Введение к работе
Актуальность темы. Среди пептидов и белков, обнаруженных в природе, соединения, содержащие цистеин, составляют особую группу. Днсульфндные мостики, образованные остатками цнетеина, играют важную роль в стабилизации вторичной и третичной структур белковых и пептидных молекул, обеспечивают их фиксированную пространственную ориентацию, придавая тем самым уникальную форму, необходимую для осуществления биологических функций.
В настоящее время известны многие ннзкомолекулярные пептиды, содержащие в своей структуре I, 2 и более дисульфидных мостиков, принимающие участие в регуляции физиологических процессов организма. Синтетические пептиды, в том числе и содержащие SS-свЯзи, получили широкое применение во многих областях т.тедтщтппл и фармакологии. Многие из них используются для профшактикп, диагностики и лечения различных заболевании. В связи с этим чрезвычайно важна разработка методов, позволяющих получать такие соединения в препаративных количествах. В современной пептидной химии существует целый ряд способов синтеза соединений, содержащих 1, 2 и более SS-связей, но ни один из них не является универсальным. Циклизация зачастую проходит неоднозначно. Кроме внутримолекулярных, образуются межмолекулярные дисульфидные связи, в реакцию окисления вступают не только SH-группы, но и функциональные группы боковых цепей. Часто констатируют факт получения побочных продуктов, однако, информации об их структуре недостаточно. Поэтому исследования в этой области являются актуальными и могут представлять практический интерес.
Работа выполнена в рамках Федеральной научно-технической программы на 1996 - 2000 годы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения". Код приоритетных направлений 0.1 и 0.5, код направлений в составе подпрограмм: 0.6 (СПИД), 0.8 (технология синтетических пептидных препаратов). Исследования поддержаны грантом РФФИ № 96-04-49421.
Цель работы. Диссертационная работа посвящена исследованию в области синтеза ряда природных пептидов, содержащих в своей структуре 1 или 2 дисульфидные связи, таких, как гормона окситоцина, фрагментов нммуноломинзптиого зпитопа трансмембранного гликопротеина gp41 ВИЧ, атриальных и оазоконстрикторпых пептидов.
Положения, выносимые на зашиту.
-
Синтез и очистка линейных форм выбранных цистеинсо держащих пептидов.
-
Сравнительная оценка эффективности замыкания SS-мостиков следующими реагентами:
а) йодом в кислых и нейтральных условиях, изучение структуры побочных
продуктов;
б) кислородом воздуха;
в) феррицианидом калия;
г) перекисью водорода.
3) Изучение возможности применения перекиси водорода для:
а) создания SS-связей в природных физиологически активных пептидах
различной длины и структуры;
б) синтеза препаративных количеств окситоцина;
в) получения пептидов с двумя дисульфидиыми поетиками эндотелииа-1 и
эндотелина-3; на примере зндотелнна-1 изучить возможность применения Н2О2
для циклизации пептидов, содержащих ыетионин.
Научная новизна. Впервые на примере синтеза пептида последовательности 593-603 белка gp41 ВИЧ-2 проведена сравнительная оценка применения некоторых известных реагентов (йода, кислорода воздуха, феррицианида калия, перекиси водорода) для замыкания внутримолекулярных дисульфидных связей. Показано преимущество применения перекиси водорода. На основании этих данных разработан способ, позволяющий просто, быстро и с высоким виходом проводить циклизацию в физиологически активных пептидах, содержащих чувствительные к окислению аминокислоты: триптофан, мгтиошш, а также а пептидах, содержащих по два дисульфидных мостика. На примере триптофансодержащего пептида 593-603 gp41 ВИЧ-2 исследован процесс прямого превращения S-ацетамидометилзащищешюго (Аст) производного в соответствующий дисульфид при помощи йода. Выделены и идентифицированы новые побочные продукты. П сказано, что при синтезе этого пептида конденсация фрагмента с С-копцевым незамещенным аргинином в растворе кврбодкнмидаым методом с добавками'N-гндроксибензотрйазолз (DCC/HOBT) а присутствии бромгздрата пиридина (НВг-Ру) протекает без рацемизации.
Практнчестсая ценность работы. Оптимизирована схема синтеза в^растворе пептидного антигена ВИЧ-2, Соответствующего последовательности 593-603 белка
gp41. Применение перекиси водорода на стадии создания SS-связей позволило получать с выходом 50 - 90% препаративные количества (0.5 - 1.2 г) пептидов из последовательности нммуноломмнантного эпнтопа глнкопротешш gp41 различных штаммов ВИЧ, которые входят в- состав отечественных диагностических наборов "Псптоскрин" и "Эпитоп", применяемых в настоящее время в практическом здравоохранении. Разработанная методика применена для получения медицинского и ветеринарного окентоцина в укрупненном масштабе (до 20 г). Полученные в работе вазоконстрикторные пептиды - эндотелины-1 и -3, нашли применение в совместных работах с кафедрой фитологии МГУ им. М. В. Ломоносова (рукооодшель академик И. П. Ашмарин) по изучению их влияния на гемодинамику.
Anyofiawn работы. Результаты работы докладывались на И Турецко -Узбекском Симпозиуме по химии природных соединений (Эскешехир, 1996 г.), на межлабораторном семинаре НИИ эксиернменальной кардиологии РКНПК (1997 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на у^-^страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, посвященного особенностям синтеза циклических гггеродстпых цистеинсодержащих пептидов, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего / -> у наименований). Работа содержит /^таблиц, ' ''схем, ' /рисунков.
