Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы модифицированные олигонуклеотиды находят применение для изучения механизмов действия ферментов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, закономерностей НК-белкового узнавания, для создания новых терапевтических средств. Наряду с такими физико-химическими методами исследования, как рентгеноструктурный анализ, двумерный Я MP и масс-спектрометрня, все более широкое распространение приобретает органохимический подход, связанный с использованием модифицированных олигонуклеотидов для изучения механизмов взаимодействия белков с ДНК. Направленное изменение химической структуры ДНК в белково-нуклеиновых комплексах и изучение свойств сконструированных систем дает возможность получить информацию о пространственном строении таких комплексов и природе ДНК-белковых контактов. Актуальной задачей является создание модифицированных олигонуклеотидов, обладающих полезными свойствами, такими как устойчивость к нуклеазной деградации, повышенная термодинамическая стабильность, способность к проникновению через клеточные мембраны и к ковалентному связыванию с молекулами ДНК и белков.
Одним из перспективных типов производных на основе модифицированных олигонуклеотидов являются ДНК-дуплексы, тяжи которых соединены между собой ковалентными связями. Такие соединения могут найти применение для изучения белков взаимодействующих с НК, например для исследований функционирования ферментов, участвующих в экспрессии генетического материала клетки. Так, если механизм действия фермента связан с расплетанием двойной спирали ДНК, то связи между цепями будут препятствовать такому расплетанию и действие фермента будет затруднено. Дуплексы, стабилизированные поперечными связями, могут послужить ингибиторами НК-узнающих белков, что открывает путь к созданию новых терапевтических средств. Дуплексы с ковалентно связанными цепями способны влиять на трансляцию РНК по триплексному механизму. Они могут быть использованы для выделения НК-связывающих белков методом аффинной хроматографии. Ковалентные связи в заданных участках способны стабилизировать термодинамически невыгодные структуры НК. На сегодняшний день получение ДНК-дуплексов, содержащих поперечные связи между цепями, -активная область исследований, вызывающая повышенный интерес.
Цель работы. Настоящее исследование посвящено разработке нового эффективного метода получения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. Важнейшей частью работы является синтез направленно модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов для последующего получения на их основе ДНК-дуплексов со связями между цепями в заданных положениях двойной спирали. Целью работы стало также изучение физико-химических и субстратных свойств синтезированных соединений.
Научная новизна и практическая ценность работы. Необходимость разработки простых, надежных и эффективных методов синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями не вызывает сомнения. Однако на сегодняшний день получение таких соединений связано с рядом проблем: часто связи между тяжами нестабильны, либо нарушают структуру двойной спирали ДНК. Используемые реагенты обычно обладают высокой химической активностью, но малой селективностью и сиквенс-специфичностью, дают примеси побочных продуктов, способны образовывать внутрицепочечные связи. Существует ряд трудностей и при получении ковалентно замкнутых по концам ДНК-дуплексов (дамблов) - ближайших аналогов дуплексов с ковалентно связанными цепями.
В настоящей работе предлагается новый эффективный метод получения ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями. Особенностью настоящего подхода является такая организация реакционного центра с участием пространственно сближенных цепей ДНК-дуплекса, что получение целевого продукта фактически сводится к реакции образования амидной связи с участием водорастворимого карбодиимида. Связь образуется между алифатической аминогруппой, расположенной в одном из тяжей ДНК-дуплекса, и карбоксильной группой - в другом. Выход ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями достигает 85%.
Применение такого подхода стало возможным благодаря разработанным методикам получения направленно модифицированных по углеводному фрагменту олигонуклеотидов, содержащих первичную алифатическую амино- и карбоксильную группу. Разработанные методики включения модифицированных звеньев в олигонуклеотиды предусматривают возможность их введения в любое заданное положение олигонуклеотидной цепи и встраивания нескольких модифицированных звеньев в один олигонуклеотид при сохранении стандартных процедур автоматического олигонуклеотидного синтеза. Впервые получены
олигонуклеотиды с включениями 9-(Р-0-2'-амино-2'-дезокси-зра6мно-
пентафуранозил)аденина и 2-(2-аминопропионил)аминопропандиола-1,3.
На примере взаимодействия с транскрипционным фактором NF-kB показано, что ДНК-дуплексы с ковалентно связанными цепями способны эффективно связываться с белками, узнающими определенные последовательности ДНК, что в сочетании с их повышенной термодинамической стабильностью и устойчивостью к действию гидролизующих ферментов позволяет рекомендовать данные соединения к использованию в качестве удобных "ловушек" для белков, связывающихся с нуклеиновыми кислотами.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: на Конференции "Терапевтические олигонуклеотиды - от клетки к человеку" (Сейяк, Франция, апрель 1995 г.), на Симпозиуме по химии нуклеиновых кислот (Лейден, Голландия, август 1995 г.), на Конференции аспирантов и студентов "Ломоносов-96", (Москва, май 1996 г.), на Конгрессе по олигонуклеотидной регуляции экспрессии генов (Рим, Италия, июнь 1996 г.), на XII Конференции "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологические применения" (ЛаХойя, Калифорния, США, сентябрь 1996 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного известным методам синтеза ДНК-дуплексов с ковалентно связанными цепями, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка использованной литературы (125 ссылок), содержит 16 рисунков и 4 таблицы.
