C. Дополнительную жесткость рибозим-субстратному комплексу придает введение спиральных участков в его состав. Например, наличие цепей III и IV или участка Н5 в крестообразном или вилочном рибозиме, соответственно, повышает стабильность комплекса, что приводит к существенному возрастанию скорости реакции лигирования
Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях расщепления и лигирования РНК
Нами было установлено, что обычный обращенный рибозим R-RC6 способен расщеплять различные РНК-субстраты, Кроме того, он в отличие от разветвленного рибозима R-RB способен катализировать реакцию лигирования РНК-фрагментов. В связи с этим для создания активного двойного рибозима было решено использовать обращенный рибозим R-RC6. В целях увеличения каталитического потенциала рибозима R-RC6 мы провели оптимизацию его первичной структуры в реакциях расщепления и лигирования РНК. Нуклеазную активность рибозима (скорость реакции) повышали, варьируя природу нуклеотида (М) в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов (рис. 23). Для этого методом транскрипции был получен производный рибозим R-RA6, отличающийся от исходного рибозима R-RC6 только тем, что в позиции М вместо нуклеотида гС находился гА. Для расщепления брали субстрат S14F5 и его аналог S1, содержащий на З -конце вместо гуанозина уридин (рис. 23). Выбор субстрата S1 был связан с возможностью сохранить длину спирального участка Н1 (6 н.п.) при замене на месте М цепи рибозима нуклеотида гС на гА. Расщепление проводили в условиях избытка рибозима по отношению к субстрату. Полученные результаты показали, что расщепление РНК в комплексах R-RC6 S14F5 и R-RA6-S1 наряду с R-RA6 S14F5, содержащих в месте соединения доменов рибозима нуклеотид гС или гА, соответственно, протекало с различной скоростью (табл. 2). В случае комплексов R-RA6-S1 и R-RA6 S14F5 значение константы скорости реакции расщепления kcigav было в 3,5 раза выше, чем для комплекса R-RC6-S14F5. Высокую скорость расщепления наблюдали также в случае рибозима R-RC6, если в качестве субстрата брали олигонуклеотад S1 {табл. 2). Более быстрое протекание реакции в комплексе R-RC6 S1 по сравнению с комплексом R-RC6 S14F5 обусловлено, по-видимому, тем, что их строение различно. Так, субстрат S1, связываясь с рибозимом R-RC6, формирует на конце дуплекса Н1 некомплементарную пару U/C (рис. 23). В результате этого длина участка Н1 сокращается на одну нуклеотидную пару, составляя 5 н.п., а длина гексааденилатного линкера, соединяющего домены, увеличивается на одно звено. В связи с тем, что скорость расщепления РНК в составе рибозим-субстратных комплексов R-RA6«S1, R-RA6-S14F5 и R-RC6«S1 одинакова, можно предположить, что их структуры похожи. Субстрат S1 формирует с рибозимом R-RC6 комплекс, в котором дуплекс Н1 имеет длину 5 н.п,, а соединяющий домены линкер образован семью остатками аденозина.
По-видимому, комплексы R-RA6-S1 и R-RA6 S14F5 имеют аналогичную ему структуру, т.е. взаимодействия в нуклеотидной паре, фланкирующей дуплекс Н1, нарушены. В комплексе R-RC6 S14F5 пара G/C на конце участка Н1 более прочна, чем UAA. Поэтому она сохраняется в процессе сворачивания комплекса, обусловливая наличие в нем дуплекса Н1 длиной 6 н.п. и полинуклеотидного линкера из шести остатков аденозина. На основании того, что нуклеазная активность рибозима R-RA6 была выше, чем рибозима R-RC6, мы заключили, что для быстрого расщепления РНК обращенным рибозимом в месте соединения его каталитического и субстрат-связывающего доменов должен находиться нуклеотид гА. Влияние природы нуклеотида М на пигазную активность обращенного рибозима изучали, сравнивая эффективность и скорость реакций лигирования, катализируемых рибозимами R-RC6 и R-RA6, содержащими на месте М нуклеотид гС или гА, соответственно (рис. 24). Для лигирования брали один длинный олигорибонуклеотид S17F5cp с 2 ,3-циклической фосфатной группой на З -конце и два коротких - SU9 и SG9 (рис. 24). Фрагменты SU9 и SG9 различаются лишь природой З -концевого нуклеотида К и содержат rU или rG, соответственно. Лигирование осуществляли при 32 С в том же буферном растворе, что и фрагментов SG19 и S17F5cp (разд. 11.1.2,3.3). Реакцию проводили в двух вариантах: либо брали все олигонуклеотидные компоненты смесей в эквимолярном количестве, либо использовали избыток рибозима и 5 -концевого лигируемого фрагмента S17F5cp по отношению к З -концевому фрагменту SU9 или SG9, причем в данном случае количество олигонуклеотида S17F5cp было на 10 % больше, чем рибозима. При таком избытке 17-мера можно считать, что приблизительно все молекулы рибозима связаны с ним в комплекс, концентрация которого определяется количеством внесенного в реакционную смесь рибозима. Полученные данные показали, что исследуемые рибозимы R-RC6 и R-RA6 лигируют фрагменты SU9 и SG9 с S17F5cp [рис. 25, дорожки 3 - 6). В случае рибозима R-RA6, содержащего в месте соединения доменов нуклеотид гА, значения эффективности и константы скорости реакции для обоих коротких субстратов были выше по сравнению с рибозимом R-RC6 (рис. 25, дорожки 3-6; табл. 3). Так, лигирование SG9 и S17F5cp рибозимом R-RA6 протекало в 12 раз быстрее, а эффективность была в два раза выше, чем в случае рибозима R-RC6. Из полученных результатов следует, что замена нуклеотида гС на гА положительно влияет на лигазную активность обращенного рибозима. Более того, как мы установили ранее в реакциях расщепления субстратов S1 и S14F5 рибозимами R-RC6 и R-RA6, данная замена также способствует повышению нуклеазной активности обращенного рибозима. Для того чтобы выяснить влияние прочности (длины) дуплекса Н1 на скорость реакции, мы провели лигирование фрагментов SG9 и SU9 с S17F5cp при помощи рибозима R-RC6 (рис. 24). Так как фрагмент SU9 в отличие от SG9 имеет на З -конце вместо гуанозина уридин, то дуплекс, образуемый им с рибозимом, образован пятью нуклеотидными парами, и поэтому он менее стабилен, чем дуплекс SG9/R-RC6 (6 н.п.).
Опытные данные показали, что константа скорости реакции лигирования кцд для SU9 была в 4 раза выше, чем в случае SG9 (табл. 3). Следовательно, понижение прочности дуплекса Н1 в комплексе рибозима R-RC6 с РНК за счет уменьшения его длины с 6 до 5 н.п. благоприятствует лигированию. Такая же закономерность наблюдалась и в случае рибозимов R-RA7, R-RA8 и R-RA12 (табл. 3), для которых скорость и эффективность лигирования была выше при формировании 5-звенных дуплексов Н1. Однако при лигировании фрагментов SG9 и SU9 с S17F5cp этими рибозимами значения кцд для разных фрагментов различались в меньшей степени. По-видимому, это связано с тем, что пара U/A, фланкирующая дуплексы, образуемые рибозимами R-RA7, R-RA8 и R-RA12 с SU9, менее стабильна, чем пара G/C в составе дуплекса SG9/R-RC6, поэтому при сворачивании рибозим-субстратного комплекса она гложет разрушаться, что приводит к формированию участка Н1 длиной 5 н.п. Обнаруженная нами закономерность нарушается только в случае рибозима R-RA6, который лигировал субстрат SU9 лучше, чем SG9 (табл. 3). Возможно, это обусловлено особенностями формирования третичной структуры комплекса рибозима R-RA6 с указанными субстратами. Интересно отметить, что наличие пары G/C в точке соединения каталитического и субстрат-связывающего доменов отрицательно влияет не только на лигирование, но и на расщепление РНК. Так, результаты расщепления субстратов S14F5 и S1 рибозимами R-RC6 и R-RA6 (рис. 23) показали, что расщепление РНК в комплексах, содержащих пары U/A (R-RA6-S1), U/C (R-RC6-S1) и G/A (R-RA6-S14F5), протекает с примерно одинаковой скоростью (табл. 2). В случае же комплекса R-RC6-S14F5, содержащего пару G/C, значение константы скорости реакции kcieav было в 3,5 раза ниже. II.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера на активность рибозима Затем мы исследовали влияние длины полинуклеотидного линкера, соединяющего каталитический и субстрат-связывающий домены обращенного рибозима, на его лигазную активность. Для этого использовали рибозимы R-RAn, которые являются производными рибозима R-RA6 и отличаются от него тем, что имеют более длинный линкер, состоящий из 7, 8 и 12 остатков аденозина (рис. 24), Все рибозимы-производные и R-RA6 образуют серию рибозимов, условно обозначенную как R-RAn, где п = 6, 7, 8 и 12. Каталитические свойства рибозимов R-RA7, R-RA8 и R-RA12 в реакциях лигирования изучали, используя короткие РНК-фрагменты SU9 и SG9 и длинный S17F5cp. Эффективность реакции определяли как при равной концентрации всех олигонуклеотидных компонентов смеси, так и при избытке комплекса рибозима с S17F5cp по отношению к короткому фрагменту. Экспериментальные данные показали, что наивысшей каталитической активностью обладает рибозим R-RA7, в котором длина полиаденилатного линкера составляет семь нуклеотидов (рис. 24, п = 7, табл. 3).
Изменение последовательности РНК при помощи рибозима R-DRV
Установив функциональность двойного рибозима R-DRV в реакции расщепления субстрата S40F3F5, мы исследовали его способность катализировать процесс изменения последовательности РНК. Замещение внутреннего участка субстрата на олигорибонуклеотид S20cp осуществляли в два этапа согласно схеме, изображенной на рисунке 27. Сначала проводили расщепление субстрата рибозимом в эквимолярных условиях. Затем в реакционную смесь добавляли аликвоту раствора олигонуклеотида S20cp. Выход главного продукта реакции P44F3F5 рассчитывали, находя отношение его количества к общему количеству всех меченных флуоресцеином олигонуклеотидов. Аналогичным образом находили содержание не вступившего в реакцию субстрата S40F3F5. Субстрат расщепляли буферном растворе, содержащем 16,5 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 11 мМ МдСІг и 2,2 мМ спермин. При добавлении в реакционную смесь водного раствора S20cp происходило разбавление компонентов смеси, поэтому лигирование 5 - и З -концевых РНК-фрагментов с 20-мером протекало в условиях 15 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 10 мМ МдС!г и 2 мМ спермина. Анализ реакционной смеси через 30 минут после начала расщепления показал, что в ней содержатся все меченые продукты реакции: 3 - и 5 -концевой фрагменты (9- и 15-мер, соответственно), а также промежуточные 25-и 31-звенный олигонуклеотиды, получающиеся при однократном разрезании субстрата (рис. 33 а, дорожка 2). После добавления в реакционную смесь олигорибонуклеотида S20cp наблюдалось возникновение трех новых пиков. Они соответствовали 29- и 35-меру, получающемуся в результате лигирования 20-мера с 9- или 15-звенным фрагментом, соответственно, и 44-меру - продукту реакции двойного лигирования (рис. 33 а, дорожки 3 и А). После 15 минут лигирования образовалось 5 % целевого 44-звенного продукта P44F3F5, в то время как количество исходного субстрата S40F3F5 было 13 % (рис. 33 а, дорожка 3; рис. 33 б). Продолжение инкубации реакционной смеси в течение еще 105 минут способствовало возрастанию доли продукта до 9 % и уменьшению количества исходной РНК до 5 % (рис. 33 а, дорожка 4; рис. 33 б). Нами была исследована способность комплекса, образованного двойным рибозимом R-DRV и субстратом S40F3F5, формировать правильную вторичную структуру. Для этого при помощи программы «RNA structure 4.0» было смоделировано строение наиболее стабильных комплексов.
Оказалось, что вторичная структура самого стабильного комплекса (AG37 = -70,7 ккал/моль) соответствовала предполагаемому характеру связывания субстрата и рибозима (рис. 27 а). Другой близлежащий по энергии комплекс (AAG37 = 0,2 ккал/моль) имел неправильную вторичную структуру. В ней 5 -концевой участок рибозима GGGAGA формировал нежелательный дуплекс с цепью каталитического домена В" в составе обращенного рибозима. Естественно, расщепление и лигирование РНК в таком комплексе невозможно. Для того чтобы исключить формирование неправильной структуры комплекса рибозима с РНК, мы блокировали последовательность GGGAGA при помощи комплементарного ей олигонукпеотида SS-anti (рис. 27 в). Расчет вторичной структуры комплекса R-DRV S40F3F5 S6-anf/ показал, что он формирует одну стабильную, правильную структуру. Мы повторили реакцию изменения последовательности S40F3F5, изначально добавив в реакционную смесь блокирующий олигонуклеотид. Его положительное влияние на стадиях расщепления и лигирования оказалось бесспорным - выход целевого продукта P44F3F5 возрос почти в два раза, составив 17 % (рис. 33 б). Нами было показано, что реакция расщепления субстрата S40F3F5 двойным рибозимом протекает наиболее эффективно и быстро в буферном растворе с пониженной до 1 мМ концентрацией ионов Мд2+ (табл. 5, смесь В). В целях возможного увеличения выхода главного продукта P44F3F5 проводили реакцию изменения последовательности S40F3F5 в растворе, содержащем на стадии лигирования 15 мМ Трис-НСІ (рН 7,5), 1 мМ MgCI2 и 2 мМ спермин. Концентрация солей на стадии расщепления была на 10 % выше, чем на стадии лигирования, что было связано с разбавлением реакционной смеси при добавлении раствора олигорибонуклеотида S20cp. Полученные данные показали, что на стадии расщепления субстрата S40F3F5 выход конечных продуктов реакции (9- и 15-звенного олигонуклеотидов) в растворе, содержащем 1,1 мМ MgCI2, был на 25 % выше, чем в растворе с 11,1 мМ концентрацией ионов магния (обычные условия). Ввиду того, что при пониженной концентрации хлорида магния выход 9- и 15-меров был наивысшим, можно было бы предположить, что в данном случае эффективность замещения 16-звенного внутреннего участка субстрата S40F3F5 (рис 27) на олигонуклеотид S20cp будет выше, чем в обычных условиях. Однако оказалось, что в условиях низкого содержания MgCI2 выход целевого продукта P44F3F5 составил менее 1 % (рис. 34, смеси Bv\ Е). Проведение этапа лигирования при высокой концентрации ионов магния (100 мМ) увеличению выхода целевого продукта также не способствовало (рис 34, смесь 3). Более того, он был даже ниже, чем в обычных условиях (рис. 34, смеси Е и 3). Полученные результаты, по-видимому, объясняются тем, что при пониженной концентрации ионов магния (1 мМ) структура комплекса, образуемого двойным рибозимом с лигируемыми РНК-фрагментами и вставляемым олигонуклеотидом, недостаточно жестка для протекания реакции. Вероятно, «рыхлая» структура комплекса обусловлена нестабильностью дуплексов из 5 - и З -концевого РНК-фрагментов (9- и 15-мер) и цепи рибозима.
В результате эффективность реакции лигирования и, следовательно, всего процесса крайне низка. Можно предположить, что увеличение выхода продукта P44F3F5 в условиях 10 мМ MgCI2 обусловлено повышением стабильности обозначенных дуплексов. Негативное влияние высокой концентрации ионов магния (100 мМ) объясняется, по-видимому, тем, что в данных условиях заменяемый 16-звенный фрагмент образует весьма прочный дуплекс с субстрат-связывающим доменом рибозима Поэтому процесс его замещения на олигонуклеотид S20cp затруднен. Следовательно, эффективность протекания этапа лигирования уменьшается и выход целевого продукта падает. Эффект влияния стабильности дуплекса между заменяемым 16-звенным олигонуклеотидом и двойным рибозимом на выход целевого продукта наблюдали, проводя этап лигирования процесса изменения последовательности РНК при пониженной (4 С) температуре Субстрат S40F3F5 расщепляли при 37 С в течение 30 мин в буфере с обычным солевым составом (табл. 5. смесь ). Затем в реакционную смесь добавляли фрагмент S20cp и делили ее пополам С одной частью раствора проводили лигирование при 4 СС, а с другой - при 37 С. Оказалось, что при пониженной температуре выход продукта P44F3F5 ниже, чем при 37 С. Он составил 3 % после 2 ч инкубации (рис. 35, кривые 1 и 2) Можно предположить, что столь низкий выход обусловлен трудностью замещения 16-мера, образующего в условиях реакции стабильный дуплекс с рибозимом, на вставляемый олигонуклеотид S20cp. Повышение температуры реакционной смеси способствует «разрыхлению» структуры дуплекса и, как следствие, диссоциации заменяемого фрагмента. Связывание 20-звенного олигонукпеотида с рибозимом возможно, так как формируемый ими дуплекс прочнее Он не содержит выпетленный участок и его длина на 4 н.п. больше. Оптимальную температуру лигирования 9- и 15-звенного РНК-фрагментов с олигорибонуклеотидом S20cp находили, проводя стадию лигирования процесса изменения последовательности субстрата S40F3F5 при 4, 25, 32 и 37 С. Температура реакционной смеси на стадии расщепления субстрата была постоянной (37 С). Оказалось, что лигирование эффективно протекало только при 32 и 37 С, причем найденные при обеих температурах значения выхода P44F3F5 различались весьма незначительно (при 32 С выход был на 1 % выше) и составили не более 10 %. Процесс замещения 16-звенного фрагмента, образующегося после двойного расщепления исходной РНК, на вставляемый 20-звенный олигонукпеотид является обратимым. Поэтому выход целевой РНК можно повысить, например, увеличив в реакционной смеси содержание комплекса рибозима с олигонуклеотидом S20cp. Сдвинуть положение равновесия в сторону образования этого комплекса можно, повысив концентрацию 20-мера.
