Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Нейротрофины 8
1.1.1. Члены семейства нейротрофинов 8
1.1.2. Структура нейротрофинов 10
1.2. Рецепторы нейротрофинов 12
1.2.1. Тирозинкиназные рецепторы 12
1.2.1.1. Структура тирозинкиназных рецепторов 12
1.2.1.2. Механизм передачи сигнала посредством Trk рецепторов и биологические ответы 15
1.2.2. Рецептор р75 19
1.2.2.1. Структура р75 рецептора 19
1.2.2.2. Механизм передачи сигнала посредством р75 рецептора и биологические ответы 19
1.3. Вовлеченность нейротрофина NGF в патогенез нейродегенеративных заболеваний 21
1.3.1. Фармакологические данные NGF при применении его на различных моделях 21
1.3.2. Перспективы генной терапии NGF 27
1.3.3. Клинические испытания NGF 29
1.4. Низкомолекулярные миметики нейротрофина NGF 33
1.4.1. Развитие низкомолекулярных миметиков нейротрофина NGF 33
1.4.2. Низкомолекулярные миметики 1 и 4 петель NGF 34
Глава 2. Обсуждение результатов 44
2.1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида 44
2.2. Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли NGF 53
2.2.1. Дизайн 54
2.2.2. Синтез 56
2.2.2.1. Синтез линейных предшественников 56
2.2.2.2. Синтез циклических пептидов 63
2.2.3. Биологическая активность циклических миметиков 4-й петли NGF/л vitro 67
2.3. Дизайн и синтез биологически активных N-ацилдипептидных мономерных и димерных миметиков 4-й и 1-й петель NGF 68
2.3.1. Дизайн 68
2.3.2. Синтез 71
2.3.2.1. Синтез миметиков 4-й петлиNGF 72
2.3.2.2. Синтез миметиков 1-й петли NGF '. 74
2.3.3. Биологическая активность синтезированных миметиков NGF 77
2.3.3.1. Нейропротективные свойства пептидов in vitro 77
2.3.3.2. Влияние пептидов на дифференцировку клеток 79
2.3.3.3. Влияние пептидов на фосфорилирование тирозинкиназы А 81
Глава 3. Экспериментальная часть 84
3.1. Синтез пироглутамилсодержащих дипептидов 89
3.1.1. Синтез пентахлорфенилового эфира -L-пироглутаминовой кислоты и пентахлорфенилового эфира D-пироглутаминовой кислоты 89
3.1.2. Синтез амида -пироглутамил--аспарагина...' 89
3.1.3. Синтез амида -пироглутамил--аспарагиновой кислоты 90
3.1.4. Синтез амида /,-пироглутамил--серина 91
3.1.5. Синтез амида )-пироглутамил-1,-серина 92
3.1.6. Синтез амида -пироглутамил-1)-серина 92
3.1.7. Синтез амида >-пироглутамил->-серина 94
3.1.8. Синтез амида -пироглутамил-^-гистидина 94
3.1.9. Синтез амида -пироглутамил--тирозина 96
3.1.10. Синтез /wpem-бутилового эфира/,-пироглутамил-трет-бутил--аспарагиновой кислоты 97
3.1.11. Синтез /ирет-бутилового эфира /,-пироглутамил-т/?ет-бутил-L-серина 97
3.2. Синтез циклопептидных аналогов фактора роста нервов 97
3.2.1. Получение линейных предшественников H-Gly-Gly-GIy-Asp(OBu')-GIu(OBu')-Lys(Boc)-OH,H-GIy-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-OH) HH-Gly-Asp(OBu)-Glu(OBu)-Lys(Boc)-OH 97
3.2.2. Циклизация пептидов 104
3.2.2.1. cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBuO-Lys(Boc)-) 104
3.2.2.2. cyclo(-Gly-Gly-Asp(OBu')-Glu(OBu')-Lys(Boc)-) 106
3.2.2.3. cyclo(-Gly-Asp(OBuO-Glu(OBu')-Lys(Boc)-) и димер 106
3.2.3. Удаление защитных групп 108
3.2.3.1. cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) 108
3.2.3.2. cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) - 108
3.2.3.3. cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-) 108
3.3. Синтез мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков фактора роста нервов 109
3.3.1. Миметики 4-й петли 109
3.3.1.1. Синтез амида N-моносукцинил-глутамил-лизина 109
3.3.1.2. Синтез гексаметилендиамида бмс-(К-моносукцинил-глутамил-лизина) 110
3.3.1.3. Синтез триметилендиамида бис-(К-моносукцинил-глутамил-лизил-6-аминогексановой кислоты) 111
3.3.1.4. Синтез гексаметилендиамида (пентаметилен, тетраметилен, пропилен, этилен) бмс-(моносукцинил-глутамил-лизина) 118
3.3.2. Миметики 1-й петли 124
3.3.2.1. Синтез амида N-ацетил-лизил-глутаминовой кислоты 124
3.3.2.2. Синтез гексаметилендиамида 5г/с-(К-ацетил-лизил-глутаминовой кислоты) 126
3.3.2.3. Синтез амида 6-аминокапроил-глицил-лизина 129
3.3.2.4. Синтез гексаметилендиамида бмс-(6-аминокапроил-глицил-лизина) 131
Заключение 133
Выводы 134
Приложения 135
Список использованных сокращений 145
Список литературы 148
- Механизм передачи сигнала посредством Trk рецепторов и биологические ответы
- Фармакологические данные NGF при применении его на различных моделях
- Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли NGF
- Синтез триметилендиамида бис-(К-моносукцинил-глутамил-лизил-6-аминогексановой кислоты)
Введение к работе
В настоящее время физиологически активные пептиды рассматриваются как "лекарства будущего". Наряду с богатым спектром фармакологических свойств, этот класс соединений обладает такими важными преимуществами перед непептидными соединениями, как высокая активность, малая токсичность, невыраженность синдрома отмены и, как правило, мягкий модуляторный характер действия. На сегодняшний день имеется всего около 50 пептидных лекарственных препаратов. Использование биологически активных эндогенных пептидов в качестве лекарственных препаратов ограничено их низкой стабильностью в биологических средах и малой способностью проникать через гастро-интестинальный и гемато-энцефалический барьеры (ГЭБ). Чтобы избежать этих недостатков, при создании пептидных лекарственных препаратов используют различные приемы. Для увеличения энзиматической стабильности в структуру пептида часто вводят остатки пролина и глицина, D-аминокислоты или неприродные аминокислотные остатки, модифицируют пептидную связь [Н.Ф.Мясоедов и соавт., 2006, 2007; И.П.Ашмарин и др., 2003, 2005; М.И.Титов и соавт., 1984, 1987; Е.И.Чазов и соавт., 1984; В.И.Дейгин и соавт., 2003]. Наиболее радикальным приемом является создание непептидных пептидомиметиков. Для увеличения способности проникать через ГЭБ повышают липофильность пептида путем введения гидрофобных заместителей. Почти все эти подходы уменьшают описанные выше преимущества пептидных препаратов.
Принципиально другим подходом является использование коротких, преимущественно ди-тетрапептидов. Они, как правило, способны проникать через биологические барьеры как за счет пассивного, так и активного транспорта. Коротким пептидам присуща повышенная энзиматическая стабильность. Всё это позволяет в ряде случаев создавать на их основе перорально активные лекарственные препараты. В связи с важностью коротких физиологически активных пептидов как основы для создания нового поколения лекарственных веществ развитие новых подходов к их поиску представляется актуальным.
Для поиска коротких биологически активных пептидов широко используется определение биологически активных коротких фрагментов более длинных пептидов. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН применяется
оригинальный подход, состоящий в конструировании коротких пептидов -топологических аналогов непептидных психотропных лекарств [Т.А.Гудашева и др., 1985; T.A.Gudasheva et al, 1996, 1998; Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003; Р.У.Островская и др., 2000].
В данной работе развиваются такие подходы, как поиск новых дипептидов, генетически родственных известным активным пептидам, создание циклопептидных конформационных аналогов петлеобразных структур белков и N-ацилдипептидных миметиков (3-поворотных участков полипептидов.
В связи с высоким числом инсультов, сопровождающихся большим процентом смертности, для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний* необходимым является развитие лекарственных препаратов для их лечения, в первую очередь нейропротекторов (для уменьшения очага поражения) и ноотропов (для восстановления нарушенных когнитивных функций). Кроме того, нейропротективные и ноотропные препараты необходимы для лечения других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Арсенал таких лекарственных средств ограничен.
В качестве одного из прямых регуляторов процессов обучения и памяти рассматривается основной метаболит вазопрессина AVP[4-9]. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН было показано, что наименьшим активным фрагментом AVP[4-9] является его N-концевой дипептид амид пироглутамиласпарагина. Получение новых активных аналогов этого дипептида может дать основу для создания новых ноотропных пептидных препаратов.
Важным эндогенным фактором, участвующим в противодействии нейр о дегенеративным заболеваниям, является фактор роста нервов (NGF), на основе которого ряд зарубежных фирм и университетов пытается создать современные нейропротективные средства [F.M.Longo, et al., 1999, 2002, 2003; H.U.Saragovi et al., 2000, 2002, 2004; S.J.Pollack and S.J.Harper, 2002].
Поиск коротких пептидов, обладающих ноотропной и нейропротективной активностью, которые в дальнейшем могли бы стать базой для создания принципиально новых пептидных лекарственных препаратов, является актуальным.
Целью работы является дизайн и синтез новых коротких биологически активных пептидов, перспективных для создания лекарственных препаратов с ноотропной и нейропротективной активностью.
В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:
1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам дипептидного
фрагмента AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и
активностью дипептида;
2. Дизайн и синтез циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих
трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли нейротрофина NGF;
3. Дизайн и синтез мономерных и димерных N-ацилдипептидньіх миметиков 4-й и
1-й петель NGF и изучение связи их структуры и активности.
Механизм передачи сигнала посредством Trk рецепторов и биологические ответы
Предполагают, что все эти участки могут выполнять функцию "узнающих последовательностей" и участвуют в связывании лигандов, то есть для Тгк рецепторов характерна мультиплетность [36].
Выделяют 3 наиболее значимых сайта, которые регулируют связывание и активацию рецептора: домен IgG12 вьшолняет роль основной детерминанты в специфическом связывании с лигандом и последующей активации рецептора (активаторный сайт 1), этим участком рецептор приближен к мембране [37-40], кристаллическая структура TrkA-d5 показала, что каждый рецептор содержит разные остатки внутри этого домена, что играет ключевую роль в специфичности рецепторов [35,39]; домен IgGll ингибирует аутоактивацию (регуляторный, или ингибиторный, сайт) [41]; N-терминальный домен LRM (активаторный сайт 2) также опосредует NGF/TrkA связывание в присутствии р75 рецепторов [39,35]. Определение структуры и роли этих сайтов рецепторов имеет огромное значение для скрининга и характеристики миметиков и далее для обнаружения биологически активных структур [41]. Лиганды, которые связываются с данными сайтами рецепторов, наиболее вероятно, являются функциональными агонистами или антагонистами [39,40]. Например, Trk-активатор может быть или агонистом активирующего сайта 1 (IgC12) или антагонистом регуляторного ингибиторного сайта (IgCll), а Trk-ингибитор может быть или антагонистом IgC12 или агонистом IgCll. Трансмембранный домен однократно пронизывает мембрану клетки [40], состоит из 20-24 аминокислот [39] и представляет собой а-спираль липофильной природы, которая соединяет экстраклеточный и цитоплазматический домены и удерживает белок в липидном бислое [36]. По данным мутагенеза [123] трансмембранный домен играет роль в активации рецептора. Цитоплазматический домен (intracellular domain. ICD) состоит из 250-400 аминокислотных остатков [20]. Киназный домен расположен в центре ICD, состоит из около 250 остатков [21], определяет Тгк активность и вьшолняет эффекторную функцию [31]. Для различных Тгк рецепторов характерна высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей в этом участке [27]. Trk-рецепторы присутствуют в 3-х высоко селективных изоформах, которые кодируются тремя соответствующими trk-генами: ТгкА рецептор кодируется геном trkA, TrkB (trkB), TrkC (trkC). TrkA изоформа предпочтительно связьшает NGF, NT-6 и NT-7; TrkB - BDNF и NT-4/5, a TrkC - NT-3. NT-3 также связывается рецепторами После связывания нейротрофинов с высокоаффинным рецептором он поступает в везикулы и путем ретроградного аксонального транспорта переносится в тело нейрона. Ретроградный аксональный транспорт белков из терминалей в тело клеток представляет собой крайне важный процесс, потому что он позволяет нейронам получать информацию о внешней среде, окружающей нервные терминали, и соответствующим образом реагировать на многочисленные внеклеточные сигналы. Нарушение аксонального транспорта является одной из причин развития нейродегенеративных патологий [44]. Механизм связывания нейротрофиновых факторов с рецепторами включает следующие процессы [21,40]: 1. Связывание лиганда с экстраклеточным доменом (рис. 5,6); 2. Димеризация рецептора и изменение конформации рецептора; 3. Передача сигнала на цитоплазматический домен по трансмембранному домену; N 4. В результате активации цитоплазматического домена путем фосфорилирования С-концевых остатков тирозина образуются участки для связывания белков-субстратов (эффекторных молекул), содержащих SH2-SH3-домены (src homology domain) и лежащих вблизи цитоплазматического домена Тгк рецептора. Таким образом связывание нейротрофинов со своими рецепторами приводит к димеризации рецептора и самофосфорилированию. Далее активированный рецептор инициирует дальнейшую передачу сигнала по каскадному пути с помощью системы вторичных посредников, благодаря которым сигнал достигает ядра клетки. Существуют следующие основные сигнальные каскады передачи информации посредством Trk рецепторов. I. Наиболее важным механизмом регуляции является классический митогенактивируемый протеинкиназный путь, МАРК-путь (mitogen-activated protein kinase pathway) (рис. 7) [19, 45]. МАРК-путь включает следующие этапы: 8Н2-домен СгЬ2-белка (growth-factor-receptor-binding protein) соединяется с фосфорилированными тирозинами; БНЗ-домен связывается с SOS-белком (son of sevenless); Комплекс Ras-Grb2-SOS взаимодействует с Ras-GDP и SOS катализирует замену GDP на GDP, приводящую к активации Ras; Ras-GDP активирует Raf-1, соединяясь с его 1ЧН2-доменом; Активный Raf-1 взаимодействует с С-концом МАР2К-киназы и активирует МАР2К-киназу (MAP kinase kinase или МЕК-киназа, MAP kinase/extracellular signal-regulated kinase); Активированная MAP2K активирует МАР-киназу (МАРК mitogen-activated protein kinase, митоген активированный белок); Активированный MAP фосфорилирует факторы транскрипции, изменяя активность различных генов. МАР-киназа (МАРК) является основным элементом МАР-механизма. Благодаря МАРК-пути реализуется широкий ряд биологических функций, таких как выживаемость клеток, их дифференцировка, рост аксонов, апоптоз [42]. П. Второй важный механизм регуляции - фосфоинозитол-3-киназный путь, PI-3 kinase)/Akt путь (рис. 7) [19]. Регуляция этого пути включает последовательную передачу сигнала через белки-посредники Ras/Gabl/IRSl. Активация фосфоинозитол-3-киназы (Phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3-kinase) способствует росту аксонов и выживаемости нейронов.
Фармакологические данные NGF при применении его на различных моделях
Известно [63], что введение NGF в конъюнктиву глаза крыс положительно влияет на трофику сетчатки глаза и глазного нерва. В данном исследовании было изучено, влияет ли NGF, введенный конъюнктивально, на клетки мозга. Обнаружено, что NGF достигал высокой концентрации через 6 часов после введения. Результаты показали, что NGF, введенный в конюнктиву глаза, вызывал повышенную экспрессию NGF рецепторов и холинацетилтрасферазную иммунореактивность холинергических нейронов переднего мозга. Ученые считают возможным конъюнктивальное применение NGF как альтернативный путь введения в организм для предотвращения дегенерации NGF-рецептивных клеток мозга при таких патологиях, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона [63].
Глаукома изменяет уровень NGF и экспрессию NGF рецепторов в зрительной коре и коленчатом теле таламуса крыс [64]. Крысы с повышенным внутриглазным давлением, вызванным введением гипертонического раствора NaCl в эписклеральную вену, были лечены NGF конъюнктивально. После декапитации ткань мозга крыс была использована для иммуногистохимичекого, биохимического и молекулярного анализа. Было найдено, что при глаукоме изменяется уровень NGF и его рецепторов в зрительной коре мозга, а введение NGF нормализует этот дефицит.
Была изучена [65] регуляция экспрессии NGF при эксайтотоксичности на модели Хантингтона у крыс, вызываемой агонистами глутаматных рецепторов. После введения квинолиновой кислоты в стриатум через 24 часа наблюдалось повышение уровня NGF, которое фиксировалось в течение 7 дней. Более отчетливый нейротрофиновый ответ был на фоне повреждения а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислотой (АМРА), который фиксировался через 6-16 часов после введения токсина. Эти данные подтверждают, что NGF вовлечен в процессы нейрональной пластичности и его дисбаланс лежит в основе поврждения нейронов стриатума при хорее Хантингтона.
Нейропротективный-эффект NGF был показан и в следующих экспериментах [66]. Квинолиновая кислота вводиласьв стриатум крыс линии Вистар однократно в дозе 150пМ. Другая группа животных перед введением токсина получала NGF. Через 7 дней, после декапитации, измеряли уровень оксида азота как маркера стриальной токсичности. У животных, получавших инъекцию NGF уровень оксида азота был значительно ниже как в стриатуме, месте прямого нейротоксического повреждения, так и в коре мозга.
В другом эксперименте [67] в тех же условиях при измерении восстановленного глутатиона, антиоксидантного маркера, в стриатуме и гиппокампе зафиксировали его снижение по сравнению с контрольной группой животных. Изменений в уровне суммарного глутатиона в группе контрольных и опытных животных не наблюдалось, а отношение восстановленного глутатиона к суммарному было выше в группе опытных животных. Кроме того, увеличивалась активность цитохромоксидазы и в стриатуме и в гиппокампе крыс, обработанных токсином, но не было зафиксировано активности этого фермента у особей, получавших NGF. Эти данные подтверждают гипотезу, что свободные радикалы способствуют эксайтотоксическому нейрональному повреждению, a NGF может функционально компенсировать нарушения стриопаллидарного пути.
Сопровождается ли патология при амиотрофическом боковом склерозе изменением уровня нейротрофинов? Для ответа на этот вопрос была исследована экспрессия 4-х разных нейротрофинов: NGF, BDNF, NT-3 и NT-4/5 - в мышечной ткани бицепса у 15 пациентов с хроническим амиотрофическим боковым склерозом посмертно [68]. Был повышен и уровень мРНК и всех 4-х нейротрофических факторов, в частности уровень NGF пропорционально повышался в зависимости от стадии заболевания и был максимально высоким на поздних стадиях. На основании этих данных был сделан, вывод о том, что нейротрофины поддерживают регенерацию и выживаемость дегенерирующих мотонейронов.
Пероксинитриты, образующиеся при амиотрофическом латеральном склерозе, также как и при других нейропатологических состояниях, стимулируют экспрессию NGF в астроцитах спинного мозга. Принимая во внимание этот факт, можно предположить, что экспрессия NGF находится под контролем оксидативного стресса [69].
Таким образом, эксперименты» на животных показали, что NGF может защитить погибающие нейроны во взрослом мозге т может способствовать пролиферации и более эффективной работе оставшихся клеток. Стало очевидным, что данные результаты открывают возможность лечения патологий, связанных с потерей нейронов, в первую очередь болезни Альцгеймера.
Современные методы лечения болезни Альцгеймера носят симптоматический характер. В соответствии с холинергической гипотезой патогенеза болезни Альцгеймера [70] дегенерация холинергических нейронов и снижение уровня ацетилхолина в головном мозге ответственны за развитие клинических проявлений заболевания - нарушений памяти и высших корковых функций. Поэтому основные усилия в разработке стратегий лечения болезни Альцгеймера направлены на компенсацию холинергической недостаточности. Наиболее эффективным методом такой компенсаторной терапии признается применение ингибиторов ацетилхолинэстеразы, предотвращающих разрушение ацетилхолина. Однако частота побочных периферических эффектов, даже при использовании нового поколения холинэстеразныхпрепаратов (донепезил, ривастигминигалантамин), не позволяет достичь необходимых терапевтических дозировок этих препаратов и ограничивает возможность их применения. Кроме того, существующие препараты не приводят к достаточной холинергической компенсации, так как ингибиторы компенсируют потери холинергической функции, в то время как уровень холинергических нейронов остается неизменным.
Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент Р-изгиба 4-й петли NGF
Была проведена 2 фаза открытых клинических испытаний NGF как терапия сенсорной нейропатии при ВИЧ-инфекции [83]. Сенсорная нейропатия встречается в 30% случаев как осложнение при СПИДе. Также нейропатия может быть осложнением противовирусной терапии при лечении СПИДа и ее коррекция часто неэффективна. В экспериментальной группе участвовало 270 пациентов с ВИЧ-инфекцией, которым вводили рекомбинантный NGF в дозе 0,1 или 0,3 мкг/кг 2"раза в неделю субкутанно в течение 18 недель. Субъективно отмечалось уменьшение выраженности болевого синдрома. NGF в обеих дозах приводил к значительному улучшению самочувствия. Кроме того, на фоне приема NGF анальгетическая терапия была более эффективной. Существенным недостатком данной-антинейропатической терапии» была сильная боль в месте введения у 39% пациентов. Быстропроходящая мышечная- боль встречалась у 8 пациентов при введении 0,3 мкг/кг препарата. Изменений в уровне мРНК ВИЧ зафиксировано не было. Таким образом, рекомбинантный, NGF уменьшал болевой синдром и чувствительность нервных окончаний при ВИЧ-осложненной сенсорной нейропатии, хорошо переносился больными, однако, боль в месте введения-препарата была весьма значительной
При проведении 2 фазы клинических испытаний [84], в открытом исследовании в течение 48 недель не было отмечено общего улучшения в состоянии больных, хотя болевые симптомы значительно уменьшились. В этом эксперименте рекомбинантный NGF вводился 200 пациентам в дозе 0,1 или 0,3 мкг/кг 2 раза в неделю субкутанно. Препарат показал свою толерантность и хорошо переносился больными.
Эффективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний с помощью лекарственных средств, разрешенных к применению, на сегодняшний день не существует. Терапевтическое использование NGF ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью к проникновению через гематоэнцефалический барьер, возможностью иммунной реакции. NGF обладает побочными эффектами, такими как болевой синдром и потеря веса. Кроме того, рекомбинантные препараты»соответствующих природных аналогов являются экономически невыгодными для медицинского применения вследствие высоких затрат на их производство. Поэтому актуальным является развитие препаратов на основе низкомолекулярных миметиков NGF, свободных от этих недостатков.
Развитие низкомолекулярных миметиков нейротрофина NGF Создание соединений с физико-химическими свойствами, отличными от нейротрофинов, но способных селективно взаимодействовать с нейротрофиновыми рецепторами рассматривается как важное направление получения препаратов для лечения нейр о дегенеративных заболеваний [19,39,40].
В настоящее время поиск маленьких молекул, обладающих активностью NGF, базируется на создании фармакофорных моделей определенных участков этой белковой молекулы [87-90]. Имеющиеся кристаллографические данные [91-94], сайт-направленный мутагенез [96-98] и результаты химических модификаций аминокислотных остатков [99] позволили сделать предположение, что существуют ключевые участки, которые являются наиболее значимыми для реализации биологической активности. Это петля 1 (остатки 29-35), петля 2 (остатки 40-49) и петля 4 (остатки 91-97). Предполагают [100], что в связывании с рецептором,участвуют также С-конец (остатки 111-115) [101] HN-КОНЄЦ (остатки 1-8) [102].
Функционально значимые участки могут служить в качестве пространственных моделей для получения миметиков полипептидов. Как оказалось, регионы, участвующие в лиганд-рецепторном взаимодействии, расположены в области р-изгибов петель [20,21,103,104].
Мутагенез и анализ биологических характеристик молекулы NGF показал, что остатки 4 петли NGF, Lys9 и Gin96 и, возможно, Glu94, играют важную роль в связывании с рецептором и его активации [105].
Предполагают, что миметики, созданные на основе структуры этих участков, будут иметь селективное действие, конкурентный антагонизм или частичный агонизм [106-108].
Другое преимущество имитации р-изгибов в белках заключается в том, что их остатки, как правило, экспонированы в растворитель и, таким образом, полученные миметики также могут иметь гидрофильные свойства, что важно для будущего развития терапевтических кандидатов [109,110].
Существуют данные, что нейротрофины взаимодействуют со своими рецепторами в гомодимерной форме [21,111]. Было определено расстояние между протомерами молекулы NGF и найдена подходящая длина спейсера для создания димерных пептидных аналогов. Так, расстояние между поворотными регионами каждого протомера в димере должно быть таким, чтобы одна петля была относительно закрыта (например, Asn45 - Asn45 = 5,28А), а другая петля была отдалена (например, Ala97 - Glu35 = 36Д5А0; Ala97 - Ala97 = 25,45A) [19]. Ожидается, что димерные формы низкомолекулярных антагонистов будут действовать как частичные агонисты.
В лабораториях Н. Uri Saragovi (Department of Pharmacology and Therapeutics and McGiLL Cancer Centre, McGill University, Montreal, Canada) в 1995 году исследовали [112,113] роль Р-поворотных участков NGF. Предположили, что циклические аналоги, которые сохраняют и имитируют трехмерную структуру р-поворотных участков, могут связываться с NGF рецепторами. Также было высказано предположение, что линейные последовательности из аналогичных аминокислотных остатков не будут принимать конфигурацию, совпадающую с трехмерной структурой соответствующего сайта лиганда. Были определены первичные структуры 4-х участков NGF мыши, которые отличаются от первичной структуры других нейротрофинов, и на их основе сконструированы и синтезированы соответствующие низкомолекулярные производные (ММ 1500) -мономерные циклические и линейные пептиды, а в качестве контроля синтезировали рандомизированные пептиды. Циклическая структура была стабилизирована дисульфидной связью.
Синтез триметилендиамида бис-(К-моносукцинил-глутамил-лизил-6-аминогексановой кислоты)
Фактор роста нервов (NGF) относится к семейству нейротрофинов, взаимодействует с рецепторами TrkA и р75, участвует в дифференцировке нейронов, усиливает рост дендритов и увеличивает выживаемость определенных видов нейронов в центральной и в периферической нервных системах [138]. Многочисленные данные указывают на то, что вещества с активностью NGF могут быть полезны в лечении ряда нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезни Альцгеймера, Паркинсона; хорея Хантингтона, амиотрофический латеральный склероз, периферическая . диабетическая нейропатия, инсульты, опухоль нейроэктодермы и др. [139,140]. Терапевтическое использование NGF ограничивается его нестабильностью в биологических жидкостях, плохой способностью к проникновению через гематоэнцефалический барьер, возможностью иммунной реакции. Кроме того, такие соединения являются экономически невыгодными для медицинского применения вследствие высоких затрат на их производство. Несмотря на это, NGF продвигался в качестве лекарственного препарата для лечения болезни Альцгеймера и нейропатий, вызванных диабетом и СПИДом, но был снят с клинических исследований из-за тяжелых побочных эффектов [141].
NGF представляет собой белок, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей по 118 аминокислотных остатков каждая (рис. 22). Кристаллографические исследования [142,143] показьгеают, что каждый протомер NGF имеет семь Р-тяжей, образующих три антипараллельные пары. При этом р тяжи связаны 3-мя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями 1 (остатки 28-36), 2 ( остатки 43-49) и 4 (остатки 91-98), а также серией из 3-х последовательных изгибов, или 3-й петлей (остатки 59-66). .
На первом этапе в ходе данной работы нашей задачей ЯВЛЯЛОСЬ синтезировать циклопептидные аналоги NGF, содержащие только 3 аминокислотных остатка из последовательности 4-й петли для выяснения его наиболее короткого активного фрагмента.
В качестве объекта моделирования был выбран [3-изгиб 4-й петли NGF, образованный остатками 93-96: -Asp-Glu-Lys-Gln-. Пептидные аналоги этой петли обладают большим сродством к ТгкА-рецептору по сравнению с аналогами других петель [112]. Этот участок наиболее экспонирован наружу, что делает его предположительно более доступным для взаимодействия с рецептором. Молекулярное моделирование с использованием программы HyperChem показало, что конформация 3-изгиба 4-й петли подобна конформации 4-членного модельного циклопептида cyclo(-Asp-Glu-Lys-Gly-) (рис. 23).
ДЛЯ расчета равновесной конформации тетрапептида применяли программу HyperChem 5,1-Рго (Hypercube Inc., Канада). Пространственная структура фрагмента Asp-Glu-Lys-Gln, соответствующего [3-поворотному участку 4 петли, была скопирована из файла NGF (lbtg), взятого из Брукхавенской базы данных [http://www.rcsb.org/pdb]. Затем его С- и N-концевые остатки были соединены трансоидной пептидной связью, а остаток глутамина заменен на остаток глицина. После оптимизации геометрии полученного циклотетрапептида по методу Polak-Ribiere [146] в вакууме (с условиями окончания оптимизации при отклонении градиента энергии от среднего значения в 0,1 ккал/моль) он был подвергнут симуляции методом молекулярной динамики в вакууме при ЗООК в течение 2 пс с шагом 0,01 пс 10 раз. При этом рассчитанные полная и потенциальная энергии молекулы тетрапептида оставались неизменными в течение последней фемтосекунды симуляции и равными 148,2 ±5,1 ккал/моль и 30,5 ±4,1 ккал/моль соответственно. Затем было проведено наложение исходной и оптимизированной структур циклотетрапептида по четырем а-углеродным атомам с помощью опции "RMS fit and Overlay" и было рассчитано среднеквадратичное отклонение их координат, оказавшееся равным 0,65 А.
В состав 4-членного циклопептида были включены аминокислотные остатки, относящиеся к. центральному дипептидному фрагменту Р-изгиба, и предшествуюпгий ему остаток аспарагиновой кислоты - для того, чтобы выяснить их роль в активности NGF. В качестве четвертого остатка вместо Gin96 (для исключения влияния его бокового радикала; поскольку значение этого остатка для активности NGF известно [144], и для упрощения структуры) мы взяли глицин: Циклопептиды более устойчивы к- протеолизу, чем линейные пептиды, так как не распознаются экзопептидазами. Отсутствие заряженных концевых групп облегчает, их транспорт через клеточные мембраны и приводит к лучшему биоаккумулированию. Эти свойства дают значительные преимущества» циклопептидам с точки зрения терапевтического применения по сравнению- с соответствующими линейными аналогами.
Для более детального изучения влияния конформации-пептида на активность мы синтезировали еще два. циклопептида-гомолога, содержащие ту же самую последовательность Asp-Glu-Lys и, соответственно, два и три остатка Gly.
