Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Биологически активные соединения морских факультативных актинобактерий 10
2.1.1. Макролиды, макролактамы и лактон-содержащие соединения
2.1.2. Соединения хиноидной природы 21
2.1.3. Депсипептиды и дикетопиперазины 29
2.1.4. Алкалоиды 32
2.1.5. yff-Лактамные антибиотики 34
2.1.6. Другие биоактивные соединения 36
2.2. Биологически активные соединения морских бактерий рода Pseudoalteromonas 42
2.2.1 Антибиотические соединения из морских псевдоальтеромонад 42
3. Обсуждение результатов.
3.1. Скрининг биологически активных соединений в морских актинобактериях 47
3.2. Биологически активные соединения из актинобактерий Streptomyces sp. КММ 7210 50
3.3. Биологически активные соединения из актинобактерий Streptomyces sp. GW 33/1539 55
3.4. 2,3-ДИметокси-5-метил-6-нонапренил-1,4-бензохинониз Nocardia sp. КММ 3749
3.5. Фейгризолиды А, В» С и динактин из Streptomyces sp. В 6167 67
3.6. Макролидные антибиотики из Streptomyces sp. Mei 22 76
Бромальтерохромиды А и А1 из Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636 83
Экспериментальная часть 89
Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. КММ 7210. и выделение цикло-(глицил-Ь-тирозила) 89
Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. GW 33/1539 и выделение биологически активных соединений 91
Культивирование актинобактерии Nocardia sp. КММ 3749 и выделение убихинона Q9 93
Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. В 6167 и выделение фейгризолидов А, В, С и динактина 94
Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. Mei 22. и выделение макролидных антибиотиков 96
Культивирование бактерии Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636 и выделение бромальтерохромидов А и А1 97
Выводы 100
Список цитируемой литературы
- Макролиды, макролактамы и лактон-содержащие соединения
- Биологически активные соединения морских бактерий рода Pseudoalteromonas
- Биологически активные соединения из актинобактерий Streptomyces sp. GW 33/1539
- Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. GW 33/1539 и выделение биологически активных соединений
Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние двадцать лет были насыщены интересными открытиями в одном из молодых направлений биоорганической химии, а именно, в химии морских природных соединений. Эти открытия связаны с выделением из морских микро- и макроорганизмов необычных соединений новых структурных типов с разнообразными биохимическими и фармакологическими свойствами [1-7]. Океан является самым большим резервуаром микробиоты, к настоящему времени еще мало изученной. Надежды на обнаружение в морских экосистемах продуцентов новых биологически активных соединений стимулировали биохимические и химические исследования морских микроорганизмов [8]. Результатом этого явилось открытие в морских микроорганизмах необычных по химической структуре и биологическому действию метаболитов, многие из которых не имеют структурных аналогов среди биологически активных соединений, выделенных из наземных источников.
Некоторые морские организмы представляют собой сложные симбиотические комплексы [9-12]. Содержание симбионтных микроорганизмов в них может быть так велико, что суммарных вес этих бактерий и микроводорослей может значительно превышать вес самих макроорганизмов. В связи с этим существуют трудности при установлении истинного продуцента биологически активных веществ. Значительно возрос интерес к данному вопросу после того, как было установлено, что широко известные морские токсины тетродотоксин и сакситоксин не являются продуктами биосинтеза токсичных видов рыб и динофлагелят, соответственно, а продуцируются микроорганизмами, ассоциированными с этими макроорганизмами. Это означало, что при необходимости получения подобных соединений можно отказаться от заготовок больших количеств морского биологического сырья, а использовать микроорганизмы.
Химия морских микроорганизмов интенсивно развивается на протяжении последних лет. На диаграмме 1 [13] показано, что количество выделенных
соединении из морских микроорганизмов возросло в несколько раз за два десятилетия.
Химия морских микроорганизмов явиляется основой развития морской биотехнологии и морской химической экологии, вносящих значительный вклад в понимание экологической роли метаболитов морских микроорганизмов.
600 500 400: 300
« ;
Диаграмма 1.
Число метаболитов морских микроорганизмов, выделенных за период
1966-2004 годы.
Согласно анализу литературных данных, морские микроорганизмы являются новыми перспективными источниками биологически активных соединений [14]. Морские микроорганизмы выделяют из различных субстратов - морской воды, донных осадков, из морских беспозвоночных и рыб, водорослей и морских трав [15, 16].
Основное внимание в процессе работы было уделено изучению биосинтетических возможностей морских бактерий. В обзоре литературы, который охватывает литературные источники периода с 1966 по 2006 годы, приведены данные по характеристике метаболитов актинобактерий и бактерий рода Pseudoalteromonas, которые явились основными объектами наших исследований.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение и установление строения биологически активных вторичных метаболитов из морских актинобактерий родов Streptomyces и Nocardia и морской бактерии рода Pseudoalteromonas.
Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1) проведен скрининг и выбраны объекты исследования; 2) получены суммарные экстракты из культур бактерий; 3) разработаны схемы выделения активных веществ; 4) осуществлено разделение полученных экстрактов и выделение индивидуальных природных соединений; 5) проведен анализ ЯМР-спектроскопических и масс-спектрометрических данных для выделенных соединений и установлены структуры этих соединений; 6) изучена биологическая активность веществ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Литературный обзор, приведенный в диссертации, является новым справочным материалом по характеристике метаболитов актинобактерий и псевдоальтеромонад, полученных до настоящего времени. В ходе выполнения диссертации структурно идентифицированы 10 метаболитов актинобактерий. Для некоторых соединений были впервые получены данные двумерной ЯМР-спектроскопии и сделаны полные отнесения сигналов протонов и углеродных атомов. Используя данные матрично активированной лазерной десорбции/ ионизации масс-спектрометрии (МАЛДИМС), исследована зависимость продукции циклических депсипептидов, метаболитов Pseudoalteromonas maricaloris КММ 636 от присутствия в среде культивирования органических веществ и минеральных солей. Впервые среди морских актинобактерий обнаружены продуценты антибиотиков - фейгризолидов и бафиломицинов. Получены новые данные по цитотоксической активности выделенных соединений с использованием в качестве биологических моделей мышиных эритроцитов, опухолевых клеток карциномы Эрлиха, спермиев, яйцеклеток и развивающихся эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius. Впервые показано, что
макролидный антибиотик фейгризолид В индуцирует апоптоз в опухолевых клетках.
Публикации результатов исследования. Основные результаты данной работы опубликованы в таких журналах как "Известия Академии наук. Серия химическая", "Химия природных соединений" и "Letters in Applied Microbiology". Материалы работы также были представлены на одиннадцатом Международном симпозиуме по морским природным соединениям в 2004 году в Сорренто (Италия), на двадцать четвертой Конференции по биоразнообразию и природным продуктам в 2004 году в Нью-Дели (Индия), на первом Международном конгрессе по биотехнологии в 2002 году в Москве (Россия) и на двадцать третьем Международном симпозиуме по химии природных продуктов в 2002 году во Флоренции (Италия). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного вторичным метаболитам морских актинобактерий и бактерий рода Pseudoalteromonas, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 135 цитируемых работ. Работа изложена на 114 страницах, содержит 16 таблиц, 5 схем, 14 рисунков и 3 диаграммы.
Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.х.н. Кузнецовой Т. А., а также к.х.н. Денисенко В. А. за помощь в интерпретации спектральных данных, к.б.н. Шевченко Л. С. за культивирование микроорганизмов и тестирование биологической активности соединений, к.х.н. Мензоровой Н. И. и к.б.н. Сибирцеву Ю. Т. за проведение биологических тестов с использованием половых клеток морских ежей Strongylocentrotus intermedius, к.б.н. Аминину Д. Л. и к.б.н. Прокофьевой Н. Г. за исследование цитотоксической активности соединений. Автор также глубоко признателен профессору Лаачу X. за возможность выполнения исследовательской работы на кафедре органической и биомолекулярной химии Геттингенского
университета (Германия), д.б.н. Бузолевой Л. С. (Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток) за тестирование антимикробной активности соединений в отношении патогенных микроорганизмов.
Используемые сокращения:
Хроматография: ТСХ - тонкослойная хроматография; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ПТСХ -препаративная тонкослойная хроматография.
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса: с - синглет; д - дублет; т -триплет; к - квартет; дд - дублет дублетов; м - мультиплет; ш - широкий.
'Н и 13С ЯМР - спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; COSY (Correlation Spectroscopy) - корреляционная спектроскопия; НМВС (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) - ЯМР-эксперимент гетероядернои корреляции через несколько связей; DEPT (Distortionless Enchancement by Polarization Transfer) - неискаженное усиление переносом поляризации; HSQC (Heteronuclear Single Quantum Connectivity) -гетероядерная одноквантовая корреляция;
Масс-спектрометрия: МСХИ - масс-спектрометрия с химической ионизацией; ЭУМС - масс-спектрометрия электронного удара; ЭСМС -электрораспылительная масс-спектрометрия; МАЛДИМС - масс-спектрометрия матрично активированной лазерной десорбции/ ионизации;
Да - Дальтон.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Как видно из диаграммы 2 [13] большинство метаболитов бактериального происхождения было выделено из группы грамположительных бактерий рода Streptomyces и грамотрицательных бактерий рода Altervmonas. Небольшой процент метаболитов псевдоальтеромонад можно объяснить тем, что этот род был выделен из рода Alteromonas только в 1995 году и, возможно, некоторые метаболиты альтеромонад на самом деле выделены из бактерий рода Pseudoalteromonas. Следует отметить, что, хотя морские микроорганизмы продолжают оставаться объектами интенсивных исследований, скорость открытия соединений с новыми химическими структурами понижается, так как около 90% культур микроорганизмов продуцируют известные соединения. Этот факт, а также то, что не более 5% выделяемых штаммов из морских объектов являются культурабельными, объясняют трудности обнаружения новых структурных вариантов метаболитов морских микроорганизмов [17].
JlJJLflJ
140-г 120 4i 100 804 60-40-20-
П П гш т т
(////.
' / /
//
.? ^
//
/
Диаграмма 2. Количество активных метаболитов, выделенных из различных родов морских бактерий (1966 г.-1999 г.)
Макролиды, макролактамы и лактон-содержащие соединения
Актинобактерии являются предметом пристального внимания исследователей. Это связано с огромным количеством разнообразных антибиотиков, синтезируемых этими бактериями [18-21]. Выделение стрептомицина из Streptomyces griseus, обладающего сравнительно невысокой токсичностью и широким спектром антибиотического действия и нашедшего применение в медицине, послужило мощным толчком в исследовании актиномицетов и поиске новых антибиотических веществ [22]. Помимо стрептомицина еще ряд антибиотиков из актиномицетов: неомицины, тетрациклины и хлорамфеникол - нашли применение в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и медицине.
Грамположительные бактерии актиномицетной линии составляют, как правило, меньшую часть морских микробных сообществ. В морской воде эти бактерии бывают представлены несколькими колониями, составляющими малый процент микроорганизмов, способных расти в лабораторных условиях. В осадках они присутствуют почти постоянно, но концентрация их редко составляет более 10% жизнеспособной микрофлоры. Из проб прибрежных вод и донных осадков, с поверхности кожи рыб могут быть выделены представители очень многих родов актинобактерий [23]. Ниже представлены новые структуры биологически активных соединений, выделенных из морских актинобактерий и псевдоальтеромонад.
Макролиды, макролактамы и лактон-содержащие соединения Большую группу биоактивных соединений актинобактерий составляют макроциклические лактоны (макролиды) и лактон-содержащие соединения.
Из морских отложений залива Сагами был выделен штамм Streptomyces griseus SS-20, который продуцировал антибиотики - аплазмомицины А (1), В (2) и С (3), ингибирующие рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis и Corynebacterium smegmatis при минимальной концентрации (МИК) 0.8-3.0 мкг/мл. Это были первые бор-содержащие антибиотики, выделенные из морских бактерий. Аплазмомицины эффективно подавляют развитие малярийной инфекции у мышей, вызванной Plasmodium berghei [24,25].
Из донных осадков залива Бодега (Калифорния) выделен штамм актинобактерии, который американские исследователи отнесли к мадурамицетам. Бактерия синтезировала 24-членный макролид - мадуралид (4).
Два новых капролактона, (6R, 105)-метил-6-додеканолид 5 и (Я)-Ю-метил-6-ундеканолид 6, были идентифицированы в липидном экстракте морского стрептомицета Streptomyces sp. (изолят В6007), полученного из мангровых донных осадков, собранных у берегов Папуа-Новая Гинея. Последовательность 16S rRNA гена стрептомицета имела 99% подобия гену Streptomyces alborgriseolus. Структуры соединений были предложены на основании данных ГЖХ-МС экспериментов и подтверждены синтезом. Абсолютная конфигурация соединений была установлена при сравнении природных и синтетических стереоизомеров с использованием хиральной газовой хроматографии. Соединения показывают невысокую фитотоксическую активность и значительную активность по отношению к опухолевым клеткам. Лактоны ингибируют рост грамположительных бактерий, обладают антикандидозной активностью и не оказывают влияние на рост грамотрицательных бактерий [27].
Известно, что а-гидрокси-бутанолиды играют важную роль в метаболизме наземных актиномицетов [28]. Эти сигнальные соединения выполняют функцию регуляции синтеза вторичных метаболитов. Подобные соединения, бутанолиды (7) и (8), были выделены из штамма Streptomyces virginiae CNB-228, изолированного из образца грунта коралловых рифов Багамских островов на глубине 80 футов.
Новые представители класса бутенолидов были получены немецкими учеными из штаммов Streptomyces sp. В5632 и В3497. Показано, что соединения (9-11) подавляют рост Pseudomonas aeruginosa и ингибируют хитиназу из Serratia marcescens [29].
Биологически активные соединения морских бактерий рода Pseudoalteromonas
Бактерии рода Pseudoalteromonas составляют значительную часть микробной биомассы моря и могут быть выделены практически из каждого образца воды. В 1995 г. французскими микробиологами была проведена ревизия рода Alteromonas. Секвенирование 16S рРНК-генов, показало, что в роде Alteromonas должен остаться только Alteromonas macleodii. В настоящее время к этому роду относят еще четыре вида бактерий - Alteromonas addita, Alteromonas hispanica, Alteromonas litorea и Alteromonas marina [87], a остальные виды следует относить к роду Pseudoalteromonas [88].
Псевдоальтеромонады были первыми морскими бактериями, у которых были обнаружены высокобромированные метаболиты. Этот факт является удивительным, так как в морской воде, естественной среде обитания бактерий, наиболее распространенным галогеном является хлор. В 1966 году был выделен первый высокобромированный метаболит, пентабромопсевдилин (125), из нового вида бактерии Pseudomonas bromoutilis, ассоциированной с морской травой рода Thalassia. Вещество обладает противоопухолевой активностью, а также проявляет высокую фитотоксическую активность [89, 90]. Позднее были охарактеризованы бром-содержащие антибиотики, тетрабромпиррол (126) и гексабром-2,2 -бипиррол (127). Соединения были выделены из бактерии рода Pseudoalteromonas [91]. Тетрабромпиррол проявляет антимикробную активность к S. aureus, Е. coli, P. aeruginosa и С. albicans. нового высокобромированного антибиотика МС21-А, подавляющего рост метициллин-устойчивого S. aureus. Активность вещества к метициллин устойчивым штаммам стафилококка (МИК = 1-2 мкг/мл) сопоставима с активностью антибиотика ванкомицина (МИК = 0.25-2 мкг/мл). Современными физико-химическими методами структура МС21-А установлена как, 3,3 ,5,5 тетрабром-2,2 -бифенилдиол (128). Также было показано, что полученный антибиотик ингибирует рост Enterococcus serolicida, Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis [92].
Новый антибиотик, названный корормицином (129), был выделен из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. F-420 [93]. Этот штамм был изолирован с поверхности макроводоросли Halimeda sp. Показано, что корормицин ингибирует рост морских грамотрицательных бактерий и не активен в отношении наземных микроорганизмов [94,95]. СН Бисукаберин (1,12-дигидрокси-1,6,12,17-тетраазациклодоказан-2,5,13,16 тетраон) (130) был охарактеризован в качестве метаболита бактерии Alteromonas haloplanktis SB-1123, выделенной из илистого грунта побережья японской префектуры Аомори. Вещество обладает сидероформной активностью и повышает чувствительность опухолевых клеток к цитолизу [96]. НО. ОН 130
Морская бактерия "Alteromonas rava" (sp. nov.) SANK 73390, выделенная из морской воды японскими исследователями, синтезировала антибиотик тиомаринол (131). Показано, что тиомаринол активен в отношении грамположительных (Staphylococcus) и грамотрицательных бактерий (Enterococcus) [97].
В результате проведенной работы было выделено 116 штаммов актинобактерий из морских донных осадков (бухта Троица, Японское море, Морская экспериментальная станция ТИБОХ ДВО РАН, июль - август 2001 года). Микроорганизмы были выращены на стандартной среде в течение 5-7 суток при комнатной температуре . Только для 83 из 116 штаммов был отмечен рост в лабораторных условиях. Бутанольные экстракты актинобактерий были исследованы на присутствие антимикробных соединений. Для тестирования были использованы тест-культуры грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, а также грамотрицательных бактерий Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и дрожжеподобных грибов Candida albicans. Из 83 протестированных штаммов в 9 штаммах были обнаружены соединения с антимикробной активностью, ингибирующие рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus. Три штамма синтезировали антибиотики против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Также были обнаружены 4 штамма, продуцирующие соединения с антикандидозной активностью (Таблица 1, диаграмма 3).
Биологически активные соединения из актинобактерий Streptomyces sp. GW 33/1539
Штамм актинобактерии Streptomyces sp. GW 33/1539 был получен из коллекции Геттингенского университета (Германия). Установлено, что стрептомицет синтезирует соединения, обладающие антимикробной активностью по отношению к Bacullus subtilis.
Суммарный экстракт культуральной жидкости бактерии и биомассы последовательно экстрагировали гексаном, этилацетатом и бутанолом. Этилацетатный экстракт хроматографировали на сефадексе LH-20 в метаноле, в результате чего были получены 3 фракции (Схема 2), отличающиеся по данным тонкослойной хроматографии. Первую фракцию разделили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, получив в качестве основного компонента соединение ЗА (2 мг). Молекулярная масса ЗА - 260 Да, была установлена из значения квазимолекулярного иона с m/z 261 [М+Н]+, полученного с помощью МСХИ. Н и 13С ЯМР спектры (Рисунок 5) ЗА содержали сигналы протонных и углеродных атомов, характерные для ароматического ядра с заместителями в пара-положении (Таблица 5). Сигналы метановых протонов (Зц 4.13; 3.53) были отнесены к а-протонам двух аминокислот тирозина и пролина [103, 104]. На пептидный характер соединения указывало присутствие двух амидных атомов углерода в 13С ЯМР спектре ( 5С 172.0, 168.2) [108]. После кислотного гидролиза соединения ЗА и ВЭЖХ производных аминокислот, полученных по методу Мерфи, были идентифицированы D-тирозин и D-пролин (Таблица 6). Сравнение полученных данных масс-, Ни С ЯМР спектров соединения ЗА с соответствующими данными для цикло-(Ь-тирозил-Ь-пролила), выделенного ранее из морского изолята бактерии Pseudomonas aeruginosa [109], подтвердило что полученное соединение является циклическим дипептидом 3-(4 -гидроксибензил)-гексагидропирроло-[1,2-а]-пиразин-1,4-дионом [цикло-(0-тирозил-О-пролилом)] (Рисунок 3). Дипептид ЗА является новым дикетопиперазиновым алкалоидом, ранее не выделенным из природных источников. Нами установлено, что соединение ЗА при концентрации 50 мкг/мл останавливает деление эмбрионов морского ежа на стадии 2-4-х бластомеров и не оказывает влияния на целостность мембран спермиев и яйцеклеток морского ежа S. intermedius.
Фракцию 2 повторно хроматографировали на колонке сефадексом LH-20 в метаноле и получили в качестве основного компонента соединение 4А (30 мг). Молекулярная масса 4А - 154 Да установлена на основании данных МСХИ. Н и 13С ЯМР спектры (Таблица 7) подтверждали наличие в 4А трех-замещенного ароматического цикла (дн 7.33, Ш, дд, .7=8,2 Гц; 6.69, 1Н, т, .7=8 Гц; 6.96, 1Н, дц, .7=8,2 Гц; 5С 120.0, 117.9, 119.5), двух атомов углерода, связанных с гидроксильными группами (Зс 152.2, 147.4), и карбонильной группы (дс 174.9) [65]. В ИК спектре присутствует полоса поглощения карбоксильной группы (1737 см"1). Полученные данные были идентичны данным 2,3-дигидроксибензойной кислоты (Рисунок 4), выделенной ранее из листьев высшего растения Aristolochia cucurbitifolia, произрастающего на Тайване [110]. При действии на оплодотворенные яйцеклетки соединение 4А в концентрации 100 мкг/мл ингибирует на 70% развитие эмбрионов. 4А при концентрации 50 мкг/мл на 30% лизирует мембраны спермиев морского ежа и не оказывает влияния на целостность мембран яйцеклеток.
При повторной хроматографии фракции 3 на сефадексе LH-20 в системе хлороформ: метанол (60:40) было получено в индивидуальном состоянии соединение 5А (5мг). Молекулярная масса вещества 215 Да установлена на основании значений пиков квазимолекулярных пиков с m/z 238 [M+Na]+ и 214 [М-Н] , полученных с помощью ЭСМС. Н ЯМР спектр 5А (Таблица 8) содержал сигналы трех метиновых протонов, трехзамещенного бензольного цикла (Зц 7.51, д, Н-4; 6.92, д, Н-5; 6.72, с, Н-7), олефинового протона ( 5.25, м, Н-2 ) и амидного протона ( 5н, 8.7, с, Н-1). Кроме этого в спектре были обнаружены синглетные сигналы двух метальных групп при двойной связи ( 1.80, с, Н-4 ; 1.70, с, Н-51). ,3С ЯМР спектр (Таблица 8) подтвердил наличие в 5А указанных выше функциональных групп. В С ЯМР спектре наблюдались сигналы восьми 5р2-гибридизированных атомов углерода, соответствующие четырем двойным связям, а также сигналы карбонильного (дс 183.4, С-3) и амидного атомов углерода ( 5С 160.3, С-2).
Культивирование актинобактерии Streptomyces sp. GW 33/1539 и выделение биологически активных соединений
Штамм был выбран при скрининге биологически активных соединений в хлороформ-этанольных экстрактах морских актинобактерий из коллекции микроорганизмов Геттингенского университета (Германия). Микроорганизм был выделен из образцов воды Северного моря. Было показано, что бактерия Streptomyces sp. Mei 22 синтезирует вещества активные по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям и обладающие высокой фунгицидной активностью. При тонкослойной хроматографии хлороформ-этанольного экстракта культуральной жидкости бактерии наблюдаются широкие зоны, окрашиваемые анисовым альдегидом в интенсивный коричневый цвет при нагревании. В соответствии с этими данными мы предположили, что микроорганизм продуцирует антибиотические вещества макролидной природы. Общеизвестно, что макролидные антибиотики обладают широким спектром биологической активности [30, 32]. Этот факт поддержал наш интерес к исследованию метаболитов данного стрептомицета.
Суммарный экстракт культуральной жидкости и бактериальной массы хроматографировали на колонке с силикагелем в системе дихлорэтан: метанол с увеличением содержания метанола. Тестирование на антибактериальную активность показало, что активные соединения содержатся во фракции, элюированной системой: дихлорэтан: метанол (95/5) (фракция 1). Фракцию препаративно хроматографировали в тонком слое (ПТСХ) в системе дихлорэтан: метанол (95/5). Были получены соединения 12А (6 мг), 13А (4 мг) и 14А (4 мг) (Экспериментальная часть, схема 4).
Молекулярная масса соединения 12А 815 Да была определена на основании значений пиков квазимолекулярных ионов с m/z 838 [M+Na]+ и 814 [М-Н]", полученных методом ЭСМС. В !Н ЯМР спектре наблюдались сигналы протонов семи метальных групп ( 5Н 0.78, д; 0.82 (9Н) м; 0.89, дд; 1.05, д; 1.10, д), в том числе сигналы протонов двух метальных групп при двойной связи ( 5Н 1.98, с; 1.92, с) и сигналы пртонов двух метоксильных групп (дц 3.63, с; 3.20, с), сигналы протонов при двойной связи (Зц 5.15, дд; 5.74, м; 5.76, м; 6.55, дд; 6.71, с; 6.93, д; 7.20, д) и сигнал амидного протона (дц 8.63, с). Согласно данным Н ЯМР и HSQC спектров в соединении 12А присутствуют шесть метиновых групп, несущих кислородную функцию (дц 3.24, м; 3.58, м; 3.85, м; 4.12, м; 4.92, д; 5.10, м). В С ЯМР и DEPT спектрах присутствуют сигналы третичных атомов углеродов, связанных с кислородной функцией ( 5С 125.1; 127.1; 132.5; 132.9; 133.6; 142.8), два сигнала карбонильных углеродов в сложноэфирных группах (Sc 167.3; 164.2) и сигнал ацетального атома углерода ( 5С 98.8). Эксперименты двумерной ЯМР спектроскопии позволили сделать отнесение углеродных и протоновых сигналов в 12А (Таблица 14). НМВС спектр 12А подтвердил последовательность присоединения атомов углерода в молекуле. Полученные !Н и 13С ЯМР спектры 12А совпадают с описанными данными для бафиломицина В] [129, 130] (Рисунок 12). Таким образом было показано, что Streptomyces sp. Mei 22 является новым продуцентом антибиотиков бафиломицинового ряда. Это предположение было подтверждено выделением из стрептомицета еще двух антибиотиков 13А и 14А этого же типа.
Молекулярная масса 13А отличается от молекулярной массы 12А на 14 Да. Она была вычислена из значений пиков квазимолекулярных ионов с m/z 852 [M+Na]+ и 828 [М-Н]", полученных с помощью ЭСМС. !Н ЯМР спектр 13А отличается от спектра 12А наличием сигнала протонов дополнительной метоксильной группы при Зн 3.05 м.д. Такой кеталь с С-19-ОСНз группой, бафиломицин Вг (Рисунок 12), был выделен в качестве минорного компонента из 5". griseus [129,130].
Молекулярная масса соединения 14А 622 Да была определена из значения пика квазимолекулярного иона с m/z 645 [M+Na]+, полученного с помощью ЭСМС. Н ЯМР спектр соединения содержал сигналы протонов метильных групп, расположенных в области (5ц 0.78-1.06 м.д., и протонов двух метильных групп при двойных связях при Зц 1.92 и 1.98 м.д. Кроме того в спектре, были идентифицированы сигналы пяти метановых протонов при дц, 5.15, 6.71, 5.74, 5.76, 6.55 м.д., что говорило о присутствии двойных связей в молекуле 14А. Кроме этого !Н ЯМР спектр имел два сигнала протонов метоксильных групп при дн 3.20 и 3.63 м.д. и шесть сигналов метановых протонов, связанных с атомами углерода, несущими кислородную функцию при 5Н 3.24, 5.10, 3.58, 3.85, 4.12, 4.92 м.д. Разница между молекулярными массами 12А и 14А составляла 193 Да. Эта разница была приписана наличию в 12А остатка моноамида #-(3-гидрокси-2-циклопентенон)-фумаровой кислоты, фрагмента боковой цепи бафиломицина В і [129, 130]. Отсутствие такого фрагмента в 14А подтверждалось отсутствием сигналов двух протонов при 5Н 6.93 м.д., 7.20 м.д. и сигнала одного амидного протона при 5Н 8.63 м.д, т. е. тех сигналов, которые мы наблюдали в Н ЯМР спектрах 12А и 13А. Молекулярная масса 14А, а также данные Н ЯМР спектра соединения указывали на близость его к бафилломицину А і (Рисунок 12), выделенному ранее из почвенного изолята бактерии S. griseus [129,130].
