Введение к работе
Актуальность проблемы. Понимание преимуществ и эффективности проведения твердофазного синтеза пептидов в проточном режиме, когда реагенты непрерывно циркулируют через плотный слой пептнднлполимера, пришло в конце 1970-х годов Однако первые попытки прямой реализации этого подхода принесли скорее разочарование и поставили вопрос о принципиальной совместимости гелевых полимеров, объем набухания которых подвержен значительным колебаниям, и обычных реакторов колоночного типа, объем которых жестко фиксирован Как следствие, в реакторе возникают пустоты или неприемлемо высокое давление в потоке (70 атм и выше) из-за спрессовывания набухающего полимера, что, в совокупности, уничтожает все преимущества проточного режима Актуальность радикального решения этой проблемы, в котором бы учитывалась природа гелевых полимеров, многократно возросла с бурным развитием твердофазной комбинаторной химии, однако все частные ее решения, предлагавшиеся нашими коллегами, носят компромиссный характер и имеют одну общую черту они основаны на маскировании или подавлении гелевоп природы полимерного реагента с целью улучшить его совместимость со стандартным проточным реактором
Другая проблема современного твердофазного синтеза пептидов, с которой связана эта работа, -это отсутствие универсальных непнвазивмых методов мониторинга, способных распознавать трудные участки сборки полипептпдной цепи в реальном времени и независимо от используемой химической методологии От доступности таких методов, дающих основу для своевременной корректировки и оптимизации процесса, серьезным образом зависит надежность и результат автоматического твердофазного синтеза. Важнейшие достижения в этой области демонстрируют синтезаторы MilhGen 9050+, ABI 432А, ABI 433А, в которых реализовано управление с обратной связью в сочетании со спектрофотометрическим и/или кондуктометрическим мониторингом, однако область применимости обоих методов ограничена Fmoc-химией На этом фоне более экономичная и лучше развитая Вос-методологня оказывается в невыгодном положении, что определяет высокую актуальность разработки Вос-совместпмых методов мониторинга вообще и неинвазпвных автоматизируемых подходов, в особенности
Цель работы. Создание проточного реактора, рабочий объем которого автоматически приводится в соответствие изменяющемуся объему набухания полимерного реагента, использование динамических свойств такого реактора для ведения непрерывной регистрации объема пепти-дилполимера в ходе твердофазного синтеза, детальное изучение фундаментальных аспектов и практического потенциала нового метода мониторинга
Научная новизна н практическая ценность рабо їм. В качестве радикального решения упомянутой выше проблемы совместимости предложен проточный реактор оригинальной конст-
L. ,
V'
2 рукции, рабочий объем которого автоматически подстраивается при изменении объема набухания пептидилполимера Оснащение такого реактора датчиком, преобразующим эти изменения в электрический сигнал, привело к созданию свелчографа, ставшего инструментальной основой свеллографического метода мониторинга твердофазного синтеза Для прояснения возможных путей использования нового метода мониторинга и границ его применимости были экспериментально изучены общие закономерности изменения объема пептидилполимера в ходе наращивания цепи, а также на уровне индивидуальных химических превращений в реальном времени Предложена физико-химическая интерпретация величины изменения объема набухания полимерного реагента, участвующего в химической реакции, и экспериментально продемонстрированы специфические вклады в наблюдаемую величину.
В самом общем смысле свеллографический метод может быть классифицирован как высокопроизводительный и экономичный инструментальный метод исследования набухания гранулированных поперечно-сшитых гелевых полимеров, открывающий такие новые возможности, как прямое наблюдение кинетики или динамики набухания в реальном времени и быстрая оценка сольватационных требований полимерного реагента путем регистрации «спектра набухаемо-сти» образца в широком наборе растворителей
В рамках твердофазного синтеза пептидов предложенный метод является первым и единственным универсальным неинвазивным методом мониторинга, область применения которого не имеет принципиальных ограничений Использование метода позволяет документировать каждую операцию процесса и существенно (по крайней мере вдвое) снизить расход растворителей относительно общепринятых стандартов Прямое установление момента окончания химической реакции по стабилизации сигнала свеллографа, равно как и кинетическая интерпретация кривой мониторинга, в общем случае не представляются возможными, но следует иметь в виду, что аналогичные ограничения имеют все известные неинвазивные/непрерывные методы. В то же время свеллографический подход имеет следующие серьёзные преимущества как инструмент детектирования агрегации полипептидных цепей, которая остается наиболее серьезной проблемой современного твердофазного синтеза
Особенностью предлагаемого метода является его высокая чувствительность именно к коллапсу пептидилполимера, который считается общим первичным проявлением агрегации на макроскопическом уровне Как следствие, подход с одинаковым успехом работает в рамках Fmoc- и Вое-методологии, а также сохраняет адекватность и в сочетании с любой другой защитной группой
Свеллографический метод обнаруживает признаки агрегации непосредственно на стадии конденсации и/или последующих контрольных промывок, когда еще можно внести коррективы в
з ход синтеза, тогда как епектрофотометрический и кондуктометрнческий методы распознают агрегацию с запаздыванием на один-два синтетических цикла и лишь на стадии Fmoc-деблокировання, когда возможность повторить проблемную конденсацию уже упущена.
Детектирование первых признаков агрегации проводится путем простого сравнения уровней аналогового сигнала свеллографа в двух или трех контрольных состояниях полимера, после чего целесообразно перейти к более строгим количественным критериям, которые ориентированы на компьютеризацию процесса и использование в автоматическом синтезаторе
Начиная с 1990 г в лаборатории химии пептидов Филиала ИБХ с применением свеллографиче-ского метода синтезировано несколько сотен пептидов средней длины, а также два крупных полипептнда длиной 54 и 87 аминокислотных остатков В 1996 г свеллографы были апробированы в Институте органической химии Тюбингенского университета и на фирме Rapp Polymers (Германия), где была продемонстрирована полная совместимость свеллографа с синтезатором фирмы Millipore MilliGen 9050.
Отдельные этапы работы были проведены при финансовой поддержке программы «Новейшие методы биоинженерии», номер государственной регистрации темы 01 8 80064726 и фонда Фольксваген
Личный вклад автора Концепция «умного» проточного реактора и изготовление простейшей полностью функциональной модели (рис 1), предложение использовать переменный резистор для осуществления свеллографического мониторинга и непосредственное координирование работы по совершенствованию конструкции базовой модели свеллографа и ее предельному упрощению Непосредственное участие в ключевых экспериментах по изучению фундаментальных физико-химических аспектов свеллографического метода и руководство работами по внедрению метода в повседневную практику лаборатории Детальная разработка проекта по исследованию агрегации Выработка подходов к анализу экспериментальных данных и их теоретической интерпретации
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 21 Европейском пептидном симпозиуме (Платха де Аро, Испания, 1990), 2-м и 3-м Международных симпозиумах "Нововведения и перспективы твердофазного синтеза" (Кентербери, 1991, Оксфорд, 1993), 2-м Международном японском симпозиуме по химии пептидов (Шизуока, 1992), 9-м и 10-м Российско-Германских пептидных симпозиумах (Пущино, 1994, Фридрихрода, 2003), 16-м Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), 18-м Американском пептидном симпозиуме (Бостон, 2003)
4 Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и списка литературы Диссертация изложена на 156 страницах, содержит 46 рисунков и 5 таблиц Список цитируемой литературы включает 214 ссылок Обзор литературы посвящен проблемам контролирования и мониторинга твердофазного синтеза пептидов
