Введение к работе
Актуальность проблемы. Химический синтез модифицированных олигонуклеотидов представляет собой наиболее интересную и сложную область исследований в органической химии нуклеиновых кислот. В последние 10-15 лет это направление развивается достаточно быстрыми темпами, в первую очередь, благодаря автоматизации процесса получения олигонуклеотидов и их модифицированных производных. Последние могут использоваться как для решения разнообразных задач молекулярной биологии, так и в качестве потенциальных терапевтических препаратов при лечении различных вирусных и наследственных заболеваний.
Основные усилия исследователей были направлены на решение, по крайней мере, двух ключевых задач. Первой из них можно считать разработку методов, использование которых позволяет трансформировать структуру нуклеиновых кислот с помощью направленных замен мономерных звеньев и их фрагментов различными аналогами либо за счет присоединения к олигонуклеотидам определенных химических группировок и соединений.
Вторая задача имеет непосредственное отношение к изучению взаимосвязи между структурой модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот и их свойствами. В данном случае целями исследований являются синтез олигонуклеотидных производных, обладающих набором определенных химических, физико-химических и биологических свойств, необходимых для успешного использования полученных соединений в молекулярно-биологических исследованиях, выявление взаимосвязи между этими свойствами и строением самих соединений и, наконец, решение обратной задачи: создание необходимых структур с заданными свойствами.
Вопрос о связи между строением вещества и его свойствами и функциями -основная проблема во многих областях науки. Однако в большинстве случаев установить четкие закономерности не удается. На таком общем фоне нуклеиновые кислоты представляют собой один из наиболее ярких примеров того, насколько тесно важнейшие биологические функции связаны со строением молекулы. Именно по этой причине существует абсолютно реальная основа для применения рациональных подходов к структурному моделированию и синтезу модифицированных фрагментов нуклеиновых кислот. При этом обязательным условием является перевод молекулярно-биологических или медицинских терминов на специфический язык органической химии, а именно язык структурных формул, в результате чего становится возможным создание химических соединений,
с помощью которых можно в дальнейшем направленно влиять на те или иные процессы, протекающие в клетке.
Изложенные выше общие соображения должны играть ключевую роль при решении тех конкретных задач, которые ставят перед химиками молекулярные биологи или медики. Так, для использования фрагментов нуклеиновых кислот при изучении закономерностей нуклеиново-белкового узнавания или для успешного применения их в качестве высокоэффективных диагностических и терапевтических препаратов необходимым представляется синтез конъюгатов олигонуклеотидов с другими молекулами, обладающими рядом уникальных свойств. Иными словами, к фрагментам нуклеиновых кислот можно ковалентно присоединять различные реакционноспособные или репортерные группировки, интеркаляторы, биологически активные пептиды и ферменты. В этой связи актуальной задачей становится получение одно- .или двутяжевых молекул ДНК, имеющих в своем составе группировки, реакционная способность которых отличалась бы от реакционной способности функциональных групп немодифицированных ДНК, что позволяет успешно осуществлять синтез различных гибридных молекул.
Целью настоящего исследования являются разработка эффективных методов синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, в которых алифатическая аминогруппа непосредственно либо с помощью линкера присоединена к С2'-атому углеводного фрагмента одного или нескольких нуклеотидных остатков, и изучение химических и физико-химических свойств полученных соединений. Важной частью настоящей работы также является получение олигонуклеотидопептидов на основе модифицированных таким образом олигодезоксирибонуклеотидов.
Основными этапами работы были синтез модифицированных мономерных компонентов такого строения, которое предопределяло возможность их использования в автоматическом синтезе олигонуклеотидов, подбор оптимальных условий для встраивания модифицированных звеньев в олигонуклеотидную цепь, и собственно твердофазный синтез олигонуклеотидопептидов.
Научная новизна и практическая ценность. В представленной работе
предложены новые эффективные методы синтеза ранее неописанных
олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки 9-(2-амино-2-дезокси-
-р-0-арабинофуранозил)аденина, 9-[2-(3-аминопропионил)амино-2-дезокси-
-р-0-арабинофуранозил]аденина и 1 -[2-(3-аминопропионил)амино-2-дезокси--р-0-рибофуранозил]урацила соответственно. Особенностью настоящего подхода можно считать то, что алифатическая аминогруппа находится либо непосредственно
при С2'-атоме углеводного фрагмента модифицированного нуклеозида, либо присоединена к нему с помощью линкера. Следует подчеркнуть, что модификация 2'-положения углеводного остатка представляется оптимальным вариантом, так как в этом случае возможное искажение структуры одно- и двутяжевых фрагментов ДНК будет относительно незначительным. Помимо этого, разработанная методика синтеза модифицированных олигонуклеотидов предусматривает возможность встраивания как одного, так и нескольких модифицированных мономерных звеньев в любое заранее определенное положение олигомерной цепи при сохранении в целом стандартного регламента автоматического олигонуклеотидного синтеза.
В работе продемонстрирована высокая реакционная способность алифатических аминогрупп в составе олигонуклеотидов в реакциях с электрофильными реагентами. Наличие подобного свойства позволило разработать общий метод получения олигонуклеотидопептидов - соединений, которые могут быть использованы в качестве потенциальных терапевтических агентов в антисмысловой биотехнологии. Основная суть данного подхода состоит в том, что реакцию образования амидной связи между заранее синтезированным №-блокированным пептидом с активированной сс-карбоксильной функцией и защищенным олигонуклеотидом, содержащим селективно деблокированную Nhb-rpynny, осуществляют после завершения автоматического олигонуклеотидного синтеза, при этом фрагмент ДНК иммобилизован на нерастворимом полимерном носителе. Проведение конденсации на твердой фазе существенно облегчает процесс выделения целевых олигонуклеотидопептидов. Предложенный подход представляется достаточно гибким, так как позволяет присоединять пептидный фрагмент к любому заранее определенному положению олигонуклеотидной цепи.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты настоящего исследования были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-97" (Москва, апрель 1997 г.) и на IV Международном симпозиуме по олигонуклеотидной химии и биологии (Кембридж, Великобритания, август - сентябрь 1997 г.).
Структура диссертации и объем работы. Диссертация изложена на
