Введение к работе
Актуальность проблемы. РНК - важнейший участник большинства
биохимических процессов, происходящих как внутри клетки, так и во
внеклеточном пространстве. Разработка методов направленного
воздействия на РНК открывает возможность регулировать различные
клеточные процессы, в том числе экспрессию генов, передачу
внутриклеточных сигналов и инактивировать геномы РНК-содержащих
вирусов. Создание высокоэффективных катализаторов искусственного
происхождения является актуальной задачей биоорганической химии
на протяжении уже нескольких десятилетий. В последние годы в
нашем институте и других лабораториях мира было получено большое
число низкомолекулярных соединений, способных расщеплять РНК в
физиологических условиях. Однако, на настоящий момент не найден
алгоритм получения эффективных катализаторов расщепления
фосфодиэфирных связей, а существующие эффективные химические
рибонуклеазы найдены, преимущественно, путём скрининга
разнообразных соединений. Более того, роль РНК, как второго
участника реакции расщепления фосфодиэфирной связи, на
настоящий момент, изучена не полностью. Исследования
чувствительности различных фосфодиэфирных связей к расщеплению
велись по двум основным направлениям: изучение влияния
пространственной структуры РНК на устойчивость к гидролизу
определённых фосфодиэфирных связей и влияние
последовательности или контекста, в котором расположена фосфодиэфирная связь, на её стабильность.
На данный момент систематизировать и сравнить имеющиеся данные разных исследователей по расщеплению РНК не представляется возможным, поскольку они получены на разных моделях и в разных условиях, однако актуальность такого анализа несомненна особенно ввиду перспективы их использования в качестве новых лекарственных препаратов. Для такой систематизации необходим анализ различных экспериментальных данных по изменению свойств фосфодиэфирной связи РНК в зависимости от её структуры и последовательности, в которой расположена эта связь и, с другой стороны, анализ структуры и активности искусственных рибонуклеаз.
Целью настоящей работы являлось изучение факторов определяющих эффективность расщепления фосфодиэфирных связей РНК искусственными рибонуклеазами: влияние последовательности и пространственной структуры РНК и структуры и состава искусственных рибонуклеаз.
В рамках заявленной цели решались следующие задачи: 1. Определить функции и оптимальное строение, а так же вклад в
рибонуклеазную активность доменов химических рибонуклеаз -
конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазолсодержащей
группы; 2. Изучить рибонуклеазную активность новых
пептидоподобных соединений; 3. Изучить влияние
последовательности РНК на эффективность протекания реакции трансэтерификации под действием химической рибонуклеазы AB1L3C3 и конъюгата антисмыслового олигонуклеотида и РНК расщепляющей группы.
Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы проведено систематическое исследование функциональной роли элементов структуры (доменов) искусственных рибонуклеаз, конъюгатов 1,4-диазабицикло[2.2.2]октана и имидазолсодержащей конструкции. Определено оптимальное строение РНК-связывающего домена. Показано, что остаток имидазола в значительной степени определяет рибонуклеазные свойства искусственных рибонуклеаз посредством кислотно-основного катализа.
Проведено исследование новых искусственных рибонуклеаз, сконструированных на основе пептидоподобных и гидрофобных фрагментов и формирующих ряд серий соединений, отличающихся по составу и строению. Показано, что соединения, содержащие пару остатков аминокислот Lys...Glu, в целом проявляют значительно большую активность, чем соединения с другими исследованными комбинациями.
Впервые изучено влияние однонуклеотидных замен на чувствительность фосфодиэфирных связей в линейных и структурированных РНК с гомологичными последовательностями к расщеплению искусственной рибонуклеазой. Показано, что однонуклеотидная замена существенным образом меняет чувствительность к расщеплению как близкорасположенных связей, так и связей, расположенных на расстоянии 6-8 нуклеотидов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы представлены на международных конференциях: "RNA as a therapeutic and genomics target" (Новосибирск, 2001), "Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference" (Новосибирск, 2003), "20th International tRNA Workshop" (Germany, 2003), "29 th FEBS congress" (Poland, 2004), "Chemical & Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, 2004), "7th International Meeting on Ribonucleases" (Slovak Republic, 2005), "1st International Symposium on Biomoleclules and Related compounds" (France, 2005), "International Conference on Chemical Biology (Новосибирск, 2005), "Physical-chemical biology" (Новосибирск, 2006).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их
обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 59 рисунков и 8 таблиц. Библиография включает 277 литературных источников.
