Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор
2.1. Фукоиданы бурых водорослей. Общие сведения 7
2.2. Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей ... 9
2.2.1. Фукоиданы, построенные из 1- 3-связанных остатков сульфатированной а-Ь-фукопиранозы 10
2.2.2. Фукоиданы, построенные из 1- 3- и 1 4-связанных остатков сульфатированной а-Е-фукопиранозы 15
2.2.3. Фукоиданы, построенные из 1- 3 и/или 1 4-связанных остатков сульфатированной а-Е-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы 18
2.2.4. Фукоиданы сложного состава 21
2.3. Биологическая активность фукоиданов бурых водорослей 23
2.3.1. Антикоагулянтная и антитромбическая активности 23
2.3.2. Антивирусная активность 26
2.3.3. Противоопухолевая активность
2.3.3.1. Антипролиферативная активность 30
2.3.3.2. Антиметастатическая активность 36
2.3.4. Апоптоз 41
2.3.4.1. Определение понятия «апоптоз». Отличительные признаки апоптоза42
2.3.4.2. Сигнальные пути при апоптозе 42
2.3.4.3. Митоген-активируемые протеинкиназные каскады 45
2.3.4.4. Фукоиданы бурых водорослей - индукторы апоптоза раковых клеток47
3. Результаты и их обсуждение 53
3.1. Выделение фукоиданов из бурых водорослей и установление их структуры53
3.1.1. Выделение и фракционирование фукоиданов из бурых водорослей 53
3.1.2. Установление структуры фукоиданов 63
3.2. Исследование противоопухолевой активности фукоиданов из бурых водорослей 72
3.2.1. Цитотоксическая активность фукоиданов 72
3.2.2. Действие фукоиданов на пролиферацию опухолевых клеток 74
3.2.3. Действие фукоиданов на неопластическую трансформацию клеток,
вызванную действием ЕGF 76
3.2.3.1. Молекулярный механизм канцерпревентивного действия фукоидана из бурой водоросли cichorioides 78
3.2.4. Действие фукоиданов на самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток 82
3.2.4.1. Действие фукоидана из бурой водоросли F. evanescens на активацию матриксных металлопротеиназ 85
3.2.5. Проапоптопическое действие фукоидана из бурой водоросли S. cichorioides 87
4. Экспериментальная часть 93
4.1. Материалы 93
4.2. Оборудование 95
4.3. Методы
5. Выводы 104
6. Список литературы
- Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей
- Фукоиданы, построенные из 1- 3 и/или 1 4-связанных остатков сульфатированной а-Е-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы
- Установление структуры фукоиданов
- Действие фукоидана из бурой водоросли F. evanescens на активацию матриксных металлопротеиназ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бурые водоросли морей Дальнего Востока России являются богатым, легко возобновляемым источником уникальных по структуре и свойствам полисахаридов (ламинаранов, альгиновых кислот и фукоиданов). В последние годы объектом интенсивного исследования стали сульфатированные полисахариды бурых водорослей - фукоиданы. Они представляют собой обширный класс биополимеров, содержание и структура которых варьирует в зависимости от вида водоросли, мест ее произрастания, сезона сбора и многих других факторов. Постоянно растущий интерес к этим полисахаридам объясняется их разнообразной биологической активностью, которая может быть использована при создании медицинских препаратов нового поколения.
В последние годы наблюдается стремительный рост числа публикаций, посвященных исследованию противоопухолевой активности фукоиданов. Показано, что данная активность фукоиданов возрастает с увеличением степени сульфатирования, однако информация о влиянии на противоопухолевую активность других структурных характеристик фукоиданов: положения сульфатных групп в моносахаридных остатках, их молекулярной массы, типа О-гликозидной связи между остатками фукозы и/или других моносахаридов в главной цепи, а также наличие неуглеводных заместителей, отсутствует.
Актуальным является выделение фукоиданов со стандартными структурными характеристиками и установление молекулярного механизма их противоопухолевого действия. Исследование фукоиданов, принадлежащих к разным структурным группам, позволит выявить закономерности проявления противоопухолевой активности в зависимости от их структурных особенностей.
Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН и при поддержке грантов РФФИ (проект № 09-04-00761-а) и ДВО РАН (проекты № 10-III-B-05-084, № 11-III-B-05-075).
Цель и задачи работы. Целью данной диссертационной работы является установление структуры фукоиданов бурых водорослей морей Дальнего Востока России Saccharina cichohoides, Saccharina japonica, Fucus evanescens и Undaria pinnatifida и характеристика взаимосвязи структуры фукоиданов и их действия на различные типы раковых клеток человека.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) выделить и фракционировать фукоиданы из бурых водорослей морей Дальнего Востока России S. cichohoides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida; 2) установить структуру фукоиданов; 3) исследовать противоопухолевую активность фукоиданов и молекулярный механизм их действия; 4) определить характер взаимосвязи структуры фукоиданов из бурых водорослей и их противоопухолевой активности.
Научная новизна работы. Из дальневосточных бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida были выделены и охарактеризованы новые фукоиданы, различающиеся между собой по моносахарид ному составу, типу связей, степени сульфатирования и ацетилирования. Впервые показано, что сульфатированные полисахариды, синтезируемые этими видами водорослей, относятся к разным структурным типам фукоиданов.
Проведены исследования биологической активности фукоиданов in vitro. Изучено цитотоксическое действие фукоиданов на различные типы раковых клеток человека, их способность ингибировать неопластическую трансформацию нормальных эпидермальных клеток мыши JB6 CI41, вызванную действием эпидермального фактора роста (EGF), и самопроизвольное формирование колоний опухолевых клеток человека. Впервые установлена избирательность противоопухолевого действия фукоиданов, обусловленная их структурными характеристиками. Показано участие фукоидана в ингибировании EGF-индуцированной активации белков митоген-активируемого протеинкиназного каскада (МАРК каскада) в JB6 CI41 клетках. Исследована способность фукоидана увеличивать антипролиферативную активность ресвератрола и усиливать апоптоз раковых клеток кишечника человека. Впервые показано, что молекулярный механизм данного действия связан с активацией инициаторных и эффекторных каспаз.
Практическая значимость работы. Охарактеризованы фукоиданы из широко распространенных и легко культивируемых дальневосточных видов бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida. Полученные данные подтверждают структурное многообразие фукоиданов. Показана перспективность использования исследованных фукоиданов для разработки средств профилактики и лечения онкологических заболеваний. Показана возможность применения фукоидана из F. evanescens для защиты кожи от действия УФ-облучения, а фукоидана из S. cichorioides для усиления противоопухолевого действия ресвератрола, что может позволить снизить дозы токсичных противоопухолевых препаратов при разработке схем лечения онкологических пациентов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Фукоиданы из бурых водорослей S. cichorioides, S. japonica, F. evanescens и U. pinnatifida относятся к разным структурным типам.
Фукоиданы не проявляют цитотоксической активности к эпидермальным клеткам мыши JB6 CI41 и ингибируют их EGF-индуцированную неопластическую трансформацию посредством подавления активации рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), белков МАРК каскада и АР-1 комплекса.
Фукоиданы эффективно ингибируют самопроизвольное формирование и рост колоний клеток рака кишечника, молочной железы и меланомы человека. Фукоиданы
различной структуры проявляют специфичность действия по отношению к определенному типу раковых клеток.
Высокосульфатированный a-L-фукан из S. cichorioides увеличивает антипролиферативную активность ресвератрола и усиливает апоптоз раковых клеток кишечника человека, вызывая активацию инициаторных и эффекторных каспаз при совместном действии ресвератрола и фукоидана.
Существует взаимосвязь структуры фукоиданов и их противоопухолевого действия. Наличие 1—>3-связанных сульфатированных остатков a-L-фукозы необходимо для ингибирования EGF-индуцированной неопластической трансформации нормальных клеток мыши и роста колоний раковых клеток кишечника человека; сульфатированный и частично ацетилированный полисахарид, состоящий из 1—>3- и 1—>4-связанных остатков a-L-фукозы ингибирует процессы формирования и роста колоний меланомы человека; для ингибирования процессов роста колоний рака молочной железы человека необходимо присутствие в молекуле фукоидана большого количества остатков сульфатированной и частично ацетилированной галактозы и фукозы, соединенных 1—>3- и/или 1—>4-0-гликозидными связями.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены автором в виде устных и стендовых сообщений на 3rd Annual Korea-Russian Bio Joint Forum «The Natural Products Industrialization and Application», Gangneung, 2011; на научно-практической конференции «Биологически активные вещества: Фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Украина, 2011; на Международном симпозиуме «Bioprosp», Норвегия, 2011; на 9th International Marine Biotechnology Conference (IMBC 2010), Китай, 2010; на 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology», Новосибирск, 2010; на XII Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2009.
Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ и 10 тезисов докладов в материалах научных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН 28 марта 2012 г.
Личный вклад соискателя в проведении исследования. Соискателем был выполнен анализ литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и подготовлены доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Объем и структура работы. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Литературный обзор», «Результаты и их обсуждение», «Экспериментальная часть», «Выводы», «Список литературы», включающий 197 наименований, и приложения, где приведены спектры ИК-, 13С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Диссертация изложена на 124 страницах. Результаты представлены в 10 таблицах и иллюстрированы 26 рисунками.
Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н. Звягинцевой Т.Н. Автор благодарит к.х.н. Ермакову СП. и Шевченко Н.М. за консультации и помощь в работе, к.х.н. Исакова В.В. за получение ЯМР спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. за получение ИК спектров и всех сотрудников ЛХФ ТИБОХ ДВО РАН.
Сокращения и условные обозначения. L - фракция ламинарана, РМ - фракция полиманнурованной кислоты, F - фракция фукоидана, EGF - эпидермальный фактор роста, EGFR - рецептор эпидермального фактора роста, ERK - киназа, регулирующая внеклеточные сигналы, JNK - Jun N-концевая киназа, МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы, MMPs - матриксные металлопротеиназы
Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей
Фукоиданы - сульфатированные полисахариды, непременным и часто главным компонентом которых являются остатки a-L-фукозы, этерифицированные серной кислотой. Однако в настоящее время обнаружены фукоиданы, в которых содержание D-галактозы и L-фукозы практически одинаково.
Впервые фукозосодержащий полисахарид был выделен Н. Killing в 1913 г. из бурой водоросли и назван фукоидином [1]. Подобные полисахариды не встречаются в других отделах водорослей и в наземных растениях, однако родственные биополимеры найдены в морских беспозвоночных (морских ежах и голотуриях), принадлежащих к типу иглокожих [2]. Поскольку полисахариды животного происхождения содержат только фукозу (содержание других моносахаридов менее 5 %) и сульфат, в соответствии с IUPAC принятой номенклатурой углеводов, А. Ribeiro и А. Alves применили термин фукансульфаты к полисахаридам, выделенным из морских беспозвоночных [3].
В состав сульфатированных полисахаридов, выделенных из бурых водорослей, часто входят такие моносахариды как галактоза (Gal), манноза (Man), ксилоза (Ху1), рамноза (Rha), уроновые кислоты (Ua), а также ацетильные группы. Е. Percival и А. Ross предложили считать полисахарид из водорослей, обогащенный Е-фукозой, фуканом [4]. Позже в 1959 г. в соответствии с номенклатурой полисахаридов подобный препарат, полученный N. McNeely, был назван фукоиданом [5].
Гистохимически фукоиданы определяются как основной компонент внеклеточного матрикса (ВКМ) концептакул водоросли [6]. Концентрация этих полисахаридов в ВКМ концептакул в несколько десятков раз выше, чем в межклетниках сердцевины [7]. Для определения локализации фукоидана было предложено использовать иммуноцитохимический метод окрашивания, с помощью которого удалось обнаружить, что фукоидан локализован в области клеточной стенки. Он был обнаружен не только в области эпидермальных клеток, но и во внутреннем кортикальном слое. Было показано что в водоросли Sacchcirinci japonica (предыдущее название Laminaria japonica) фукоидан находится на расстоянии 50 - 150 мкм от поверхности [8]. Предполагается, что фукоиданы. благодаря их гигроскопичности, помогают в высвобождении репродуктивных клеток. Они предохраняют растения, произрастающие на литорали, от высыхания и обеспечивают стабильность клеточных стенок [9]. Предположительно, благодаря своим антиоксидантным свойствам, фукоиданы могут защищать растения от оксидативного стресса, вызванного флуктуациями температуры, света и солености в естественных условиях [10, 11]. Предполагается также экранирующая функция фукоиданов против высоких интенсивностей света и ультрафиолетового облучения (УФ-облучения) [12].
Содержание фукоиданов в бурых водорослях колеблется в довольно широких пределах: от 0,4 до 20,4 % и зависит от вида водоросли и сезона ее сбора. Самое высокое содержание фукоидана (20,4 %) было обнаружено Усовым А.И. с соавторами в Saundersella simplex, принадлежащей к порядку Dicyosiphonales [13]. Достаточно высокое содержание фукоиданов наблюдается в водорослях порядка Fucales: от 13,4 % до 16,5 % - у Fucus vesiculosus и от 10,0 % до 11,5 % - у Ascophyllum nodosum [14]. В дальневосточных представителях порядка Laminarinales содержание фукоиданов меньше: от 0,6 % до 6,5 %, а водорослях порядка Fucales - от 1,5 % и до 7,9 % [15, 16]. Различие в содержании фукоиданов для одного вида водоросли может определяться сезонными изменениями таких абиотических факторов как температура, концентрация элементов минерального питания, освещенность [17], и зависит от репродуктивного статуса водоросли [16]. Один и тот же вид водоросли может содержать несколько структурных типов фукоиданов [18].
Кроме того, водоросли одного вида, произрастающие в разных условиях, содержат фукоиданы, отличающиеся не только по моносахаридному составу, но и по степени сульфатирования. Известно, что фукоиданы из Saccharine latissima (предыдущее название Laminaria saccharina), произрастающей в Баренцевом море, более сульфатированы и состоят из остатков фукозы и глюкуроновой кислоты, тогда как полисахариды водоросли беломорской популяции менее сульфатированны и наряду с фукозой и глюкуроновой кислотой содержат глюкозу [19]. Биологическая активность этих полисахаридов в отличие от их структуры изучается чрезвычайно интенсивно. В силу недостатка информации о структуре биологически активных фракций фукоиданов сведения о связи структура/функция для этих полисахаридов практически отсутствуют.
Фукоиданы, построенные из 1- 3 и/или 1 4-связанных остатков сульфатированной а-Е-фукопиранозы и p-D-галактопиранозы
Свойство фукоиданов препятствовать свертыванию крови было обнаружено в 1957 г. [54]. С тех пор антикоагулянтная активность фукоиданов является объектом изучения с целью найти удобный аналог или заменитель природного антикоагулянта гепарина (кислый неразветвленный мукополисахарид животного происхождения), который широко применяется в медицине [55]. Гепарин вызывает ряд нежелательных эффектов: развитие тромбоцитопении [56] и геморрагии [57]. Он выделяется из тканей животных, где содержится в малых количествах, а получаемые препараты могут быть загрязнены вирусами и токсичными белками. Кроме того, при использовании гепарина нужно учитывать возможность прионовой контаминации [58].
В настоящее время известны два механизма антикоагулянтного действия фукоиданов: один реализуется посредством ингибирования активности факторов VIII, XI, XII «внутреннего» пути свертывания крови, второй («внешний» путь), подобно механизму действия гепарина, основан на ингибировании антитромбина III (AT III) [59]. Фукоиданы, действующие по первому механизму, могут применяться при антикоагулянтной терапии у больных с врожденным или приобретенным дефицитом AT III, когда гепарин не эффективен. В свою очередь, фукоиданы, действующие подобно гепарину, в силу своего растительного происхождения могут быть предпочтительнее гепарина. Кроме того, фукоиданы, как правило, проявляют иммуномодулирующее действие, а гепарин является иммунодепрессантом.
Определение структурных фрагментов фукоиданов, важных для проявления антикоагулянтной активности, является актуальной задачей. Гепарин, как и фукоиданы, содержит сульфатированные углеводные цепи, хотя его структура не имеет аналогии с фукоиданами [60]. Естественно было предположить, что для проявления антикоагулянтных свойств первостепенное значение имеет высокая степень сульфатирования полисахаридов. Действительно, в ряде работ было показано, что фукоиданы с высокой степенью сульфатирования обладали значительной антикоагулянтной активностью [61, 62]. Установлено, что дополнительное сульфатирование фукоиданов приводило к повышению их антикоагулянтной активности, тогда как десульфатирование полностью инактивировало полисахариды [63, 64]. С другой стороны, при сравнении антикоагулянтной активности фукоиданов из разных видов бурых водорослей рядом авторов было установлено, что полисахариды, близкие по содержанию сульфатных групп, но различающиеся по моносахаридному составу, типу гликозидной связи и молекулярной массе, значительно отличаются по антикоагулянтному действию [65, 66]. Так для фукоиданов из бурых водорослей Saccharina latissima, S. digitata, Analipus japonicus, Cladosiphon okamuranus. Chorda phylum, Ascophyllum nodosum, Fucus evanescens, F. distichus, F. serratus, F. spiralis и F. vesiculosus показано, что наиболее сильное антикоагулянтное действие проявили фукоиданы из S. latissima, S. digitata и F. distichus (20 - 30 ед/мг). Пять фукоиданов из A. nodosum, F. evanescens, F. serratus, F. spiralis и F. vesiculosus ообадали примерно вдвое меньшей ингибирующей активностью (5-15 ед/мг) и три фукоидана из С. okamuranus, С. phylum и A. japonicus практически не проявляли антикоагулянтного действия [26]. Антикоагулянтная активность фукоиданов из разных видов бурых водорослей не всегда зависела от степени их сульфатирования: так фукоиданы из S. latissima и F. serratus, содержащие одинаковое количество сульфатных групп (около 29 %) значительно отличались между собой по антикоагулянтному действию. Следовательно высокая степень сульфатирования является необходимым, но не достаточным структурным элементом, обеспечивающим антикоагулянтные свойства фукоиданов, необходимо УЧИТЫВЯТЬ и более тонкие CTDVKTVDHbie особенности их молекул
Положение сульфатных групп в фукоиданах является важным фактором, влияющим на уровень их антикоагулянтной активности. В ряде работ показано, что у фукоиданов, сульфатированных по положениям С2 и СЗ остатков фукозы, антикоагулянтная активность выше, чем у полисахаридов, содержащих сульфатные группы при С4 [38, 62, 67].
Сложный процесс свертывания крови контролируется многими факторами, среди которых важную роль играют AT III, гепариновый кофактор II (НС II) и ингибиторы тромбина, препятствующие превращению фибриногена в фибрин. Активность AT III увеличивается приблизительно на три порядка за счет образования комплекса с гепарином. В молекулах гепарина имеются специфические активные центры взаимодействия с AT III, которые представляют собой пентасахаридные фрагменты с уникальной последовательностью моносахаридных остатков и расположением сульфатных групп [60]. Трудно ожидать, что подобные фрагменты можно найти в молекулах фукоиданов. В отдельных работах показаны взаимодействия фукоиданов с AT III [68] и НС II, приводящие к активации этих факторов [27, 65, 69]. Не исключено прямое взаимодействие фукоиданов с тромбином и другими протеазами, приводящее к инактивации ферментов. В этом случае решающим фактором может быть высокая молекулярная масса полисахарида, поскольку его деполимеризация ослабляет антикоагулянтные свойства. Например, показано уменьшение антикоагулянтной активности фукоидана из бурой водоросли Lessonia vadosa (Mw = 320 кДа) с уменьшением молекулярной массы. Образец фукоидана, полученный радикальной деполимеризацией (Mw = 32 кДа), проявлял лишь слабое антикоагулянтное действие [70]. Другими авторами установлено, что высокомолекулярный фукоидан из S. japonica (Mw = 120 кДа) обладал наиболее выраженным антикоагулянтным и антитромбическим действием in vivo, по сравнению с низкомолекулярным фукоиданом (7 кДа) из этого вида водоросли гепарином (6 кДа) и коммерчески доступным фукоиданом из Fucus vesiculosus (50 кДа) [71],
Кроме этого, антикоагулянтная активность фукоиданов может зависеть от моносахаридного состава. Предполагается, что высокое содержание фукозы при низком содержании других нейтральных моносахаридов в фукоиданах способствует увеличению их антикоагулянтной активности [72].
В ТИБОХ ДВО РАН были проведены исследования биологической активности низкомолекулярного фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens и показаны его иммуномодулирующие и антикоагулянтные свойства in vitro и in vivo. Установлено, что введение фукоидана из F. evanescens мышам, у которых вызван шок с помощью эндотоксина, способствует повышению выживаемости и нормализации показателей системы гемостаза. Это свидетельствует о перспективности применения этого препарата как средства иммунотерапии и антикоагулянта для снижения интенсивности гиперкоагуляционного синдрома при септических состояниях [73].
Продолжением исследования явилось сравнение способности исходного фукоидана из F. evanescens и егг производных, полученных путем химической и энзиматической модификации, ингибировать тромбин и фактор свертывания крови Ха. Показано, что очистка исходного фукоидана из F. evanescens от полифенолов и белков приводит к снижению способности ингибировать как тромбин, так и фактор Ха. Тогда как деполимеризация полисахарида специфичным ферментом из штамма морской бактерии Pseudoalteromonas citrea КММ 3296 приводит к увеличению антикоагулянтной активности фукоидана [64]. В настоящее время ведется интенсивный поиск специфических ферментов, модифицирующих нативные фукоиданы, с целью получения новых веществ, обладающих высоким биологическим действием.
Установление структуры фукоиданов
Действие фукоидана из бурой водоросли F. evanescens на активацию матриксных металлопротеиназ
Показано, что исследуемые полисахариды отличались по степени сульфатирования: наиболее сульфатированным являлся фукоидан из S. cichorioides (ScF2), содержание сульфатов составляет 35% (табл. 3.2); наименее - из S. japnica (SjF2) - 23 %, соответственно (табл. 3.4).
Данные о степени сульфатирования фукоиданов, выделенных нами, отличаются от данных, опубликованных другими исследователями. В частности, степень сульфатирования фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens и S. japonica, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях составляет 32,5 % и 35 %, соответственно [39], что превышает содержание сульфатов у фукоиданов из тех же видов бурых водорослей морей Дальнего Востока России на 7 % и 12 %. Заниженное содержание сульфатов у фукоиданов из бурых дальневосточных водорослей может быть обусловлено особенностями их структуры: присутствием ацетильных групп и высокой степенью разветвления главной цепи полисахаридов. Как правило, боковые цепи содержат несульфатированные остатки моносахаридов [176].
Количество сульфатов в фукоиданах различается незначительно по данным разных авторов, при условии, если водоросль собирали в одно и тоже время, и фукоиданы выделяли в одних и тех же условиях. К сожалению, данные о количестве сульфатных групп в галактофукане из бурой водоросли U. pinnatifida не приведены в работах, посвяшенных исследованию структурных характеристик этого полисахарида [23, 24].
Положение сульфатных групп в фукоиданах устанавливали с помощью метода ИК-спектроскопии. ИК-спектроскопия позволяет отличить сульфаты при С4 от положения сульфатов при С2 в остатке моносахарида. Полосы поглощения при 850 и 830 см"1 относят к сульфатам, находящимся в аксиальном и экваториальном положениях, соответственно, что показано для остатков галактозы в каррагинанах.
В ИК-спектрах всех исследуемых фракций фукоиданов (ScF2, SjF2, РеР2 и UpF2) наблюдалась широкая полоса поглощения при 3400 см" , что соответствует области валентных колебаний свободной группы ОН, а также характерное поглощение при 1230-1256 см"1 (S=0 колебания), что свидетельствует о присутствии сульфатов в полисахаридах (рис. АЛ, Приложение А).
Интенсивная полоса поглощения при 851 см"1 (C-0-S деформационные колебания) для фукоидана ScF2 из S. cichorioides показывает, что сульфатные группы в данном полисахариде находятся, в основном, в аксиальном положении при С4, а менее интенсивная полоса при 830 см" указывает также на присутствие сульфатов в экваториальном положении при С2 (рис. АЛ А, Приложение А))
Для фукоидана FeF2 из бурой водоросли F. evanescens, напротив, преобладает полоса поглощения при 823 см 1 (C-0-S деформационные колебания), которая говорит о наличии сульфатных групп в экваториальной позиции, т.е. при С2 фукозы данного полисахарида (рис. АЛ Б, Приложение А).
В ИК-спектре галактофукана SjF2 из S. japonica сульфатные группы находятся преимущественно в экваториальном положении при G2 (полоса поглощения 823 см" ), небольшое количество сульфатов находилось в аксиальном положении при С4 остатков фукозы и/или галактозы (полоса поглощения 836 см" ) (рис. АЛ В, Приложение А))
В ИК-спектре галактофукана UpF2 из U. pinnatifida присутствовали интенсивная полоса поглощения при 829 см" и менее интенсивная полоса при 849 см" , которые указывают на то, что сульфатные группы в полисахариде находятся, в основном, в экваториальном положении при С2 фукозы и/или галактозы, но имеется небольшое количество сульфатов в аксиальном положении при С4 фукозы и/или галактозы (рис. АЛ Г, Приллжение А).
Молекулярная масса фукоиданов из бурых водорослей S. cichorioides (ScF2), F. evanescens (FeF2), S. japnica (SjF2) и U. pinnatifida (UpF2) составила 540, ,30, 310, 760 кДа, соответственно (табл. 3.2, 3.3, 3.4, 3.5). Молекулярная масса фукоиданов, выделенных в настоящем исследовании, превышает молекулярную массу фукоиданов, описанных ранее [16, 20, 40]. Известно, что молекулярная масса фукоиданов может уменьшаться в зависимости от методов выделения и фракционирования полисахаридов. Некоторые из них могут приводить к деполимеризации полисахарида. Так, J.B. Lee и соавторы, используя методы экстракции (НС1l 0,15 N) и анионообменной хроматографии, получили галактофукан из U. pinatifida с молекулярной массой 9 кДа [77]. Неочищенный препарат фукоидана, экстрагированный из целого таллома того же вида бурой водоросли, имел молекулярную массу 710 кДа, а после его фракционирования с помощью ионообменной хроматографии молекулярная масса фракции наиболее сульфатированного полисахарида составила 290 кДа [23]. Согласно литературным данным молекулярная масса фукоиданов из U. pinnatifida находится в интервале от 30 до 1200 кДа [177].
Структурные особенности фукоиданов бурых водорослей были проанализированы методом 13С-ЯМР-спектроскопии. С-ЯМР спектры фукоиданов, подобно спектрам большинства фукоиданов водорослей являются сложными из-за гетерогенности моносахаридного состава, присутствия заместителей и высокой степени сульфатирования, поэтому дают лишь ограниченную информацию о структуре данных полисахаридов. В С-ЯМР спектре фукоидана ScF2 из бурой водоросли S. cichorioides были интерпретированы сигналы углеродных атомов СНз-групп (около 16,3-16,5 м.д.), С1 (99,5-100 м.д.) и интенсивный сигнал С2 (67,7 м.д.) фукопиранозы; область сигналов С2 и С5 остатков фукозы плохо разрешена (рис. Б.1 А, Приложение Б).
Известно, что для интерпретации ЯМР спектров сульфатированных полисахаридов проводят химические модификации. Примерами таких модификаций служат отщепление неуглеводных заместителей и удаление боковых цепей из разветвленных молекул [32]. Для установления структуры фукоидана ScF2 использовали метод сольволитического десульфатирования. К сожалению, этот процесс для фукоиданов часто сопровождается деполимеризацией и, соответственно, значительной потерей исходного материала, выход десульфатированного фукоидана составил 10 % от исходного образца. После сольволитического десульфатирования степень сульфатирования фукоидана ScF2 снизилась на 30 % (десульфатированный фукоидан содержал 9 % сульфатных групп). В 13С-ЯМР спектре десульфатированого фукоидана в области резонанса аномерных атомов углерода присутствовали сигналы с химическими сдвигами 96,6 м.д. (С1), 67,9 м.д. (С2), 76,3 м.д. (СЗ), 69,7 м.д. (С4), 67,8 м.д. (С5) и 16,3 - 16,5 м.д. (С6), которые характерны для 1 3-связанных остатков a-L-фукопиранозы.
